高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选

转载自别人的论文,希望对大家的学习作以借鉴

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2009,37(12):5362-5363,5371　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　张杨林　责任校对　

傅真治

高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选

唐丽江,王振华,王迪　(成都农业科技职业学院畜牧兽医分院,四川温江611130)

摘要　[目的]筛选高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株。[方法]选用10株芽孢杆菌,采用染色法初选和3,5-二硝基水杨酸显色法复选对其产淀粉酶的能力进行测定,筛选高产淀粉酶的芽孢杆菌菌株。[结果]10株芽孢杆菌菌株中有9株具有产淀粉酶能力,其中编号为Pab03、Pab02的2株枯草芽孢杆菌产酶活性最高,染色圈直径/菌落直径分别为2.284、1.961;在未作发酵条件优化的前提下,其酶活力分别达到(31.331±(21.521±0.985)、1.390)U,在作为新型的消化酶饲料添加剂方面具有广阔的应用前景。而菌株凝结芽孢杆菌PSAF1和枯草芽

(0.704±孢杆菌PJK01所产淀粉酶活力最低,分别为(0.366±0.022)、0.089)U。[结论]成功筛选了2株高产淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株,

分别为Pab03和Pab02。关键词　淀粉酶;芽孢杆菌;酶活力;筛选中图分类号　S182　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)12-05362-02ResearchontheScreeningofBacillusStrainProducingHigh2yieldingAmylaseTANGLi2jiangetal　(BranchofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,ChengduVocationalCollegeofSandTechnology,Wenjiang,Sichuan611130)Abstract　[Objective]TheresearchonthescreeningofBacillusstrainwiththeabilityinyieldingod]Thecapacityof10Bacillusstrainsproducingamylasewasprimarilytestedwiththestainingmethodethodof3,52dinitro2salicylicacidforthescreeningoftheBacillusstrainwiththeabilityinhigh2yielding[9hadthecapacityofamylaseproduction,amongwhich,twoBacillussubtilisstrains:Pab03andPab02andetersofthechromatincircleofcolonywere2.284and1.961,respectively.Underthepremiseofnotheenzymeactivitieswere(31.331±0.985)and(21.521±1.390),respectively.Asnewtypeofenzymes,hadwintheapplicationoffeedadditives.ThestraincoagulansBacillusPSAF1andBacillussubtilisPJK01ability2,whichwas(0.366±0.022)and(0.704±0.089),respectively.[Conclusion]TwoBacillussubtiliswinhigh2yieldingamylase2producingweresuccessfullyscreenedout.Keywords　Amylase;;activity　　,是用于酿酒、食品、医药、纺织、目前,在饲料行业由于芽孢杆菌对动物独特的生物学效应,对于高产淀粉酶的芽胞杆菌在动物饲料上应用的研究取得一定进展。配合饲料中含有淀粉、蛋白质、脂肪、纤维素、半纤维素、果胶等多种营养成分,这些营养成分都是由生物多聚物组成,必须依靠水解酶类将其酶解,才能被动物肠道吸收。在饲料中起作用的淀粉酶主要是α2淀粉酶和糖化酶(葡萄糖淀粉酶),α2淀粉酶是将大分子淀粉水解成中等和低分子物质,产生大量新的非还原性末端,有利于糖化酶进一步水解,糖化酶则将α2淀粉酶水解出的一些中、低分子产物,从非还原性末端开始,逐次切下一个个能被动物直接吸收利用的葡萄糖。以芽孢杆菌作为饲料添加剂,一方面芽孢杆菌产生淀粉酶促进饲料中含淀粉营养成分的降解,充分被动物吸收利用;另一方面芽孢杆菌进入消化道能提高内源酶的活性。尤其在动物开始断奶时,因其体内淀粉酶等含量低,不能满足生长发育的需求,若不及时补充淀粉酶等,则会造成消化不良,影响生长发育。所以高产淀粉酶芽孢杆菌的选育已成为饲料行业的一个新突破点。

1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　选育菌种。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)6株,菌种

所有菌种均由四川农业大学生物医学工程实验室保存。

1.1.2　培养基。淀粉培养基:可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、

葡萄糖0.5%、NaCl0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%;种子培养基:牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl0.5%、可溶性淀粉

