海洋芽孢杆菌的发酵

1海洋生物芽孢杆菌的发酵

摘要

从海洋微生物代谢产物中可筛选出多种具有特殊功能的天然抗菌与抗病毒活性

物质。本课题组从东海海泥中筛选出一株产溶菌酶的菌株S-12-86。本论文对该菌所 产溶菌酶的发酵条件、纯化方法及其生物活性进行研究，结果如下：

采用摇瓶发酵的方式，分别从培养基组分与发酵条件两个方面对海洋芽孢杆菌 S-12-86产酶的影响进行研究。结果表明：菌株S-12-86能够利用麦芽糖、淀粉、甘 油和葡萄糖作为碳源，不能利用蔗糖与甘露醇；能够利用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨和 硫酸铵作为氮源，其中牛肉膏效果最佳，而硝酸钾、氯化铵和尿素几乎不被利用；Zn2+、Mn2+和Cu2+对菌株S-12-86的生长和产酶均有抑制作用，Fe2+对菌体生长无明显影响，但明显抑制菌体产酶，Na+和K+对菌体的生长和产酶无明显影响，Ca2+对菌体生长有促进作用，Mg2+对菌体生长和产酶均有促进作用。该菌种产酶的最佳培养基组分为葡 萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，MgSO45.0 g/L，CaCl22.0 g/L。菌株S-12-86最适发 酵条件：培养温度为30℃、接种量为4.0%(v/v)、装液量为10.0%(v/v)、产酶高峰在 发酵24 h。经测定，产酶量达25636.8 U/mL，比优化前14454.4 U/mL提高了75.4%。 中试发酵产酶量达26697.87 U/mL，说明摇瓶发酵优化条件可以应用于中试生产上。 与白色链霉菌G、灰色链霉菌P-51、枯草芽孢杆菌77等产溶菌酶微生物的产酶条件 相比较，菌株S-12-86具有易培养、产酶量较高、生产成本较低等优点。

将海洋芽孢杆菌S-12-86溶菌酶（marine Bacillus S-12-86 lysozyme，MBL）的发 酵液经过硫酸铵分级沉淀与透析脱盐，Sephadex G-100凝胶柱层析，CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析分步进行纯化。将纯化得到的MBL以Tricine-SDS-PAGE

进行分析，分子量为16.0 kD。酶学性质结果表明，MBL最适作用pH值为8.0，最适作用温度为35℃。Zn2+和Cu2+对MBL具有一定的激活作用，Mn2＋

和Ag+对MBL略有抑制作用，其它金属离子如Ba2+、Li+、Ca2+、Na+、K+和Fe3+等对MBL活性没有显著影响；化学试剂与增稠剂对MBL活性几乎没有影响。阳离子烷基多苷（cationicAlkylpoly glycosides，cAPG）和烷基多苷（Alkyl poly glycosides，APG）对MBL有激活作用，分别提高MBL的活性为15%和21%；十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）对其有抑制作用，降低酶活性约为15%；Tween 20，Tween 80对MBL的影响不 明显。MBL在低温下保存，酶活性较常温保存损失小；MBL的冻干粉在常温保存与 低温保存酶活损失相差不大，说明酶冻干粉比液体酶更适合于保存。

MBL的抑菌谱较为广泛，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等标准菌株均 有抑制作用，主要抑制上述菌对数生长期初期的生长。电镜观察结果表明，经MBL 作用12 h后，大肠埃希氏菌有些菌体细胞质出现不均匀，开始固缩，导致质壁分离， 部分细胞壁缺失，细胞膜破裂，菌体变形，有些细菌细胞质甚至解体出现空腔。金黄 色葡萄球菌细胞质不均匀，固缩较严重，中间有颜色较深成团物质出现，细胞壁变薄， 有些细胞壁模糊不清，还存在质壁分离现象。白色念珠球菌大部分菌的细胞壁出现严 重变形，细胞质出现不均匀，细胞质中的空腔更多。酶对白色念珠球菌的内部结构的 破坏作用随着时间的延长而增强。MBL发挥抑菌作用的浓度范围在0.25 mg/mL~4.0 mg/mL之间，发挥杀菌作用的浓度范围一般在0.25 mg/mL~8.00mg/mL之间。 MBL含量在大于5.0 mg/mL时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠球菌 有明显的抑菌作用。0.5%~1.5%的APG无明显抑菌作用。将MBL与APG复配后， APG能明显地增强酶的抑菌作用。通过定量杀灭细菌试验，测定5.0 mg/mLMBL+1.0 mg/mL APG复配后(Compound Enzyme Prepration，简称CEP)的杀菌率；结果表明， CEP对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠球菌均有较强的杀菌能力。CEP在54℃ 培养箱中放置14 d后，其杀菌率保持不变，说明CEP的杀菌性能的稳定性良好。

