重组DNA技术与基因工程(5)

重组DNA技术与基因工程1 2 3 4 5 6 重组DNA技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程

目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母中的表达

5 外源基因在大肠杆菌中的表达A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定

被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物

5 外源基因在大肠杆菌中的表达A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白

细胞周质内含有种类繁多的内毒素

5 外源基因在大肠杆菌中的表达B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理启动子 终止子

核糖体结合位点密码子 质粒拷贝数

启动子 启动子最佳距离的探测A

目的基因 E E

启动子

目的基因 E E

A 酶切开

Bal31酶解

启动子 启动子的筛选采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段

克隆到启动子探针质粒pKO1上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株

终止密码子 Apr galK

pKO1

ori

含有外源启动子活性的重组克隆

启动子 启动子的构建启动子 PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac -35 区序列 T T G A C A T T G A T A T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A -10 区序列 G A T A C T T A T A A T T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T

Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac

启动子 启动子的可控性乳糖启动子Plac的可控性： 野生型的Plac与其控制区 Olac偶联在一起，在没有P O 诱导 基底水平转录 阻遏蛋白

诱导物存在时，操纵子处于基底水平表达；诱

乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷(IPTG)

导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高。P O高效转录

启动子 启动子的可控性乳糖启动子Plac的可控性：野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子( CAP )结合区，小 分子 cAMP 激活 CAP , CAP 结 启动子控制区，进而促进Plac介 Plac O cAMP 高效转录

CAP

葡萄糖代谢

cAMP浓度降低基底水平转录

导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少，也能阻遏Plac介导的基因 转录。因此，基因工程中使用 的乳糖启动子均为抗葡萄糖代

Plac

O高效转录

谢阻遏的突变型，即Plac UV5。

Plac UV5

O

启动子 启动子的可控性色氨酸启动子Ptrp的可控性：色氨酸启动子 Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转

录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 或者加入3-吲哚丙烯酸(IAA), Ptrp 除去色氨酸 Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 (IAA) 高效转录 Ptrp Otrp 高效转录 色氨酸 阻遏蛋白 基底水平转录

便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达。

Ptrp

Otrp

启动子 启动子的可控性l 噬菌体启动子PlL的可控性：噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的 cI 突 Ptrp A 阻遏作用 目的基因 cI857 PL B

变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋白在42℃时失活脱落，PL便介导 色氨酸 表达

目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，

PtrpA

PLB

用色氨酸间接控制目的基因表达

启动子 依赖于噬菌体RNA聚合酶的启动子上述Plac、Ptrp、Ptac、PL启动子均为大肠杆菌RNA聚合酶的特异性

识别和作用元件，而来自大肠杆菌T7噬菌体的T7表达系统则采用噬菌体 DNA 编码的 T7-RNA 聚合酶表达重组大肠杆菌中的外源基因，这种 RNA聚合酶选择性地作用于T7噬菌体DNA的启动子结合，在不降低转 录启动效率的前提下，它沿DNA模板链聚合mRNA的速度比大肠杆菌 的RNA聚合酶快五倍。装有T7启动子的表达载体很多，如pET载体家 族等。大肠杆菌BL21(DE3)和HNS174(DE3)株的基因组中整合 有T7-RNA聚合酶编码基因，其表达则由PlacUV5启动子控制。然而即使 不用IPTG诱导，T7-RNA聚合酶仍能少量表达，出现泄露现象。

终止子 强化转录终止的必要性外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基 因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标

记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率。

终止子 强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终

止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对 于一些终止作用较弱的终止子，通常 可以采用二聚体终止子串联

的特殊结 构，以增强其转录终止作用。 终止子也可以象启动子那样，通 过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基 基因组DNA中克隆筛选。ori 筛选Apr、Tcs的转化子Apr pCP1 Tcr

核糖体结合位点外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之

间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5’ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点( RBS ),大约涉及 30 个碱基的长度。

核糖体结合位点 核糖体结合位点的结构大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’,即 Shine-Dalgarno(SD)序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的 16S rRNA 3’ 端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA

定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始 位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列。

核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列的影响： 一般来说， mRNA 与核糖体的结合程度 越强，翻译的起始效率就越高，而这种保 守 程 度 增 强 5’ – UAAGGAGG – 3’ 5’ – AGGAGG – 3’ 5’ – GAGG – 3’

结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以AGGAGG尤其是GAGG四至六个嘌呤碱 基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四至六个嘌呤碱基中任何一

个换成嘧啶碱基(C或T),均会导致翻译效率大幅度降低。

核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列与起始密码子之间的序列的影响： SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU,翻译效率最高；而CCCC

或GGGG的翻译效率则分别是最高值的 50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶mRNA而

言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU,如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。

核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响SD序列与起始密码子之间的距离的影响：SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了 mRNA在核糖体

上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG

之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。

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