0.5%,pH值7.0;发酵培养基:玉米粉2%、黄豆饼粉1.5%、CaCl20.02%、MgSO40.02%、NaCl0.25%、K柠檬2HPO40.2%、

酸钠0.2%、硫酸氨0.075%(溶解后加)、Na2HPO40.2%,pH值7.0。

1.1.3　主要试剂和溶液的配制。①0.1%葡萄糖溶液。称取80℃烘干至恒重的无水葡萄糖0.1g,用去离子水溶解,定容

至100ml。②0.1%标准麦芽糖溶液。称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100ml。③1%3,52二硝基水杨酸试剂。称取1g3,52二硝基水杨酸,溶于20ml浓度2mol/L氢氧化钠溶液中,加入50ml蒸馏水,再加入30g四水酒石酸钾钠

(C4H4KNaO6 4H2O),待溶解后用蒸馏水定容至100ml,盖紧

瓶塞,勿使CO2进入。④2%淀粉溶液。称取2g淀粉溶于

100ml浓度0.1mol/mlpH值5.6柠檬酸缓冲液中。1.2　方法

1.2.1　芽孢杆菌淀粉酶活性测定。

1.2.1.1　初选[1-2]。将芽孢杆菌菌种活化,接种在营养肉汤

培养剂中,37℃培养12h,芽孢杆菌液用滴种法接种在淀粉培养基平皿上培养2～4d,采用革兰氏碘液染色,在菌落周围有透明圈产生证明芽孢杆菌产淀粉酶。用游标卡尺分别测量透明圈直径和菌落直径,根据两者比值大小初步确定纤维素酶活性的高低。

1.2.1.2　复选。采用3,52二硝基水杨酸显色法[3-5]。

(1)标准曲线的制作(表1)。①取19支20ml具塞刻度

编号分别为PKC01、PJK01、Pab01、Pab02、Pab03、Pab04;地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)1株,菌种编号为PSA06;蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)2株,菌种编号分别为PSA38、PDM423;凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)1株,菌种编号为PSAF1。

作者简介　唐丽江(1978-),女,四川成都人,硕士讲师,从事动物传

染病学和微生态制剂的开发与应用研究。

收稿日期　2009201220

试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表3加入试剂(每个浓度做3个平行)。②摇匀,至沸水浴中煮沸5min。取出后流水

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37卷12期　　　　　　　　　　　　　　　　唐丽江等　高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选5363

冷却,加蒸馏水定容至20ml,以1号管作为空白调零点,在

520nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值

孢杆菌菌落周围均具有透明圈(图1),说明有分泌淀粉酶的特性,分别测量9株芽孢杆菌的染色圈直径/菌落直径比值,结果见表2。其中菌株编号为Pab03、Pab02的比值较大,分别为2.284、1.961。虽然透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低,但不能完全代表菌株产酶能力,其原因是多方面的,固体和液体培养基条件不同;不同菌株具有不同的生长和产酶速度及不同的淀粉酶酶系;菌苔大小及在平板上堆积情况的差异等都会造成透明圈大小不同,所以液体发酵复选必不可少。

表2　淀粉分解菌酶活力初选结果

Table2　Theprimaryscreeningresultsaboutenzymeactivityofamylaceous

Bacillusspp.

求麦芽糖含量的回归方程。

表1　淀粉酶标准曲线的制作

Table1　Drawingstandardcurveofamylase

试管号

Tubenumber123456标准麦芽

蒸馏水∥ml

糖溶液∥ml

Maltosestandardsolution

Distilledwater

麦芽糖含量∥mg

Maltosecontent0.20.61.01.41.83,52二硝基水杨酸∥ml3,52dinitrosali2cylicacid

2.02.02.02.02.0

2.0　　　0

0.2

0.61.01.41.8　　2.0　　　0

1.8

1.41.00.60.2菌株

Strains

菌落直径∥cm染色圈直径∥染色圈直径/菌落直径

Colony1.±0.1.±0.0331.0.±0.0171.571±0.0191.447±0.0721.651±0.0151.004±0.0461.938±0.097