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采用细胞病变抑制实验(Cytopathogenic inhibition test)观察MBL在PK15细胞中

对伪狂犬病病毒的抑制作用，研究MBL对伪狂犬病毒的抗病毒作用。结果表明，MBL

的半数中毒浓度（TC50）为100.0μg/mL；抑制伪狂犬病病毒的半数有效浓度（EC50） 为0.46μg/mL、治疗指数（TI）为217；在病毒感染后的0 h、2 h、4 h、6 h和8 h， MBL均有抑制伪狂犬病病毒的作用。结论，MBL在PK-15细胞中对伪狂犬病病毒具 有较好的抑制作用。此外，MBL对新城疫病毒也有较好的体内抑制作用。 关键词：海洋芽孢杆菌S-12-86；抗菌；抗病毒；溶菌酶Studies on fermentation,purification and biology activity

of marine Bacillus S-12-86 lysozyme Abstract

Many antibacterial and antiviral substances possessed special function could be

obtained from marine microorganism.Our research group had gotten marine Bacillus S-12-86 from the sea mud sample collected from the East Sea of China which produced lysozyme.Based on the research,the project studies mainly focused on fermentation, purification and biology activity of marine Bacillus S-12-86 lysozyme(MBL).The results showed as:

The culture medium and fermentation conditions of marine Bacillus S-12-86 were studied.Marine Bacillus S-12-86 could utilize maltose,starch,glycerol and glucose as carbon sources but not mannitol or sucrose;it also could utilize beef extract,yeast extract, tryptone and ammonium sulfate as nitrogen sources,not potassium nitrate,ammonium

chloride,or urea.Beef extract was the best the carbon source.Zn2+,Mn2+and Cu2+inhibited the growth or enzyme production of the strain.Fe2+had no effect on the growthof the strain,but inhibited the enzyme production.Na+and K+had no effect on the growthor enzymeproduction.Ca2+had little effect on the enzyme production but promoted thegrowth of thestrain obviously.Mg2+had good effect on both the strain growth and enzymeproduction.The optimum fermentation conditions for marine Bacillus S-12-86 wereincubation of 24 h,incubation temperature at 30 degrees Celsius,inoculum’s level 4%(v/v),

medium volume 10%(v/v)and initial pH value 8.0.The results showed that the optimum

culture media components were glucose 10.0 g/L，tryptone 5.0g/L，MgSO4 5.0 g/L，CaCl2 2.0 g/L.Comparison of MBL production before optimization(14454.4 U/mL)with that after optimization(25636.8 U/mL),MBL in optimized process increased by about 75.4%. The pilot production experiment indicated that the enzyme production was 26697.87 U/mL. The results indicated that the fermentation conditions selected from flask could be applied

to the pilot production.Comparison of the culture conditions of marine Bacillus S-12-86with those of Streptomyces albus G,Streptomyces griseus P-51,Bacillus subtilis77,et al,

we could find that marine Bacillus S-12-86 was easily cultured with greater enzyme production and lower production cost.We could concluded that marine Bacillus S-12-86 had the potential to be used at large scale in practice.

