生物化学实验报告（刘版） - 图文

生物化学实验报告

生物化学

实验报告

班级：食品08-1班 姓名：刘鸣畅

学号：080424102 指导老师：林善枝

1

生物化学实验报告

2

生物化学实验报告

实验一 过氧化物酶活性的测定

1实验目的：

掌握酶活性的测定方法和原理。

2实验原理：

过氧化物酶是一种含铁卟琳的氧化酶，是利用H2O2将代谢中一些化合物氧化，其活性与呼吸作用和其一些生理过程有关。测定过氧化物酶的活性变化是植物生理和病理上一个常用的指标。

过氧化物酶能催化过氧化氢对某些物质的氧化，如催化过氧化氢氧化愈伤木酚作为被氧化的基质，呈现的棕色可在OD470检测。

3材料设备及试剂

3.1材料：

本实验中采用马铃薯皮。

3.2设备：

容量瓶（25ml）、量筒（25ml）、移液管（1ml）、研体、试管架 72型分光光度计、冰箱、离心机、1/100扭力天平、秒表。

3.3试剂：

0.2M磷酸缓冲液（pH=6.0)、反应混合液【0.2M磷酸缓冲液（pH=6.0)100ml，加入愈伤木酚0.019ml，开始实验前在加入30% H2O2 0.02ml，摇匀】

4实验步骤

称取一定量马铃薯外皮，加少许石英砂及0.2M pH6.0磷酸缓冲液磨成匀浆（分批加入并记录体积），至液体粘稠度适中，加入20mL缓冲液浸提15min后装入离心管。

在4℃静臵50min后用12,000rpm/min离心30min，取上清液放入冰箱待用。 在光径为1cm的比色杯中加反应液3mL，迅速加入10μL酶液，立即用擦镜纸盖住杯口，反复摇动比色杯，使反应体系迅速混匀。且在一加入酶液就开始计时，以10μL酶液加3mL不含H2O2的反应混合液作为空白对照，选用470nm波长，每30s记录光密度值。

以时间为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制酶促反应进程曲线，并根据反应初速度计算酶的相对活性。

3

生物化学实验报告

5实验数据及处理

马铃薯皮0.53g 缓冲液600微升

表１－１

t（min） OD t（min） OD

OD0.80.70.60.50.40.30.20.1001 0.5 0.185 7 3.5 0.502 2 1 0.238 8 4 0.554 3 1.5 0.276 9 4.5 0.603 4 2 0.334 10 5 0.669 5 2.5 0.396 11 5.5 0.732 6 3 0.45 酶促反应进程曲线0.1850.2380.2760.3340.3960.450.5020.5540.6030.6690.732123图１－１

45时间6

选用OD值在0.2—0.8之间的数值进行分析 V平均=[(0.502+0.554+0.603+0.669+0.732)- ( 0.238+0.276+0.334+=0.396+0.450)]/5=0.2732 规定UL=0.001OD/s，则U=273.2UL 马铃薯鲜重为0.53g

所以提取的过氧化物酶的相对活性为972.6UL/gFW

６实验过程及结果分析及感想

由酶促反应进程曲线可看出，加入酶液后OD值随着反应时间延长而增长，一段时间后达到最高值，之后随着酶活性下降而逐渐下降。

由此可得初步结论，即酶促反应速度随反应时间延长而逐渐变快，到一定程度（酶液与反应液浓度相当时），速度减缓，直至饱和。

4

生物化学实验报告

由于酶液用量没有拿捏得当，就用了10μl的量，以至于OD值未能完全处于0.2-0.8之间，对分析结果产生了一定影响。而且加酶液后没有混匀，也对测定结果产生影响，造成前几分钟OD值基本没变化。今后做实验我会注意操作，注重细节，在实验书的基础上摸索。

7思考题

1.比较过氧化物酶和过氧化氢酶在催化反应中的主要区别？

答：过氧化氢酶是专一的分解过氧化氢的酶，常作为植物代谢的一种指标；过氧化物酶能催化过氧化氢对某些物质的氧化，常作为植物生理与病理上的指标。

2.为什么在酶促反应实验中强调要混匀？为何不用煮死的酶液，而是在反应混合液中不加H2O2作空白对照？

答：混匀能使反应液与酶液充分混合，能更好观察酶促反应且不受干扰。若用煮死的酶液会造成与酶液OD之不同，而H2O2无色透明，不加则不会使反应液与酶液反应。

5

生物化学实验报告

实验二：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定种

子蛋白分子量

1实验目的：

学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法

2实验原理：

SDS-PAGE是在要走电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液之后，要在沸水中煮3-5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变形和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SD分子，这是各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品槽底部。