S2.042054±0.0152.101±0.0482.364±0.0462.135±0.0512.175±0.0521.245±0.0262.295±0.113

Stainingcyclediame22.284

1.9611.7101.5791.5051.4751.3171.2401.184

(2)粗酶液淀粉酶活力测定。①待测粗酶液的制备。将活化的芽孢杆菌菌液接种于种子培养基Ⅲ中,35℃,培养12

h,然后以5%的接种量接种于发酵培养基Ⅲ中摇床培养,160r/min,37℃培养48h。发酵24hPab02PDM423PSAF1PJK01PSA38

过程中碳酸钙的含量保持在0.02%000r/20min),取20ml,取粗酶液

1ml→2%1ml3ml,于60℃水浴中预

热5min→加浓度mL柠檬酸缓冲液(pH值6.0)1ml,于

60℃水浴中保温30min→加入1.5ml3,52二硝基水杨酸,沸

2.2　3,52二硝基水杨酸显色法测酶活力结果　将初筛有染

水中5min,迅速冷却,加蒸馏水定容至20ml。③空白对照加发酵液后加pH值为3.6以下的酸钝化α2淀粉酶,使酶失活,其余步骤同上。④定容后,摇匀,用分光光度计测定

OD520nm值。

色圈的9株芽孢杆菌作发酵培养试验,经3,52二硝基水杨酸显色法对发酵培养粗酶液淀粉酶活力进行精确测定,结果表明,菌株PSAF1、PKC01、PJK01、Pab01、Pab02、Pab03、Pab04、

PDM423、PSA38所对应的淀粉酶活力分别为(0.366±0.022)、(4.271±(0.704±(17.269±(21.521±0.028)、0.089)、2.731)、(31.331±(4.744±(1.920±1.390)、0.985)、0.065)、0.043)、(1.520±0.089)U。其中酶活力最高的为编号Pab03、Pab02的

在上述条件下以单位体积样品在30min释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活性。

1.2.2　发酵条件的初步优化。从发酵培养基初始pH值、发

酵温度、发酵时间方面对上述筛选到的产酶活力最高菌株进行优化,以提高目的菌的产酶活力。酶活测定方法同3,52二硝基水杨酸显色法。

菌株,这与初选结果一致。菌株的酶活力与国内众多学者测定的范围基本一致。不同芽孢杆菌菌株在不同发酵条件下测定的纤维素酶活力之间存在着很大的差异,其原因是酶的合成受很多因素的影响:首先酶合成受菌体生长速率影响较大,其次酶合成还与诱导物的诱导作用及能量代谢有关。

3　结论与讨论

国内学者对产生淀粉酶的芽孢杆菌的筛选、芽孢杆菌淀粉酶的性质、基因序列分析等也作了大量的研究。张丽苹等

从土壤中筛选出一株能产2种α2淀粉酶的脂肪芽孢杆菌,测定其发酵液酶活为70U/ml[1]。卢涛等分离到一株产α2淀粉酶的凝结芽孢杆菌,经过诱变筛选后发酵液酶活达100

U/ml[6]。柏建玲等对益生素“益畜宝”的有效成分地衣芽孢

杆菌的产酶特性进行了初步定性研究,该芽孢杆菌具有很高的淀粉酶活性[7]。该试验对10株益生菌产淀粉酶的活力进行了筛选,其中9株菌具有分泌淀粉酶的能力,编号为

图1　出现透明圈的芽孢杆菌菌落

Fig.1　Bacillusspp.colonyofappearingtransparentcircle

Pab03、Pab02的2株枯草芽孢杆菌产酶活性最高,在未作发酵

2　结果与分析

2.1　染色法初选结果　革兰氏碘液染色法初选,

有9株芽

条件优化的前提下,酶活力分别达31.331、21.521U,在作为新型消化酶饲料添加剂方面具有广阔的应用前景。

(下转第5371页)

转载自别人的论文,希望对大家的学习作以借鉴

37卷12期　　　　　　　　　　　　　　　　汪承刚等　甘蓝亲本防退化技术研究5371

2.4　生根培养效果　将幼苗转入生根培养基上1周后即可的种子产量高于常规繁殖植株的产量,9701-2和HT502亲本组培繁育的种子产量分别比常规繁殖高16.8%和39.1%,提高了原种繁殖系数,保持原原种种性,为扩大杂交一代种子生产供应奠定基础。

