脂肪酶催化合成生物柴油的瓶颈问题及其对策

中国生物工程杂志　ChinaBiotechnology,2008,28(2):117～123

脂肪酶催化合成生物柴油的瓶颈问题及其对策

吴义真　邹有土　林　琳33(福建师范大学生命科学学院　福州　350108)

3

摘要　生物柴油,一种新型的清洁能源燃料,具有可再生、可生物降解、环境友好等优良的品性,可部分或全部替代石化柴油。碱催化法、脂肪酶催化法及超临界法是合成生物柴油的主要工艺,其中脂肪酶催化法是一种节能型、环保型工艺,在节能和环保方面,有着碱催化法无可比拟的优越性,具有良好的工业应用前景。但目前在实现产业化的进程中仍存在如酶成本高、稳定性较差、甲醇对酶的失活效应及反应时间长等瓶颈问题。通过固定化技术和全细胞催化剂的采用、甲醇流加方式的改进、溶剂工程的改善及酰基受体和耐醇酶的开发等技术手段,结合固定床生物反应器,较好地解决了这些瓶颈问题,从而推进了酶催化法合成生物柴油的工业化进程。主要对酶法合成生物柴油工艺存在的主要问题及相应对策研究进展进行概括介绍,并对其工业化发展前景进行讨论。

关键词　生物柴油　脂肪酶　酶催化法　瓶颈

中图分类号　Q819

美国能源署对1995～2005年期间能源生产消耗的官方统计数据显示:沙特阿拉伯、俄国和美国2005年的石油产量占世界石油总产量的33.6%,美国的石油消费量占了总消费量的25%,中国和日本的石油消费量位居二、三位。同时,由能源消耗而释放的CO2增加了28.2%,平均年增长率为2.5%。美、中、日是化石燃料消费中最大的CO2排放国,占世界总排量的55%。这些数据透视出能源开采、消费及CO2等有害气体的排放都是与日俱增的。然而,传统能源的不可再生决定了其日益枯竭的趋势。日益严峻的能源危机及环境污染激起人们的能源忧患意识,也增强了污染物零排放观念,促进了废油脂及工业下脚料的回收利用,推动了清洁新型能源的开发利用

[1,2]

部分替代石化柴油

[3]

。因此各国纷纷投入到生物柴油

的研发中,其中欧洲部分国家、美国及日本起步早且又有政策扶持,故研发进度较快,基于生物柴油的潜能及

1992年的能源政策,EIA预计到2020年,生物柴油需

求量将达到6300万加仑;而我国尚处于刚起步阶段

[4]

。目前,我国生物柴油产业在国家政策支持下也

得到了积极的推进,计划在2020年达年产1200万吨。　　生物柴油各生产工艺中,化学碱催化法已实现工业化,而超临界流体工艺及脂肪酶法催化工艺仍处于实验室研发阶段

[5]

。碱催化法工艺具有催化剂相对廉

[3]

价易得、反应时间短,转化率较高的优点一系列固有的缺陷

[2]

,但仍存在

。液体生物质燃料如

:(1)对原料品质要求较高,原料

燃料乙醇和生物柴油具有极大的应用前景和发展空间。生物柴油(即脂肪酸甲酯)不仅具有跟石化柴油相似的燃烧特性,还具有环境友好、较高安全性、良好润滑性及可再生可生物降解等优良特性,有希望全部或

收稿日期:2007211222　　修回日期:2007212220

3国家自然科学基金(30270033),福建省自然科学基金(B0120001,C0410009),福建省科技平台建设项目(2006H0085),资助项目

33通讯作者,电子信箱:benbo_00@yahoo.com

的酸价须小于1、水含量须小于0.5%,即对废油脂、工业下脚料回收利用率低;(2)工艺复杂,能耗高;(3)醇用量大且不易回收利用;(4)副产物甘油难回收利用,催化剂难与产物分离,从而增大了后续处理的成本,重要的是有废碱液排放,形成新的环境污染源。而脂肪酶催化法对原料的选择性低,可利用酸值较高的废油及工业下脚料,且反应条件温和,能耗低;醇用量小,产物及副产物较易分离且无污染排放,克服了碱催化法的严重缺陷,是一种更理想的节能、环保型工艺