制备凝胶时首先要根据带分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常食用的15%的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是10４－10５，即分子量小于10４的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于10５的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要食用低浓度如10%或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用较高浓度凝胶可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1cm），并在浓缩胶插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常还为3－5%），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常还PH较低（通常还PH=6.8)，用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。

样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl?、甘氨酸阴离子以及蛋白质—SDS复合物，在浓缩胶的PH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl?的电泳迁移率最大。在电池的作用下，Cl?最初的迁移

6

生物化学实验报告

速度最快，这样在Cl?后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl?后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl?和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质—SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl?的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl?是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。

当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的PH值（通常PH=8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质—SDS复合物，甘氨酸和Cl?的界面很快超过蛋白质—SDS复合物。这时候蛋白质—SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质—SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶。进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易地通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到交大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。

溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位臵。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1-1.5小时，电泳在25-30mA下通常需要3小时，染色2-3小时，过夜脱色。

SDS—PAGE还可以用于未知蛋白质分子量的测定。在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各标准蛋白的电泳距离，并对各自分子量的对数作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离，通过标准曲线就可以求出未知蛋白质的分子量。

SDS—PAGE还常用于提纯过程中纯度的检测。纯化的蛋白质通常还在SDS点用上应只有一条，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS—PAGE具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

3材料设备及试剂

3.1.材料：

新鲜绿豆

3.2.试剂：

丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液【22.2 克Acr，0.6克甲叉双丙烯酰胺（Bis），加水溶解并定容到100ml，过滤后使用】；

7

生物化学实验报告

10%SDS溶液； 10%过硫酸铵溶液； TEMED溶液；

分离胶缓冲液，1.5MpH8.8的Tris—HCl缓冲液【将18.15克Tris用水溶解后，用6N的盐酸调至pH8.8，定容到100ml】；

浓缩胶缓冲液【0.5MpH6.8的Tris—HCl缓冲液，将6克Tris溶解后，用6N盐酸调至pH6.8，定容到100ml】；

电极缓冲液【将3克Tris，14.4克甘氨酸和1克SDS，加水溶解后定容到1000ml，pH应为8.3】；

样品缓冲液【将1克SDS，2mlβ-巯基乙醇，5ml甘油，1ml试剂⑹和1.0ml0.1%溴酚蓝，用水溶解并稀释到50ml】； 0.1%溴酚蓝溶液； 已知分子量的标准蛋白； 未知分子量的蛋白质样品；

考马斯亮蓝溶液【称取0.25克考马斯亮蓝R-250，加入45ml乙醇，10ml冰乙酸和45ml水过滤后使用】；

脱色液【37.5ml冰乙酸，25ml乙醇加水到500ml】； 蛋白溶解液； 上样缓冲液；

标准蛋白液（Marker）【用0.15mol/L NaCl配制1mg/mL牛血清白蛋白溶液】

3.3.器材：

台式离心机，电子天平，电泳槽； 电热恒温培养箱； 恒温水浴锅；

电泳槽、移液管、吸耳球、 研钵、培养皿、 微量注射器，TIP。

4.试验步骤：

【制备样品】

称取4粒绿豆，加入石英砂，研钵研磨，加入上样缓冲液，离心（15000rpm共25min）取等体积上清液，加蛋白溶解液，搅拌，臵冰箱30min离心（15000rpm共30min）留上清液。加等体积上样缓冲液 沸水浴3min 加一滴溴酚蓝，取1ml待用。

8

生物化学实验报告

【做胶板】

将玻璃板洗净去污，干燥，插槽（内高外低），双手均匀用力，压实，注分离胶至红线，加水层，等到凝固后倒出水层，吸干，注入浓缩胶，插梳子待凝胶后拔梳子，去掉密封条，板子方向掉个（内低外高）。 【制胶液】

SDS—不连续体系凝胶配制

表2-1

试剂名称 分离胶贮液 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 10%SDS 1%TEMED 蒸馏水 10%AP 【点样】

