ELISPOT实验方法

★脾细胞保存方法

（一）短期保存技术

适用范围：术后1周PRT反应。

保存方法：将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的RPMI1640培养液稀释重悬。置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。保存1管即可。 （二）长期冷冻保存技术

适用范围：术后2周以后的PRT反应。 保存方法：利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。低速离心后，取沉积细胞用含10％二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内（保存3管），速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤。用两步降温法，即迅速降温至－80℃低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放入液氮中。如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的活力，要求在20s以内完全融化。将冻存管自液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入10倍的培养液中混匀，继而低速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置37℃培养箱内培养。

★相关试剂的配制

（一）PBS：800ml蒸馏水中，溶解8克NaCl、2克KCl、1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl调节PH到7.4，加水定容到1升，高压蒸汽灭菌20分，室温保存。或：8克Nacl、0.2克KCl、1.44克KH2PO4，用HCl调整PH到到7.4，加水定容到1升，高压蒸汽灭菌20分，室温保存。或：在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl调溶液的pH值至7.4加水定容至1L。 （二）PHA：10μg/mL（终浓度）。 （三）丝裂霉素（mitomycin c,MMC）：50μg/mL,for 20 minutes,and then three washes in PBS。 （四）PBLs：300000个细胞加入含10üS的100μlRPMI，终体积200μl。

★ELISPOT操作步骤

（一）ELISPOT试验基本步骤

①将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上,用胶带封板并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗3遍,再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭,室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FC受体以降低非特异性反应。

②将细胞样品,如外周血单核细胞(PBMC),用含10üS的培养基稀释,分装于ELISPOT板孔中,再加入特异的刺激物,阴性对照孔中只加入培养基, 阳性对照孔加入植物血凝素(PHA,10μg/mL),37℃,体积比为5 % CO2培养24h。

③用含体积比0.01%Tween20的PBS洗6次,以弃去细胞,加入生物素化抗细胞因子的检测抗体,孵育3 h。

④再洗6次后,加入AKP或HRP标记的链亲和素,室温孵育2～3h。

⑤用PBSTween20再洗5次,加入BCIP/NBT底物,室温下显色,待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时,即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数,并用斑点形成单位( sfu/ L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原,则可用于ASC测定,这时,每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。

★细胞计数

细胞数就是：四大格总数/4*104/ml，再乘以稀释倍数。

★ELISPOT操作注意事项

1

（一）背景颜色过强可通过下列方法解决①可增加1～2次PBS Tween-20清洗；②显色反应前用PBS洗板，因为Wash Buffer的Tween-20可导致背景过强；③适当延长风干时间；④实验前洗细胞要完全。

（二）实验后，微板要置37度以下，否则会损坏微板。设计好试验,把每个孔要加入的内容做成卡片。

（三）次日，倾倒包被液，用PBS 洗涤3次。最后一次，在灭菌的吸水纸上抠干。 （四）整个实验设置1组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或实验动物）要设1组负对照（不加刺激物），整块板还要加1组背景对照（不含细胞，只加培养基和所有检测试剂），均设复孔。这步加完所有样品之后，放入二氧化碳培养箱，37C培养18-24h，注意：碰撞会引起细胞移位，造成斑点模糊，拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关培养箱的次数。 （五）

★protocol

（一）用coating buffer稀释捕捉抗体，每孔100μl稀释抗体，盖上板盖，4度过夜。

（二）甩干，每孔200μlBlocking Solution洗1次，每孔200μlBlocking Solution，盖板，室温培养2h。

（三）弃去Blocking Solution，用完全1640（RPMI1640、FBS、青霉素和L－谷氨酰胺）稀释丝裂原或抗原，100μl加入每孔。 （四）1×105cells/ml～2×106cells/ml细胞悬液每孔100μl，加盖，5 % CO2湿盒培养（时间2～24h不等）。

（五）吸出细胞悬液，去离子水洗3～5分钟，共2次。每孔200μlWash Buffer I，3次，弃液，加稀释检测抗体（Dilution Buffer），每孔100μl，加盖室温培养2h。 （六）弃去检测抗体，每孔200μlWash Buffer I，3次，每次1～2分钟。 （七）Dilution Buffer稀释酶聚合物（Streptavidin-HRP），每孔100μl稀释酶。加盖，室温培养1h。 （八）弃去酶聚合物，每孔200μlWash Buffer I，4次，每次1～2分钟。每孔200μlWash Buffer II，2次。每孔100μl显色Substrate Solution，观测反应5～60分钟，不要反应显色过度，以免背景色过强。去离子水洗终止显色反应。

（九）室温2h风干或过夜，去除底部塑料托盘将有助于风干，分析前置塑料密闭袋内避光。

2

★相关试剂的配制

（一）Coating Buffer：1×PBS，800ml蒸馏水中，溶解8克NaCl、0.2克KCl、1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl调节PH到7.2，加水定容到1升，高压蒸汽灭菌20分，室温保存。

（二）Blocking Solution：细胞完全培养基（RPMI1640），10％FBS、1％青链酶素和L谷氨酰胺（Gibco-BRL No. 10378-016）。

（三）Wash Buffer I：1×PBS包含0.05% Tween-20（0.5 ml Tween-20 per 1 L PBS）。 （四）Wash Buffer II：1×PBS。

（五）Dilution Buffer：1×PBS包含10％FBS。 （六）Substrate Solution：①AEC（3-氨基-9-乙基咔唑，Sigma A-5754）储存溶液：100mgAEC in 10ml DMF(N,N-二甲基甲酰胺，sigma D-4551),储存在玻璃瓶内; ②0.1M醋酸盐溶液：将0.2M的（冰）醋酸148ml加入352ml0.2M醋酸钠溶液中，加入水调整至1升，PH5.0；③ 333.3 μl of AEC储存溶液加入10ml0.1M醋酸溶液中，0.45 μm filter滤过，加入5μl H2O2（30％），即刻使用。

★试剂保存

（1）如果短时间内不用，溶解的检测抗体应分装和保存于—20℃，在这种条件下，试剂可稳定保存至少一年。

（2）底物缓冲液保存于4℃。

（3）链霉亲和素-碱性磷酸酶保存于4℃。

★要问试剂代理的一些问题

（一）6. Substrate Solution: BD? AEC Substrate Reagent Set (Cat. No. 551951)说明书第7页？ （二）PVDF包被板用100ul 70%乙醇室温下处理10分钟？ （三）

3

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/dkeo.html