[6,7]

。

118

中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.22008

目前,酶催化法制备生物柴油工艺实现产业化面临的最大瓶颈就是脂肪酶制品成本较高、稳定性相对较差及反应时间长

[8]

用,同时通过甲醇流加方式、酰基受体、耐醇酶的开发等手段改善酶的催化活力和稳定性,从而降低整个生产工艺成本,加快工业化进程。

2.1　酶制品高成本低回用率问题2.1.1　应用固定化酶提高酶稳定性及回用率　酶法

。这些缺陷造成酶法生产工艺的

投入/产出比例较高的问题,变成了该工艺实现工业化的最大路障。对如此有竞争优势、前景性极好的工艺路线,众多科研人员纷纷投入研究以期获得改良的经济环保型工艺。本文主要对脂肪酶催化合成生物柴油工艺存在的主要问题及相应对策研究进展做一综述。合成工艺最早采用游离脂肪酶。Iso等(2001)研究发现游离酶在反应体系中分散不均且容易聚集结块,催化反应速率及酯得率低;游离酶稳定性差,且无法回收利用,易造成产品难分离问题。此后的研究多数采用固定化脂肪酶。固定化酶稳定性较高,且容易回收再利用,故而推进了酶法合成工艺的工业化进程。　　多数研究表明:固定化脂肪酶首批催化合成生物柴油时酯得率多为90%～98%,且循环20批次甚至

100批次以上时,其酯得率仍能保持在70%～90%,体

1　酶法合成生物柴油简介

社会的和谐可持续发展呼吁绿色能源。碱催化法利用精炼油同甲醇合成生物柴油,虽然在一定程度上缓解了能源压力,但是该工艺的固有缺陷决定了它不是最节能最环保的。因此更具环保优势的绿色能源工艺———脂肪酶催化工艺必然是今后发展的趋势。目前,我国及欧美等国都已将该工艺成功应用于中试生产

[4]

现了相对良好的催化活性和稳定性,而且固定化酶经过滤可迅速从反应体系中分离再利用,从而大大降低了酶制品及整个生产工艺的成本

[11,12]

。。固定化方式及

脂肪酶转化生物柴油的原理即脂肪酶在较为温和的条件下能够催化脂肪酸或甘油三酯分别与甲醇等低碳醇通过酯化或转酯化反应,生成长链脂肪酸单酯(即生物柴油)。该工艺的催化剂脂肪酶(EC3.1.1.3),是一类能催化酯类水解、合成或转酯反应的酶类,广泛分布于动植物与微生物中,来源较为丰富,目前实验室及工业上所用的脂肪酶多数由微生物发酵而来等特异性

[10]

[9]

载体的选择对于酶的催化活性及稳定性至关重要。目前常用的固定化方法有吸附、交联和包埋;常用固定化载体有:硅藻土、大孔丙烯酸树脂、硅酸盐溶胶-凝胶基质、硅石气凝胶、棉膜纺织品等

[11,13～14]

。研究表明:

[15]

疏水非极性大孔聚合物是一种较为理想的载体,其固定效率及相应酶的催化活性、稳定性均很高,高阳等就以大孔树脂NKA为载体固定假丝酵母992125脂肪酶,其在微水有机相中催化大豆油醇解转化率可达97.

3%;棉膜纺织品也具备相当的优势,其价格较为低廉

。部分

脂肪酶催化具有一定的酰基位置或脂肪酸类别或链长

,因而可通过合理调配使其充分发挥催化

活性。脂肪酶既能催化酯化反应也能催化转酯反应,因此具有丰富的原料来源:既可对粗、精制动植物油脂

(主要为甘油三酯)进行醇解,也能对废油脂(含甘油三

且固定后催化效率也较高,转化率可达96%

[14]

。反应

体系中,溶剂存在与否对固定化酶的催化活性影响也很大,Olivier等(2006)发现用气凝胶包被C.antartica脂肪酶,在异辛烷介质中催化转酯化反应,其催化能力与Novo.435脂肪酶相近,而在无溶剂体系中则活性明显低于Novo.435。这可能因为无溶剂体系中底物不容易在气凝胶中扩散的缘故。