浓缩胶 1.5ml - 3ml 0.1ml 18μl 5.3ml 0.1ml 分离胶 8.5ml 2.5ml - 0.2 15μl 8.6ml 0.13ml 用微量注射器加样品和Marker各20μl至样品槽（Marker与样品间隔一个样品槽）。 【电泳】：

在两块板内外层分别加电极缓冲液（内至矮板，外过底线）盖通电（15mA/槽），待溴酚蓝跑到分离胶时，加大电流值（25 mA/槽），至溴酚蓝跑到底边。 【染色】

取出板胶，加水浸洗，开启胶板，除浓缩胶至界面，加染色剂考马斯亮蓝R-250，臵恒温箱2-4h。 【染色】

回收染液，自来水清洗，脱色液脱色（３０h左右），清晰区带。

５实验数据及其处理

9

生物化学实验报告

图2-1

相对迁移率（Rm）=蛋白质移动的距离/指示剂移动距离 标准蛋白的相对分子质量和移动距离：

表2-2

标准蛋白 相对分子质量移动距离（cm） 相对迁移率 的对数 4.99 4.82 4.63 4.49 1 1.6 2.8 4.2 0.22 0.35 0.61 0.91 兔磷碱化酶 牛血清蛋白 兔肌动蛋白 牛硫酸酐酶 10

生物化学实验报告

胰蛋白抑制剂

4.30 4.4 0.96 标准曲线相对迁移率1.210.80.60.40.204.2

y = -1.1856x + 6.11852R = 0.9527蛋白分子量对数4.34.44.54.6图2-2

4.74.84.955.1

样品蛋白：

Marker迁移的距离：4.6cm 蛋白质迁移的距离：2.3 cm

绿豆蛋白的相对迁移率（Rm）=2.3/4.6=０.５ 绿豆蛋白的lgMr= 5.5257 绿豆蛋白的Mr= 35691.92

６实验过程及结果分析及感想

由图可见，通过对数分子量及相对迁移率可对照求出未知蛋白分子量。 蓝带跑不到底的原因主要是电泳较长时间后，看见电压过大，以为电阻过高，电泳已跑完或不能再跑而就提前断电取板胶。

由于在第一次实验中，未注意到充分搅拌，以致在电泳时随能进行，但结果是不成完整的直带，胶根本没法用作数据分析，这让我们觉得一天白忙了，但更使我们注意到细节的重要性，为以后的试验铺好道路。

11

生物化学实验报告

实验三：细胞色素C的制备和测定

1实验目的：

掌握制备细胞色素C的操作技术和含量测定方法。

通过细胞色素C的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤。

2实验原理：

细胞色素是包括多种能够传送电子的含铁蛋白质总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C只是细胞色素的一种。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。

细胞色素C为含铁卟啉的结合蛋白质，分子量约为13000，蛋白质部分由104个左右氨基酸残基组成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分为氧化性和还原性两种，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性引起某些失活。

本实验以新鲜猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。

3材料设备及试剂

3.1.材料：

猪心

3.2.试剂：

2mol/L H2SO4溶液，1mol/L NH4OH（氨水）溶液，0.2%NaCl溶液，25%(NH4)2SO4溶液，BaCl2试剂，20%三氯乙酸（TCA）溶液，人造沸石（Na2O·Al2O3·xSiO2·yH2O):白色颗粒，不溶于水，选用60-80目，联亚硫酸钠（Na2S2O4·2H2O)。

3.3.器材：

电磁搅拌器，电动搅拌器，GL-20B型 高速冷冻离心机，721型分光光度计，玻璃柱（2.5×30cm），500mL下口瓶，烧杯（2000mL，1000mL，500mL，400mL，200mL各一个),量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃棒，透析纸，纱布。