表1　不同繁育方式亲本种子产量的比较

Table1　Comparisonsofparentsseedyieldwithdifferentbreedingmethods

有根生成,15d左右即可长成完整根系。根数一般在3～8根,根长1～4cm,根系健壮。

2.5　炼苗移栽效果　移栽1周内应适当遮阴,避免日光直

射。幼苗上部应用薄膜覆盖以保持湿度,空气相对湿度保持在90%以上,10d后可逐渐揭去薄膜,增加光照和通风。“春魁”亲本组培苗成活率较高,可达95%以上。

2.6　玻璃苗现象　对原原种亲本组培过程中出现了玻璃化

亲本

繁育方式平均产籽量平均产量

现象,具体表现为植株矮小肿胀,叶片水渍化半透明,皱缩卷曲,脆弱易碎。为了控制玻璃苗情况,进行了以下处理:在培养基配方上将琼脂浓度由6.2g/L增加到6.5g/L;改善通气状况,改用瓶盖带有透气片的半透明耐高温PP塑料三角瓶代替前期使用的封闭式广口瓶;降低培养室温度,将培养室温度由25℃调低为22℃。通过以上几个方面的改进,甘蓝组培玻璃苗现象得到有效控制。

2.7　亲本产量　由表1可见,2个亲本利用组培繁殖植株

12Feb组培繁育Tissueculturebreeding412218.8HT502

常规繁育(CK)Commonbreeding

组培繁育Tissueculturebreeding常规繁育(CK)Commonbreeding

375423591761

16.112.69.0

2.8　亲本种子发芽　由表2可见,重、发芽势、发芽率高于对照,,分别高出20.78.3表2　Table2　Comparisonsof10002grainweightofwithdifferentbreedingmethods

亲本

Parents970122HT502

繁育方式

g10002value

4.564.315.345.11

+5.8-+4.5-

Comparingwith

发芽势∥%Germinationrate

比对照

数值∥g

Numbervalue

89.082.091.084.0

+20.7-+8.3-

发芽率∥%Germinationrate

比对照数值∥g

98.896.597.994.2

Comparingwith

+2.4-+3.9-

Comparingwith

常规繁育()Conbreeding组培繁育Tissueculturebreeding常规繁育(CK)Commonbreeding

2.9　亲本种苗生长　从表3可以看出,组培苗生长势较强,型、有效分支多;常规繁殖的长势弱、枝条丛生、无效分支多。

株高、分支及花期均较对照有所增加。组培苗植株呈宝塔

表3　不同繁育方式亲本种苗生长比较

Table3　Comparisonsofparentsseedgrowthwithdifferentbreedingmethods

亲本

970122HT502

繁育方式始花期终花期花期∥d

29

222516

株高∥cm

119.5

106.899.790.0

茎粗∥cm一级分支∥个

10.9

9.39.68.8

18.515.621.219.0

二级分支∥个

32.6

27.349.445.0

组培繁育Tissueculturebreeding0420705206

常规繁育(CK)Commonbreeding组培繁育Tissueculturebreeding常规繁育(CK)Commonbreeding

042100420104203

052020422604219

3　结论与讨论退化问题,采取文中办法,可以在较长时间让种子处于同一世代。参考文献

[1]王小佳.蔬菜育种学(各论)[M].北京:中国农业出版社,2000.

[2]陈佩度.作物育种生物技术[M].北京:中国农业出版社,2001.

[4]张应玖,朱子军,关键.一种新型淀粉酶的鉴定及其产酶菌株的筛选

[J].微生物学通报,2002,29(5):38-41.

[5]ABDULLAHAM,RENCHFD.SubstratespecificityofPullulanase[J].Arch

BiochemBiophys,1970,137:483-493.[6]卢涛,舒丹,张杰,等.高温α2淀粉酶产生菌株的选育[J].四川大学学

报:自然科学版,2002,39(6):1131-1133.

[7]柏建玲,莫树平,郑婉玲,等.地衣芽孢杆菌与其他微生物产酶能力的

比较[J].饲料研究,2003(7):4-6.

试验表明,采用茎尖组培快繁技术繁殖甘蓝原种,大大地减少甘蓝原原种用量,减少原种繁殖代数,提高了繁殖系数和种子发芽率,有效地解决了甘蓝亲本长期自交造成种性

(上接第5363页)

参考文献

[1]张丽苹,徐岩.酸性α2淀粉酶生产菌株的选育的初步研究[J].工业微

生物,2002,32(4):12-14.[2]卢涛,舒丹,张杰,等.高温α2淀粉酶产生菌株的选育[J].四川大学学

报:自然科学版,2002,39(6):1131-1133.

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版社,1982.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/dib4.html