2.1.2　应用全细胞催化剂缩减酶制品成本　随后发

酯及游离脂肪酸)进行转化,真正起到提供新型清洁能源、环保净化的作用。

该工艺的温和反应条件、低能耗、无污染、丰富的原料来源及产物易回收等优势表明其为前景性较好的准工业化工艺,但仍存在一些瓶颈问题亟待解决。

2　酶法合成生物柴油工艺的瓶颈问题及相

展的固定化细胞也已经开始应用到酶法合成生物柴油的生产工艺中。该技术将产胞内脂肪酶的细胞固定在载体上(如生物支架颗粒,BSPs)用作全细胞生物催化剂。操作更为简便、经济,省掉纯化这极耗成本的工序,而且固定化过程可在批量培养微生物时同步完成

[15]

应对策研究

目前,脂肪酶的工业生产采用化学碱催化法,脂肪酶催化合成工艺由于酶制品成本较高、稳定性较差、重复利用率低、甲醇等低碳醇对酶的失活效应等瓶颈问题而暂时还没实现工业化。研究采用固定化酶及全细胞催化剂等来降低酶制品的成本并实现酶的重复利

。固定于BSPs上的细胞结合填充床反应器

[15]

(PBR)(图1)催化制备生物柴油时,一步或分步流加

甲醇的催化效率分别可达70%～80%、>90%。同

2008,28(2)

吴义真等:脂肪酶催化合成生物柴油的瓶颈问题及其对策

119

摇瓶相比,PBR避免了对固定化细胞的机械损失及过量醇的毒性作用,从而提高了循环的醇解率。该过程工艺对工业化生产有极大的价值。Matsumoto等

(2001)通过在啤酒酵母MT821内构建胞内超量表达Rhizopusoryzae(R.oryzae)脂肪酶并作为全细胞生物催

化剂催化制备生物柴油,在无溶剂含水体系中,37℃反应165h,反应混合物中酯含量为71wt%。Hama等

[16]

用固定化稻根霉(R.oryzae)细胞作为全细胞催化剂催化大豆油甲醇醇解合成生物柴油,研究表明该脂肪酶位于细胞膜上,且其在胞内的含量及相应的转酯率随膜上脂肪酸组成、含量而改变,可通过向培养基中添加相应的油酸、棕榈酸等物质以提高胞内脂肪酶的含量、并对酶催化活性、稳定性及膜的通透性、强度加以调控。如当细胞膜的油酸与棕榈酸比例为2∶1时,细胞催化的稳定性、转化率较好,循环10次以上,每次均为

2.5h,转化率都在55%左右。Li等

[17]

图1　填充床反应器(PBR)系统示意图[15]

Fig.1　Schematicdiagramofpacked2bed

reactor(PBR)system

[15]

1:Bathsonicator;2:Magneticstirrer;3:Reactionmixturereservoir;4:Peristalticpump;5:TYGONtube;6:Glasscolumnpackedwith6mm

采用响应面方法

×6mm×3mmcuboidpolyurethanebiomasssupportparticles

(BSPs)containingdryRhizopusoryzaecells;7:Product

优化大豆油醇解合成生物柴油,结果表明:全细胞催化剂在无溶剂体系中稳定性差,反应4批次后,酯得率降为零,而在叔丁醇体系稳定性较好,10批次后酯得率仍在90%以上;且从无溶剂体系的细胞中检测到大量甘油、甲酯,而叔丁醇体系中的细胞则检测不到。估计是大量的甘油和甲酯使得酶迅速失活。而叔丁醇的存在恰好可以溶解甘油及甲酯,保持了催化剂的活性和稳定性。

2.2　甲醇等低碳醇对酶的失活效应

分别用于醇解餐饮废油及精油,酯得率没有显著区别,前者达90.4%,后者则为95.9%。废油脂转化率稍微低可能是由废油中存在的氧化脂肪酸引起的。

Watanbe利用两步体系催化酸价较高的酸油有效合

[7]

成生物柴油。分步醇解法可应用于工业上,但批量法

(即间歇式反应)的工业应用需要搅拌,这将会对固定

化酶载体造成机械损伤,不利酶的长期利用,由此发展了固定床反应器。但与批量法不同的是两步法连续流加醇解反应会因甘油的沉积而影响底物扩散、提高甘油层甲醇浓度造成酶失活,所以组建了三固定床反应