12

生物化学实验报告

4.试验步骤：

4.1总流程

猪心处理 提取 中和调PH 沸石再生 过柱吸附 取50ml备用 洗脱 盐析 TCA沉淀 透析 测定标准曲线 含量测定

图3-1

4.2具体步骤

【材料处理】

将已搅碎的冷冻猪心解冻，除去脂肪、软骨、血管、韧带，放入塑料容器中备用。

【沸石再生】

将人造沸石用蒸馏水清洗，至洗液澄清，而且沸石无氨气味、pH=7。 【提取】

相容器中加入250ml蒸馏水电动搅拌器搅拌2h，边搅拌边加入2mol/L H２SO

４

溶液，调pH至4.0(此时溶液呈暗紫色）。

【中和调PH】

用1mol/LNH4OH调pH至6.0，停止搅拌，用数层纱布挤压过滤，收集滤液。

13

生物化学实验报告

用1mol/LNH4OH调pH至7.2，静臵沉淀分层后，用纱布过滤，得红色滤液。 【过柱吸附】

裁剪一块圆形滤纸，安装在玻璃柱底部，柱架垂直，下端连接乳胶管并用夹子夹好，向柱内加入蒸馏水至１/４体积，装入已经再生好的沸石，待沉淀充分，打开夹子，使柱内沸石面上留一薄层水，将红色滤液从下口瓶中注入柱内，使之沿柱壁流下，控制流速约２－３ml/min，人造沸石由白变粉红，流出液为淡黄为红色，停止吸附。 【洗脱】

向柱内注入自来水，洗至水清，注入蒸馏水，洗至水清，用100ml0.2%NaCl溶液分3次洗涤沸石，注入蒸馏水洗至水清。 【盐析】

用25%硫酸铵溶液洗脱，流速控制在2ml/min以下，收集红色洗脱液。 【ＴＣＡ沉淀】

边搅拌边加入20%TCA，沉淀析出，将沉淀以3000rpm/min的转速离心15min，倾去上清液，收集细胞色素C沉淀，加少许蒸馏水，搅拌溶解，离心30min-60min，收集上清液并记录体积。 【透析】

将上清液注入透析袋，放进500ml烧杯中，对蒸馏水透析，15min换一次水，用BaCl２溶液检查SO４2—是否被除净，透析液与BaCl２反应无沉淀，将透析液过滤，清亮的细胞色素C粗提品溶液。 【含量测定】

取1ml样品，稀释相应适当倍数，配臵成3ml溶液，加少许联二亚硫酸钠，震荡，在波长520nm处测吸光度值。

５实验数据及其处理

【标准曲线测定值】

表3-1

标准溶液体积/ml OD值

0.1 0.039 0.2 0.086 0.4 0.184 0.6 0.264 0.8 0.346 1.0 0.449 【测定值】

表3-2

过沸石 未过沸石 提取液体积/ml 1.4 0.5 水/ml 1.6 2.5 联二亚硫酸钠/ml 0.4 0.4 OD值 0.080 0.105 14

生物化学实验报告

【标准曲线】

细胞色素C含量测定标准曲线y = 0.4429x2R = 0.99890.4490.40.30.20.10000.0390.0860.40.6图3-2

0.5OD0.3460.2640.1840.20.811.2标准溶液体积/ml

注：细胞色素Ｃ曲线基本参数：

M=13000

m=0.0025g

n=1.92×10-7mol

V=7.5ml

c=2.56×10-5mol/L

【数据处理结果】

表3-3

过沸石 未过沸石 提取液体积/ml 1.4 0.5 标准样体积 水/ml 1.6 2.5 联二亚硫酸钠/ml 0.4 0.4 物质的量 OD值 0.08 0.105 标准样体积 0.1806 0.2371 试样浓度 过沸石 未过沸石 0.1806 0.2371 原液总体积 4.62×10-6mol 6.07×10-6mol 3.3×10-3mol/L 1.21×10-2mol/L 过沸石 未过沸石

3mL 1.5mL 粗品总量 9.9×10-6mol 1.8×10-5mol 粗品总质量 0.129g 0.234g ６实验过程及结果分析及感想

６.１产量比理论值低

过沸石的，产量是理论值的一半，未过沸石的，产量也是仅仅９０％多，总

15

生物化学实验报告

结原因如下：

在原料处理时，由于血管、脂肪、软骨等东西没有除尽，导致原料中并不纯为猪心。

在实验中，取滤液时并为全部吸出、取沉淀时并未倒尽滤液等操作误差，和由于一些我们自身的试验技巧不足导致的手误，导致样品并不纯。

由于在过柱时，沸石颗粒本身比较小，猪心滤液残渣含量比较高，致使柱子堵塞，基本不下流，所以把沸石倒入一较大的容器，把滤液也倒入，固定时间搅拌，促进吸附。

7 思考题

1.为做好本实验应注意哪些关键环节？为什么？

答：⑴力争除尽猪心非心肌组织，避免吸附时堵塞；⑵提取中和注意调pH，掌握流速，令细胞色素C可被充分提取；⑶盐析时固体硫酸铵要边加边搅拌，量一定要算准加至45%，少则不足，多则盐溶；⑷沸石再生要彻底，细胞色素C提取才能完全；⑸透析袋不漏。