A novel bacteriolytic enzyme was purified from the crude culture of MBL by ammonium sulfate precipitation,Sephadex G-100 chromatography and CM-Sephadex

A-50 ion-exchange chromatography.The molecular weight was 16.0 kD.The optimal pH and temperature for the Micrococcus lysodeikticus was 8.0 and 35℃，respectively.Zn2+

and Cu2+could stimulate the activity,whereas Mn2＋or Ag+inhibited the lytic activity.Ba2+Li+Ca2+，Na+，K+and Fehad no effect on the enzyme activity.MBL was stablein

3海洋生物芽孢杆菌的发酵

some chemicals and thickening agents.Containing 0.1g/L surfactant,the relative enzyme activity was improved for 15%or 21%by Alkyl poly glycosides(APG)or

cationic Alkyl poly glycosides(cAPG)respectively,decreased 15%by Sodium dodecyl sulfate(SDS),and had no change in Tween 20 or Tween 80 solution.The activity of liquid enzyme had more loss at room temperature than that at low temperature,lyophilized powder of the enzyme at room temperature or low temperature had significant differences at the enzyme activity.Three results showed that lyophilized powder was fitter to be saved than that in liquid for MBL.

MBL had a broad antimicrobial spectrum against standard strains including G+,G- and fungi,et al.MBL influenced bacteria on the logarithmic growth prophase.Observation under the transmission electron microscope revealed that the cytoplasm of E.coli was

concentrated,cell membrane was separated from cell and part of cell wall was disappeared, then the cell was broken down into cavity by MBL for 12 h.While the cytoplasm of S.aureaus was asymmetrical and serious contracted with fuscous conglobation,and the cell wall became thinner,cell membrane was separated from cell wall and part of cell wall was dim.The cell wall of Candida albicans was distortional seriously,and the cytoplasm

was asymmetrical.There were many cavities in the cytoplasm.The breakage effect of

MBL on the inner structure of Candida albicans became stronger as the time running.Thebacteria inhibition concentration was between 0.25 mg/mL~4.00 mg/mL and the bactericidal concentration was between 0.25 mg/mL~8.00 mg/mL.

We studied the anti-microbial activity of MBL and its Combinations with APG.The method was used to test the antibacterial effects of it,APG and those of the compound solution of them respectively.The results showed that the solution with concentration of more than 5.0 mg/mL MBL had effective anti-microbial activity.The solution containing 0.25 mg/mL~1.0 mg/mL APG was almost ineffective on anti-microbial activity.5.0 mg/mL MBL plus with available 1.0 mg/mL APG(Compound Enzyme Prepration,CEP) could kill Escherichia coli,Staphylococcus aureus or Candida albicans.CEP was placed in culture incubator for two weeks at 54℃,and then the rates of killing was no changed. We could conclude that CEP killed bacteria effectually,and the capability of CEP in killing bacteria was stable.

To develop an new anti-PRV medicine from MBL,the anti-PRV effect of MBL in PK-15 cell culture was observed by means of the inhibition of cytopathic effect.The results showed that in PK-15 cell culture,MBL was found to be an inhibitor of PRV in a concentration-dependent manner.The median toxic concentration(TC50)of MBL was 100.0μg/mL,the median effective concentration(EC50)of MBL was 0.46μg/mL,the selectivity index(TI=TC50/EC50)is 217.In time of addition experiment,MBL inhibited the effect of PRV in PK15 cell when it was added at 0 h,2 h,4 h,6 h,and 8 h after virus infection.We could conclude that in PK-15 cell culture,MBL was found to be an inhibitor of PRV;In addition,MBL has good inhibiting effect on NDV in vivo. Keywords:marine Bacillus S-12-86;antibacterial;antiviral;lysozyme