[18]

器(图2)的连续流加反应体系,流速均为6ml/h,终

甲醇或乙醇作为酰基受体制备生物柴油时,因其与油脂的混溶性较差,反应所需量的甲/乙醇无法全部溶解于油脂中,未溶解的在体系中形成微粒,与酶接触将引起酶失活。在无溶剂体系中,如果将反应所需的甲醇一次性投入到反应体系中,酶将会立刻失活,回用第2批时转化率急剧降低。针对此瓶颈问题,研究人员采取了不同的技术手段加以克服改进。

2.2.1　甲醇流加方式的改进　醇解1mol的甘油三酯

产物甲酯含量为93%左右。循环100d后,酶活力几乎没有下降。即在该反应体系中能很好地保持酶的催化活性及稳定性,显示了连续流加固定床反应器的良好工业应用前景。

2.2.2　溶剂体系的改进　低碳醇与油脂较低的混溶

理论上需要3mol的甲醇,实际上醇油比多数超过3∶1。而一次性往无溶剂反应体系中加入醇油比大于1∶1的甲醇都可能会严重抑制酶活性。故多数研究

[15]

性可通过向反应体系中添加溶剂而得以改善。研究较多的为有机溶剂,近来,也有利用超临界CO2作为溶剂降低甲醇的毒性作用从而促进脂肪酶的催化效率。研究表明:加入溶剂后体系中反应底物浓度降低,与酶接触表面积增大,酯化率明显提高

[8]

采用均

分3次流加所需的醇以缓解过量醇对酶的毒性作用。随后发现,反应生成的甲酯会促进甲醇在反应体系中的溶解,故Shimada等

[18]

又发展了两步醇解法,即反应

。不同有机溶剂对

开始时先加入1/3总需求量的甲醇,待10h后再加入剩下的2/3总需求量的甲醇,相同反应时间,两步法与三步法醇解的酯得率一样,为97.3%。该改良后的工艺

脂肪酶催化反应的影响主要是疏水性的不同引起的。亲水性强的介质如丙酮,因其可能夺取酶的必需水而导致脂肪酶活性降低,其油脂转化率均未超过25%;溶

120

中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.22008

制备生物柴油,反应3h甘油三酯的转化率接近100%,不仅对废弃物的转化率高,而且反应过程可省掉溶剂回收的工序,一定程度上降低了生物柴油的生产成本。

2.2.3　寻找其它酰基受体　低碳醇碳原子数越少在油脂中的溶解性就越差,甲醇、乙醇分别溶解1/2、2/3总需求量,而碳原子数3以上则可完全溶解。而脂肪酶对不同链长的低碳醇的转化效率是随碳原子数的增加而增大的。研究表明[22,23]

:C2～C4的线性醇及支链

一级醇具有较高的反应速率和转化率。因此,解除甲醇对酶的毒性作用还可通过采用其它的酰基受体而实

图2　连续式三步固定床生物反应器生产生物柴油工艺[18]

Fig.2　Continuousflowproductionofbiodieselfuelwiththreefixed2bedbioreactorinseries

[18]

现。Mukesh等

[22]

采用了极性较弱的22丙醇作为酰基用丁醇同甘油三油酸酯反应6h转化

受体增强脂肪酶的操作稳定性,反应8h最大转化率达

90%以上;Salis

[23]

率达100%。

近几年,乙酸甲酯、甲酸乙酯和乙酸乙酯成了甲醇和乙醇较理想到替代品

[24,25]

1:Storagevesseloffirst2stepsubstrate(oiland1/3molarequivalentofMeOH);2:Storagevesselofsecond2stepsubstrate(oillayeroffirst2stepeluateand1/3molarequivalentofMeOH);3:Storagevesselofthird2stepsubstrate(oillayerofsecond2stepeluateand1/3molarequivalentofMeOH);4:Fixed2bedbioreactorpackedA;5:Fixed2bedbioreactorpackedB;6:Peristalticpump;7:Storage

vesselofproduct

。这些短链酯对脂肪酶无

毒性作用,能全溶解于油脂中,且副产物为对应的甘油三乙/甲酯,对酶亦无毒副作用,容易同产物分离,易回收利用,具有一定的工艺附加值。

2.2.4　开发耐受高浓度短链醇的脂肪酶　少数酶如Pseudomonascepacia脂肪酶对甲醇等短链醇显示出较

剂的疏水性越强对酶活性的影响越小,但是如果疏水性太强,甲醇和甘油则不能在该溶剂中充分溶解,因此仍存在对酶催化的负面影响。

目前应用最为广泛的有机溶剂为石油醚、叔丁醇、正己烷、正庚烷等

[18～20]