2．试以细胞色素C的制备为例，总结出蛋白质制备的步骤。

答：蛋白质制备一般步骤：⑴材料处理（加pr特定染料）⑵提取⑶吸附⑷洗脱⑸盐析⑹沉淀⑺透析⑻测定。

16

生物化学实验报告

实验四：溶菌酶的提取和系列性质测定

1实验目的

? 掌握溶菌酶的提取方法

? 了解溶菌酶提取的基本原理、掌握其基本操作 ? 掌握测定酶活力和蛋白浓度测定的一般原理及方法 ? 熟悉酶测活的步骤

? 学会根据实验事实，判断脲抑制的类型

? 掌握测定酶Km值的方法及测定和判断抑制剂类型 ? 掌握酶的最适pH值的测定方法及基本步骤 ? 掌握测定酶的最适温度的方法及基本步骤 ? 掌握SDS-PAGE测酶分子量的方法及基本步骤 ? 掌握SDS-PAGE测酶制剂纯度的方法及基本步骤

2实验原理

Ⅰ 溶菌酶的提取

在研究酶的性质、作用和反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法相交替应用，才能得到较为满意的结果。常用的分离提纯方法有：盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活。为获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性，如在温和环境下操作等。

溶菌酶（Ec.3.2.1.17），又称胞壁质酶、N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种具有抗菌作用的粘多糖酶。溶菌酶分子量约为14.4kD是一种强碱性蛋白，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液和淋巴液等的细胞中。植物中卷心菜、胡萝卜和木瓜等也含有。以蛋清中含量最丰富，鸡蛋中约含有0.3%。

Ⅱ 酶活力、蛋白质浓度测定

棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色复合物，最大吸光度由465nm变为595nm，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律（Beer’s Law），通过测定595nm处光吸收值的增量可对蛋白质浓度进行

17

生物化学实验报告

测定。

溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，该酶可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰胺基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解为可溶性糖肽，使细菌溶解。本实验以溶壁微球菌（M.Lysodeikticus）为底物，通过测定细菌悬浊液浊度的变化（OD600）来测定溶菌酶的活性。

Ⅲ 酶促动力学（Km测定、脲的抑制）

酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度的一半时所对应的底物浓度，其数值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特性常数。不同酶的Km不同，同一种酶在与不同的底物反应时，其Km值也不同。Km反映了酶和底物亲和能力的强弱程度。大多数纯酶的Km在0.01-100mmol/L之间。酶的活力可以被某些物质激活或抑制，凡能降低酶的活性甚至是酶失活的物质，称为酶的抑制剂，酶的活力抑制有可逆抑制和不可逆抑制两种。而可逆的抑制又包括有竞争性抑制，非竞争性抑制等类型，在有抑制剂存在条件下，酶的一些动力学性质发生改变，如Km，Vmax等。通过实验的方法，可以确定出抑制类型

图4-1

Ⅳ 酶的最适pH

一般地说酶是蛋白质，具有许多可解离的极性基团，在不同的酸碱环境中，这些基团的解离状态不同，所带电荷不同，而它的解离状态对保持酶的结构，底物与酶的结合能力以及催化能力都有重要作用。同时许多底物或辅酶也具有解离

18

生物化学实验报告

特性，pH的变化也影响它们的解离状态，同样影响酶活力，因此溶液的pH对酶活性影响很大。若其它条件不变，酶只有在一定的pH范围内才能表现催化活性且在某一pH时，酶的催化活性最大，此pH称为酶的最适pH。各种酶的最适pH不同。但多数在中性，弱酸性或弱碱性范围内，如植物和微生物所含的酶，其最适pH多在4.5-6.5；动物体内酶最适pH多在6.5-8.0，当然也有例外。本实验在不同的pH缓冲液中测定酶活力，可得出此条件下的最适pH。