前言

随着抗生素生产的迅速发展和广泛应用，在临床上引起了两个突出问题：一是细 菌的耐药性逐年增加，致使一些抗生素的疗效降低，甚至无效；另一个问题是一些不

4海洋生物芽孢杆菌的发酵

致病的细菌成为条件致病菌，如变性杆菌、绿脓杆菌等，在临床上已造成严重危害。 然而，人们同时又面临着更为严峻的现实是病毒性传染病已跃居传染病之首，病毒性

传染病已严重地威胁着整个人类的健康和生存。因而，筛选新型抗菌与抗病毒活性物 质成为当务之急！

溶菌酶广泛存在于各类生物组织和分泌物中，其中在鸡蛋清中含量最为丰富，含 量的占蛋清总量的3.4%-3.5%。溶菌酶是一种生物催化剂，具有多种用途，在食品 工业上，用做食品防腐剂，是婴儿生长发育必不可少的抗菌蛋白，作为双歧杆菌的增 殖因子，直接或间接促进婴儿肠道双歧乳杆菌的增殖，促进婴儿胃肠道内乳酪蛋白形 成微细凝乳，有利于婴儿消化吸收。在医药临床上的应用：溶菌酶能参与人体的多糖 代谢，加速粘膜组织的修复；它能分解粘厚蛋白，降低脓液或痰液的粘度使之变稀而 排出；它能与血液中的抗凝因子结合，具有止血作用，还能提高抗菌素和其它药物的 医疗效果。在生物工程上的应用：溶菌酶具有破坏细胞壁结构的作用，用它溶解菌体 或细胞壁可获得细胞内容物或原生质体等，也可用于细胞融合或原生质体转化以达到 生物育种的目的。

溶菌酶又是生物体内一种重要的免疫因子，无毒、无污染又具有一些明显的杀菌、 抗病毒、抗肿瘤细胞等功效，因而有着非常重要的应用价值。初步估算，目前世界每 年溶菌酶总产量为300吨，需求量却为1000吨，现行的产量远不能满足市场的需要。 目前，我国溶菌酶的年需求量150吨，现在国内供货量仅约30吨，所以市场容量很 大。市场价格与溶菌酶含量有很大关系，含量越高，价格也越高。根据掌握的资料， 美国Sigma公司的溶菌酶结晶，42000单位/毫克，价格为每公斤6000美元。丹麦sanovo 公司的溶菌酶结晶，25000单位/毫克，价格为每公斤1500美元。由此可见，溶菌酶 开发研究具有着重要的应用价值和商业价值。我国尚缺乏生产溶菌酶的规模化企业， 溶菌酶年产量不过几十吨。溶菌酶的高端产品主要被加拿大、美国、日本等国的大公 司所垄断，我国的溶菌酶产品只能作为低端的粗品原料出口，当需要高端产品时还需要依赖于高价从国外进口，这些事实严重阻碍了我国溶菌酶产业的发展。随着人们

生活水平的不断提高，对蛋类食品的需求量越来越大，用于提取溶菌酶的原材料（鸡 蛋）也显得捉襟见肘。另外，蛋清溶菌酶仅能选择性地分解革兰氏阳性菌的细胞壁， 非广谱类抗菌物质，只有与其它物质复配后才具有杀灭革兰氏阴性菌的作用，实际应 用存在有一定的局限性。因而，寻找开发新型来源、作用范围更广的溶菌酶成为当前 研究的热点之一。从微生物群中直接筛选出能产溶菌酶的菌株的研究逐渐兴起。然而， 随着陆栖微生物在抗生素、酶、酶抑制剂等生物活性物质的大量开发和应用，寻找新 种属的微生物或特殊性状的微生物来开发新型微生物天然活性物质的难度越来越大， 于是人们开始把目光越来越多地投向海洋微生物，试图从海洋微生物的代谢产物中发 现和寻找性质稳定，功能特殊的目的产物。由于海洋特殊的低温环境，海洋微生物所 产生的生物酶，与相应的陆生动、植物所产生的酶相比在低温条件下有相对高的活力， 其主要特征是具有较低的活化能。因而，来源于海洋微生物的酶类物质在工业应用和 基础研究诸多方面有着独特的应用前景。

在此背景下，本课题组已获得一株产溶菌酶的海洋芽孢杆菌S-12-86，并展开了

该菌所产溶菌酶的研究，该溶菌酶具有嗜低温，抗氧化及溶菌谱广等特点，对革兰氏 阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌均有抑菌作用，有望应用于医药，食品工业及生物高 新技术等领域。在此基础上，本论文对海洋芽孢杆菌S-12-86溶菌酶的发酵、纯化和 生物活性进行较为系统地研究。论文第一章以研究历史为轴简述了溶菌酶的发展过 程，以分类法综述了海洋微生物抗菌抗病毒活性物质的研究现状；第二章为海洋芽孢 杆菌S-12-86溶菌酶的发酵条件的优化；第三章为海洋芽孢杆菌S-12-86溶菌酶的纯