高浓度的耐受性,可在无溶剂体系中有较大的反应速率和甲酯得率

[26,27]

,而多数脂肪酶对甲醇、乙醇都比较

敏感,易被抑制失活。采用其它方法(如添加溶剂于反应体系中)解除短链醇毒性作用可以起到一定作用,但是某种程度上,可能会增加生物柴油的生产成本。如果能获得对醇具耐受力的脂肪酶,则可从根本上解决这问题。通过自然筛选和遗传工程手段的结合开发出醇耐受酶是极有意义的。

2.3　酶促反应时间长及酶稳定性较差的问题

,其中叔丁醇是一种相对亲水的

疏水性有机溶剂,可促进甲醇及甘油的溶解,且无毒、低价、沸点低易回收,可用于多种油脂反应体系,从而显示出较强的竞争力。有机溶剂的用量也是相当重要的,过少起不到溶解甲醇及甘油的作用,过多则严重稀释了反应物的浓度,导致反应速率及转化率的下降。李俐林等(2006)研究表明:叔丁醇与油脂的比例在0.5～1.2之间,转化率随着叔丁醇量的增加而增大,采用

1∶1的比例加以研究,在甲醇/油脂为4∶1,35℃,130r/min下反应12h获得95%的生物柴油得率。而且放大

跟碱催化法相比,酶促反应条件相对温和(温度多为35℃～60℃),但是反应时间偏长,这无形中就拉长了生物柴油的生产周期,总的效率就相对较低。故而众多科研人员纷纷探索有效的解决方法。

2.3.1　对酶的处理　研究表明对酶进行预处理可达

到加快反应速率缩短反应时间的效果。Samukawa等

[28]

至200kg/d的规模,200批次后酶活性基本没下降。

Royon等

[21]

在反应前将Novozym435分别在油酸甲酯、菜籽油

采用叔丁醇作溶剂催化棉籽油生产生物柴

中浸泡0.5h、12h,反应3.5h后甲酯含量即可达97%,而未处理的则需24h才能达到相同的酯含量;处理过的酶循环20次后酯得率仍有96%。盛梅等(2005)用同样的方法预处理国产工业级固定化脂肪酶提高了酶的稳定性和催化醇解活力,得到99%的最终甲酯含量。

油,50℃下反应24h,醇解率97%,在流速9.6ml/h?(g酶)的一步固定床连续反应器中醇解率95%,连续反应

50h,酯得率无明显下降。KojiMA等(2004)则采用石

化柴油作为溶剂,用含甘油三酯的工业下脚料为原料

2008,28(2)

吴虹等

[29]

吴义真等:脂肪酶催化合成生物柴油的瓶颈问题及其对策

121

研究表明,通过适宜的超声(20kHz,80w,突变、诱变等各种基因工程手段改造现有的脂肪酶,提高酶的催化活性、耐醇性及稳定性。

原料方面,应致力于寻找廉价原料油脂资源,以降低原料成本。可通过因地制宜种植高产的油料作物、发展能源微生物、利用沿海地区开发工程微藻等途径丰富油料来源;同时组织科研攻关,采用基因工程等技术改良大豆、油菜籽等物种,提高其含油量及其它附加值,获得优质廉价的油脂原料。　　期望日后能开发出品质更为优良的廉价的脂肪酶及高产的含油量丰富的低价原料,实现极低能耗、无溶剂、反应速率快周期短而转化率高且原料成本低的经济环保型酶法合成生物柴油的工业化工艺。

30min)预处理,可强化Novozym435脂肪酶的操作稳定

性和提高转酯速率。Jechwei等(2003)则通过22丁醇或叔丁醇对酶的浸没处理显著提高固定化酶的活力。同时也用这两者浸洗甲醇失活的酶,分别使酶活性恢复到56%,75%。

