高效液相色谱法测定妥布霉素滴眼液含量

?１８０８?

可用于黄芪补血胶囊的质量控制。参考文献：

中国医院药学杂志２００８年第２８卷第２０期ＣｈｉｎＨｏｓｐＰｈａｒｍＪ，２００８Ｏｃｔ，Ｖｏｌ芝８，Ｎｏ．２０

［１］牛丽颖．王继业，崔力剑，等．薄层扫描法测定黄芪补血胶囊中

黄芪甲苷的含量口］．河北中医药学报，２００４，１９（１）：２３—２５．１－２－１张萍．脉络通颗粒中黄芪甲苷的含量测定［Ｊ］．中国医药导报．

２００７，４（１６）：１３８—１３９．

［收稿日期３２００７?１２－３１

高效液相色谱法测定妥布霉素滴眼液含量

严汝庆１，黄北雄２

（１．贺州市人民医院药剂科，广西贺

州５４２８００；２．梧州药品检验所，广西梧州５４３００１）

［摘要］目的：建立高效液相色谱法测定妥布霉素滴眼液含量的方法。方法：选用色谱柱ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱（２５０

ＩＴｌｎｌ×４．６

Ｉ啪，５

ｔａｎ），２，４－＝硝基氟苯柱前衍生，流动相为乙腈－ｏ．２５％三羟甲基氨基甲烷水溶液（６７：３３），流速１．０ｍＬ?ｍｉｎ－。，检测波长３６５

ｍ。结果：标准曲线线性范围７．０４～

３５．２ｎａｇ?Ｌ～，ｒ＝０．９９９

９；平均回收率为９９．９％，ＲＳＤ为

Ｏ．３４％；精密度ＲＳＤ为０．１５％。结论：所建立的测定方法简便、快速、可靠，完全适合妥布霉素滴眼液质量控制。［关键词］

高效液相色谱法；妥布霉素；含量测定

［中田分类号］Ｒ９２７

［文献标识码］Ａ

［文章编号］１００１—５２１３

（２００８）２（卜１８０８－０２

妥布霉素（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）对铜绿假单胞菌和多数革兰阴性菌有良好的抗菌作用［１］。由于缺乏紫外吸收，妥布霉素的测定多采用微生物法嘲，旋光法［３］，分光光度法［４］，ＨＰＬＣ柱前衍生法［５］和ＨＰＬＣ－蒸发散射光检测法［６］．妥布霉素滴眼液的含量测定，我国现行标准为微生物法，美国药典（２８版）则为ＨＰＬＣ衍生化法。本实验参考了相关文献及美国药典（２８版）收载的妥布霉紊滴眼液质量标准，采用２，４－二硝基氟苯衍生ＨＰＬＣ法测定妥布霉素滴眼液的含量，并对其方法学进行了研究。１材料

ＬＣ一１０ＡＴ高效液相色谱仪，包括ＳＰＤ一１０Ａ紫外检测器（日本岛津）；Ｕｖ一１８０１紫外一可见分光光度计（北京谱析），妥布霉素对照品（中国药品生物制品检定所，批号１３０５２７—２１Ｘ）６０２，含量９１．４％）；妥布霉素滴眼液，规格５ｍＬ：

１５

ｒａｇ（武汉诺安药业有限公司，批号０７０７０１，０７０７０２．

０７０７０３）；三羟甲基氨基甲烷为生化试剂，乙腈、２，４－－－硝基氟苯为分析纯。２方法与结果

２．１

色谱条件

色谱柱：ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱（２５０ｎ瑚×４．６

ｍｍ，５ｔａｎ）；流动相：乙腈＿０．２５％三羟甲基氨基甲烷水溶液

（６７：３３）；流速：１．０ｍＬ?ｍｉｎｌ；检测波长：３６５ｒｌｒＩｌ，柱温室温。理论板数按妥布霉素衍生物计算，应不低于３０００，妥布霉素衍生物峰的拖尾因子应不超过１．５。

２．２系统适应性上述色谱条件下，对照品衍生物溶液、样品衍生物溶液、衍生化后空白辅料溶液及未衍生化对照品色

谱行为见图１，妥布霉素衍生物保留时间为１３．５ｒａｉｎ，空白辅料对测定无干扰。

ｎ而ｒ厂而厂而以百ｆ

ｔ／ｍｉｎ

ｔ／ｒａｉｎ

ｔ／ｍｉｎｔ／ｍｉｎ

图１高效液相色谱图

Ａ衍生化后空白辅料；Ｂ对照品衍生物ＩＣ样品衍生物；Ｄ．未衍生化对照品；１．妥布霉素衍生物

Ｆｉｇ

１

ＨＰＬＣｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ

Ａｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｏｆｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ

Ｒｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ；Ｃ

ｓａｍｐｌｅｓｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ；Ｄ．ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｅｅ，１．ｔｏｂｒａｍｙｅｉｎｄｅｒｉｖａ—ｆｉｖｅｓ

２．３衍生化

２．３．１溶液配制（１）２，４－二硝基氟苯溶液：取２，４－二硝基氟苯适量，用乙腈配制成质量浓度为１０ｇ?Ｌ。１的溶液。（２）对照品溶液的制备：取妥布霉素对照品约５５ｍｇ，精密称定，置５０ｍＬ量瓶中，加适量水和０．５ｔｏｏｌ?Ｌ１硫酸溶液１ｒｎＬ使溶解，并用水稀释至刻度，摇匀。精密量取１０ｍＬ，置５０ｎ山量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（质量浓度０．２２ｇ?

Ｌ－１）。（３）供试品溶液的制备：精密量取本品１．５ｍＬ，置５０

ｒＴｌＬ量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得（质量浓度０．０９

ｇ?

Ｌ一１）。

２．３．２柱前衍生化分别精密量取对照品溶液４ｍＬ和供试品溶液１０ｒｒ止，置２只５０ｍｌ。量瓶中，各加入２，４．二硝基氟苯溶液１０ｍＬ和０．１％三羟甲基氨基甲烷溶液１０１１１Ｌ，摇匀，置（６０±２）℃的水浴中加热５０ｒｎｉｎ［“，室温放置１０ｍｉｎ，加乙腈适量，放至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，即得对照品衍生物溶液（质量浓度１７．６ｍｇ?Ｌ１）和供试品衍生物溶液（质量浓度１８．０ｎａｇ?Ｌ１）。

２．４空白干扰试验精密量取按处方配制的空白辅料溶液

１．５

ｍＬ，置５０ｒｎＬ量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。精密量

取１０ｍＬ，置５０１１１Ｌ量瓶中，以下操作照“２．３．２”项下方法，

进样２０止，在上述确定的流动相条件下进样２０肚Ｌ，记录色

谱图，见图１。结果表明空白辅料对妥布霉素的含量测定没有干扰。

２．５衍生化时间的确定分别精密量取对照品溶液４ｍＬ，置于５个５０ｍＬ量瓶中，各加入２，４－二硝基氟苯溶液１０ｍＬ和０．１％三羟甲基氨基甲烷溶液１０ｒＩｌＬ，摇匀，置（６０±２）℃的水浴中加热，分别于０，２５，５０，７５，１００ｒａｉｎ取出，室温放置

１０

ｍｉｎ，加乙腈适量，放至室温，用乙腈稀释至刻度。摇匀，分

别进样记录峰面积。结果表明：妥布霉素的衍生化反应在６０℃加热５０ｗｉｎ后，反应完全，故衍生化条件为（６０±２）℃加热５０ｍｉｎ。２．６方法学考察

２．６．１线性关系取妥布霉素对照品６０．２ｔｒｉｇ，精密称定，置５０ｍＬ量瓶中，加适量水和０．５ｍｏｌ?Ｌ。１硫酸溶液１ｎｌＬ使溶解。并用水稀释至刻度，摇匀，精密量取１０ｒＩｌＬ，置５０ＩｎＬ

［作者简介］严汝庆，男。学士，主管药师，电话：１３３０７８４２９１９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｚｒｍｙｙｙｊｋ＠１６３．ｔｏｍ

中国医院药学杂志２００８年第２８卷第２０期ＣｈｉｎＨｏｓｐＰｈａｒｒｎＪ，２００８Ｏｃｔ，Ｖｏｌ２８，Ｎｏ．２０

量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取０．８，１．６，２．０，２．４，４ｍＬ，置２５ｎｉＬ量瓶中，加入相应量的２，４．二硝基氟苯溶液和０．１％三羟甲基氨基甲烷溶液，摇匀，置（６０土２）℃的水浴中加热５０ｍｉｎ，室温放置１０ｍｉｎ，加乙腈适量，放至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为７．０４，１４．０８，１７．６，２１．１２，３５．２ｍｇ?Ｌ１的对照品衍生物标准溶液，在上述色谱条件下，分别取２０弘Ｌ注入液相色谱仪，每样进２针，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Ａ＝２１０７０８．４Ｃ＋１９５６４１．０，，－＝０．９９９９。结果表明：妥布霉素在７．０４～３５．２ｍｇ?Ｌ１的范围内与峰面积呈良好的线性关系。