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化与酶学性质的研究；第四章探讨了海洋芽孢杆菌S-12-86溶菌酶的抑菌作用；第五 章对海洋芽孢杆菌S-12-86溶菌酶的体外与体内抗病毒作用进行了初步研究。

MBL发酵条件的优化

溶菌酶(Lysozyme)，又称细胞壁水解酶，能专一性地作用于细菌细胞壁肽聚

子，能使N-乙酰胞壁酸与乙酰葡萄糖氨之间的β-1.4糖苷键断裂，使细菌细胞壁变 松驰而达到溶解细菌的效果。溶菌酶广泛分布于高等动植物组织及其分泌物、原 物、昆虫、植物以及各种微生物中[1]。溶菌酶可以在很多领域中得到应用，如在 治疗中，溶菌酶能参与人体的多糖代谢，加速粘膜组织的修复，并具有抗感染与 毒的作用，能与血液中的抗凝因子结合，具有止血作用；还能提高抗菌素和其它 的医疗效果[207]；在食品工业上，溶菌酶常用于食品的保鲜防腐[208]；在畜禽养殖 常与抗生素联合使用，能促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用[209,210]；在生 程方面，常用于原生质体选育优良菌种、分子遗传研究等[211]。

目前，市场上见到最多的溶菌酶是蛋清溶菌酶。随着人们生活水平的提高， 菌酶的需求量越来越大，单靠从鸡蛋清中提取溶菌酶，很难解决市场供需矛盾[2 然而，利用微生物生产溶菌酶，成本较低，节省材料，对环境污染较小，容易实 模化生产，因而开发潜力巨大。另外，由于微生物来源的溶菌酶有明显的溶菌特异 根据其底物的不同来研究微生物细胞壁结构，溶菌酶又是一种非常有用的生物工 [1]

。多数微生物溶菌酶对金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌和真菌有溶解作用，而 清溶菌酶对以上菌株无明显溶菌作用[212,94]，近年来，国内外对多种微生物来源 菌酶进行了广泛而深入地研究。本课题组从东海海域底泥中筛选得到一株能够产 酶的菌株（编号为S-12-86）。该菌株细胞呈杆状，两端钝圆，大小为(0.6-0.8)

μm×(2.0-5.0)μm，以周生鞭毛运动，无荚膜，该菌株革兰氏染色幼龄为阳性，老 变，偶尔能观察到椭圆形的芽孢，芽孢囊无明显膨大严格好氧。通过对菌株S-1 形态学特征、培养特征、生理生化特征以及16S rDNA序列进行的多相分类研究 现该菌株具有典型的短芽孢杆菌属的形态学特征，16S rDNA序列与短芽孢杆菌 部分菌株序列同源性达93%-98%

[213]

。该菌所产生的溶菌酶在低温下具有较高活

对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌等均有抑制作用[214]。

本文拟采用摇瓶发酵优化的方法，初步摸清MBL产生菌的最适培养条件，然

通过中试生产验证摇瓶优化条件，为MBL规模化生产提供依据；并将该菌产酶条与其它来源溶菌酶产生菌的产酶条件进行比较，分析其放大生产的可行性。

与其它来源溶菌酶产生菌的产酶条件进行比较，分析其放大生产的可行性。 1材料与方法

1.1菌种

MBL产生菌株S-12-86由本实验室分离保存，溶壁微球菌（购自Sigma公司）。

1.2培养基

种子培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸出粉3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L，pH 7.0；斜

面培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸出粉3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH

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7.0。

1.3主要试剂和仪器

试验用牛肉膏、蛋白胨、琼脂、无机盐类与其它生化试剂均为国产分析纯；实验 用仪器包括722型光栅分光光度计，HTACHI20PR-52D高速冷冻离心机，

SC5-24SHAKER恒温培养摇床，SW-GJ-IB标准超净工作台，LKB型恒温水浴等。 1.4 MBL发酵培养条件

从斜面挑取2环产酶菌到盛有3 mL种子培养基的试管中，30℃，摇床转速为250 r/min恒温振荡培养18 h，然后按照一定的接种量转入摇瓶中30℃，250 r/min培养 24 h（除特别注明外）。 1.5 MBL活性的测定方法