由于不同酶催化特性及能力不一样,且价格相差也大。如LipozymeTL是一种具1,3位酯键特异性的脂肪酶,理论酯得率67%,加上酰基转移,总酯得率仍<84%,但其催化速率快且价格便宜,而Novozym435则MI

不存在酯键位置特异性,具更高催化活性,但速率相对慢些且比较昂贵,故可按比例混合两种酶进行共催化,即可缩短反应时间和提高得率,并降低成本。

2.3.2　对底物的处理　对底物反应体系的预处理也

参考文献

　[1]HidekiFukuda,AkihikoKondo,HideoNoda.Biodieselfuel

productionbytransesterificationofoils.JournalofBioscienceandBioengineering,2001,92(5):405～416

可以缩短反应时间,提高转化率。鲁明波

[3]

通过对底

物大豆油进行乳化,充分减小油滴,增大其表面积即增大与酶的接触面,从而使反应时间缩短一半,并提高了转化率。Hama等

[15]

采用超声乳化底物结合填充床反

　[2]蔡志强,邬国英,林西平,等.固定化脂酶催化合成生物柴油

的研究.中国油脂,2004,29(8):29～32

CaiZQ,WuGY,LinXP,etal.ChineseJournalofOil,2004,29(8):29～32

应器(PBR)制备生物柴油(图1)。PBR装置中,连续不断循环反应混合物可实现更好地混合。近年来又发展了一种采用表面活性剂的微乳化体系

[15]

,将微乳化

　[3]鲁明波,余龙江,薛勇,等.生物柴油的酶促合成研究.中

国油脂,2005,30(11):62～64

LuMB,YuLJ,XueY,etal.ChineseJournalofOil,2005,30(11):62～64

技术同PBR的结合将进一步提高反应效率。

3　展　望

目前,制约我国生物柴油工业化主要因素为:转化工艺水平较低及原料价格昂贵。转化工艺水平方面,除了对传统的碱催化法加以改进之外,还可加紧对脂肪酶催化工艺的研发。脂肪酶催化法制备生物柴油不仅可以利用粗、精制动植物油脂,也可利用餐饮业、工业废油脂、下脚料等,比碱催化法更具优良的原料适应性。同时,反应条件温和,产品分离及副产物回用等方面也简单易行,且无污染排放,因而是相对经济和环保的。目前酶法催化工艺产业化的瓶颈是脂肪酶制品较高的成本和较短的使用寿命。通过醇的流加方式、有机溶剂的介入及新酰基受体的使用已能显著提高酶的稳定性和催化活性。而通过固定化酶和全细胞催化剂同连续化的生物反应器的结合已能较大地降低酶的成本,提高酶的使用寿命。

日后,在筛菌方面加大力度,可望筛到品质优良的高耐受低碳醇的脂肪酶,也希望获得在较低的温度下

(如20℃或室温)具有较高的催化活性和稳定性的低温

　[4]王孟杰,谭天伟,朱卫东.中国生物质液体燃料技术发展.

中国科技产业:中国能源科技专辑,2006.80～84

WangMJ,TanTW,ZhuWD.

ScienceandTechnology

IndustryofChina.ChinaEnergyScience&Technology,2006.80～84

　[5]MarchettiJM,MiguelVU,ErrazuAF.Possiblemethodsfor

biodieselproduction.

RenewableandSustainableEnergy

Reviews,2007,11(6):1300～1311

　[6]ChenG,YingM,LiW.Enzymaticconversionofwastecooking

oilsintoalternativefuel2Biodiesel.ApplBiochemBiotechnol,2006,1292132:911～921

　[7]YomiWatanabe,PraphanPinsirodom,ToshihiroNagao,etal.

Conversionofacidoilby2producedinvegetableoilrefiningtobiodieselfuelbyimmobilizedCandidaantarcticalipase.JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic,2007,44(324):99～105

　[8]邓利,谭天伟,王芳.脂肪酶催化合成生物柴油的研究.生

物工程学报,2003,19(1):97～101

DengL,TanTW,WangF.ChineseJournalofBiotechnology,2003,19(1):97～101

酶,以进一步降低生物柴油制备的能耗。同时结合点

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/dhzv.html