２．６．２最小检测限取“２．６．１”项下对照品衍生物１７．６ｍｇ?Ｌ１标准溶液，用乙腈逐级稀释成每１ｍＬ含妥布霉素０．０３５２弘ｇ的溶液，进样，妥布霉素峰的峰高约为噪音峰高的３倍，妥布霉素最小检测限为０．７ｎｇ。

２．６．３精密度试验取“２．６．１”项下对照品衍生物１７．６ｎａｇ?Ｌ。标准溶液，分别进样６次，结果平均峰面积为３９１０１８８，ＲＳＤ为０．１５％。

２．６．４回收率试验取妥布霉素对照品相当于处方量的１２０％，Ｉ（Ｈ）％，８０％各３份，精密称定，按处方加入空白辅料，制备妥布霉素对照品滴眼液，测定含量，进行回收率试验，结果见表１。

表１回收率试验结果

Ｔａｂ１Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｅｃｏｖｅｒｙｔｅｓｔ

试验结果表明：妥布霉素滴眼液用本法测定回收率较高，有良好的准确度。

２．６．５样品溶液稳定性试验取同一份供试品衍生物溶液（批号０７０７０３）。分别于０，２，４，８，１２ｈ进样，结果平均峰面积为３８９７１６１，ＲＳＤ为０．６６％，妥布霉素经２，争二硝基氟苯衍生化后的衍生物溶液在１２ｈ内稳定。

２．６．６重复性试验取同批样品（批号０７０７０３）６份，照样品含量测定项操作，测得含量分别为９９．３８％，９９．５５％，１００．２１％，９９．８５％，９９．５６％，９９．７８％，平均标示量为９９．７２％，ＲＳＤ为０．２９％。

２．６．７样品含量测定按“２．３．２”项分别制备对照品衍生物溶液和供试品衍生物溶液，各进样２０弘Ｌ，外标法定量。３批样品测定结果见表２。

袭２样品含量测定结果

Ｔａｂ２Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｓ

注：与微生物法比较，Ｐ＞Ｏ．０５

３讨论

妥布霉素的测定微生物法、旋光度法、和分光光度法均不能排除制剂中杂质的干扰，操作烦锁、费时，而且反应过程产生的副产物也可干扰测定。ＨＰＬＣ柱前衍生化法可能将产生的副产物分离，并且分析时间大为缩短。妥布霉素的衍生化处理主要是引入紫外吸收基团，衍生剂可用２，４，６－三硝基苯磺酸，也可用２，牛二硝基氟苯［“。

流动相中曾加入０．５ｍｏｌ?Ｌ１硫酸溶液，结果表明：只有用乙腈一０．２５％三羟甲基氨基甲烷水溶液（６７：３３）时，各峰的保留时间比较适宜，且分离效果较好。

对于本实验采用的衍化的反应条件，本实验参考了相关文献口］，同时对其反应时间进行了验证确定，结果与文献一致。

本测定方法简便、快速、可靠，完全适合妥布霉索滴眼液的含量测定。

参考文献：

［１］殷凯生，殷民生．实用抗感染药物手册［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２００１：１２４—１３６．

［２３中国药典．二部［ｓ］．２００５：２７０．

［３］李秀蓉．旋光法快速测定硫酸妥布霉素注射液半成品的含量［Ｊ］．海峡药学，２００２，１４（４）：５６—５８．

［４］江虹．水溶苯胺蓝褪色光度法测定庆大霉素及妥布霉紊的研究［Ｊ］．分析科学学报，２００５，２１（３）：３０１—３０３．

［５］于华生，陈东鸿，马赛骏．ＨＰＬＣ柱前衍生法测定妥布霉素［Ｊ］．海峡药学，２１Ｘ）１．１３（４）：２８－３０．

［６］洪利娅，陈悦，陈贵斌，等．ＨＰＬＤ－ＥＬＳＤ法测定妥布霉素的含量［Ｊ］．中国抗生素杂志．２００５，３０（１１）：６６２—６６４．

［收稿日期］２００８－０６－２２

《药物不良反应杂志》征订启事

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