采用打孔法测定，即在冷凝琼脂平板上（内径为90.0 mm的平板内盛有20.0 mL 含有0.01%溶壁微球菌），用内径为7.0 mm的打空器打孔，每孔加入待测样品20.0μL， 30℃保温培养24 h，观察并记录溶菌圈的直径，并通过标准溶菌酶样品的标准曲线， 再换算出待测样品的活力单位（U/mL） [215]。

1.6菌株S-12-86产溶菌酶条件的筛选

1.6.1碳源筛选

分别用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、甘油及甘露醇作为碳源物质，按照浓度为 20.0 g/L的添加量配制培养基，设不添加碳源物质为对照，进行摇瓶发酵，30℃，250 r/min，发酵培养24 h后，取样测定酶活力（U/mL）。 1.6.2氮源筛选

分别用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、氯化铵和尿素作为氮源物质， 添加量为10.0 g/L进行摇瓶发酵，设不添加氮源物质为对照组，30℃，250 r/min，发 酵培养24 h后，取样测定酶活力（U/mL）。 1.6.3金属离子筛选

参照文献[216]，在培养基中，分别加入浓度为0.001 mol/L的NaCl、KCl、CaCl2、 MgSO4、FeSO4、ZnCl2及CuSO4，设不添加离子为对照，30℃，250 r/min，发酵培 养24 h后，取样测定酶活力（U/mL）。 1.6.4最适起始pH值筛选

将培养基的起始pH值调至5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0，接种菌体，30℃，250 r/min，培养24 h后，测定酶活力（U/mL）； 1.6.5最适接种量筛选

7海洋生物芽孢杆菌的发酵

在含25 mL液体培养基的三角瓶中分别按1.0%（v/v）、2.0%（v/v）、4.0%（v/v）、 6.0%（v/v）、8.0%（v/v）、10.0%（v/v）和12.0%（v/v）的接种量接入菌体种子，30 ℃，250 r/min，培养24 h，测定酶活力（U/mL）；

1.6.6最适装液量筛选

在250 mL三角瓶中分别加入10 mL（4.0%，v/v）、15 mL（8.0%，v/v）、25 mL （10.0%，v/v）、35 mL（14.0%，v/v）、45mL（18.0%，v/v）、55 mL（22.0%，v/v）、35 65 mL（26.0%，v/v）培养基，接种后，30℃，250 r/min，发酵培养24 h后，取样测 定酶活力（U/mL）。

1.6.7最适培养温度筛选

分别在20℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃温度下，接种后，250 r/min， 发酵培养24 h后，取样测定酶活力（U/mL）。 以上每组实验重复三次，依次从每一组实验中筛选出最适条件。

1.6.8生长曲线与产酶曲线的测定

将菌株S-12-86培养50 h，每隔3 h取菌液，按照一定的稀释倍数，测定其在

OD550 nm处的光吸收值（反映菌体数量）与酶活力。以横坐标为培养时间，纵坐标 为酶活力，次纵坐标为菌体在OD550 nm处吸光值，绘制菌体的生长曲线与产酶曲线。

1.6.9数据处理

实验数据用平均值±标准差（±SD）表示，使用Excel中的t检验分析数据差 异显著性。

1.7菌株S-12-86与其他产溶菌酶微生物产酶条件的比较

将菌株S-12-86与文献[1]中已报道的产溶菌酶微生物（如白色链霉菌G、灰色链 霉菌P-51、枯草芽孢杆菌77等）的产酶条件进行比较。

1.8中试发酵

将摇瓶发酵优化条件，应用于中试生产上。中试种子罐总体积100 L，发酵液位 40 L，发酵罐总体积为1000 L，发酵液体积为400 L，通气量为1：0.3，发酵培养12 h后将通气量调至1：0.6，搅拌轴转速为75转/分钟。36

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2结果与分析

2.1碳源对产酶的影响

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