Ⅴ 酶的最适温度

化学反应速度一般都受温度影响，反应速度随温度的升高而加快，但在酶促反应中，随着温度的升高，蛋白质的变性速度也在加快，从而使反应速度减慢直至使酶完全失活。因此在酶催化的反应中，升高温度既可以使反应速度加快，同时又会引起酶的失活而降低反应的速度，只有在某一温度时，酶促反应的速度最大，此时的温度称为酶作用最适温度。需要注意，体外实验时，酶作用的最适温度不是一个恒定不变的常数，而是与反应时间有关，这说明酶的最适温度只是在一定条件下才有意义。

Ⅵ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测酶分子量及纯度测定

SDS-PAGE是在要走电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液之后，要在沸水中煮3-5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变形和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SD分子，这是各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品槽底部。

制备凝胶时首先要根据带分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常食用的15%的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104-105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要食用低浓度如10%或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用较高浓度凝胶可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1cm），并在浓缩胶插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚

19

生物化学实验报告

丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常还为3-5%），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常还PH较低（通常还PH=6.8)，用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。

样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl?、甘氨酸阴离子以及蛋白质—SDS复合物，在浓缩胶的PH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl?的电泳迁移率最大。在电池的作用下，Cl?最初的迁移速度最快，这样在Cl?后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl?后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl?和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质—SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl?的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl?是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。

当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的PH值（通常PH=8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质—SDS复合物，甘氨酸和Cl?的界面很快超过蛋白质—SDS复合物。这时候蛋白质—SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质—SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶。进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易地通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到交大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。

溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位臵。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1-1.5小时，电泳在25-30mA下通常需要3小时，染色2-3小时，过夜脱色。

SDS—PAGE还可以用于未知蛋白质分子量的测定。在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各标准蛋白的电泳距离，并对各自分子量的对数作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离，通过标准曲线就可以求出未知蛋白质的分子量。

SDS—PAGE还常用于提纯过程中纯度的检测。纯化的蛋白质通常还在SDS点用上应只有一条，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS—PAGE具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息

20

生物化学实验报告

对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

3材料设备及试剂

3.1.材料：

新鲜鸡蛋四个；Amberlite-CG-50阳离子交换树脂

3.2.试剂：

磷酸氢二钠（Na2HPO4）；磷酸二氢钠（NaH2PO4）； 氯化钠（NaCl）；硫酸铵（(NH4)2SO4）； 氢氧化钠（NaOH）；甘油；盐酸（HCl）；

0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0；0.5mol/L NaOH；

0.5mol/L HCl；含50%甘油的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0

测活缓冲液（含 30 mmol/L NaCl 的 0.lmol/L 磷酸盐缓冲液， pH 6.2）； 底物溶液（40 mg M .lySodeikticus 干粉溶于 100 mL 测活缓冲液中）； 考马斯亮蓝 G-250试剂（考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50 mL 95 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％磷酸，用蒸馏水稀释至 I000 mL ，滤纸过滤。或考马斯亮蓝 G-250 100 mg 溶于 50 mL 95 ％乙醇中，加入 100 mL 85 ％磷酸混匀，配成原液。临用前取原液 15 mL 加蒸馏水稀释至 100 mL ，滤纸过滤）； 标准蛋白质溶液：用 0.1 mol/L NaCl 的 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液， pH 7.0 （缓冲液 A ）配制 1mg/ml 牛血清蛋白溶液。 10 mol/L 脲（用测活缓冲液配制）

0.1mol/L 磷酸氢二钠和柠檬酸缓冲液 pH 4.0-8.0 ；0.1mol/ L 甘氨酸和氢氧化钠缓冲液 pH 9.0-10.0

丙烯酰胺（Acr）凝胶贮液【22.2 克Acr，0.6克甲叉双丙烯酰胺（Bis），加水溶解并定容到100ml，过滤后使用】； 10%SDS溶液； 10%过硫酸铵溶液； TEMED溶液；

分离胶缓冲液，1.5MpH8.8的Tris—HCl缓冲液【将18.15克Tris用水溶解后，用6N的盐酸调至pH8.8，定容到100ml】；

浓缩胶缓冲液【0.5MpH6.8的Tris—HCl缓冲液，将6克Tris溶解后，用6N盐酸调至pH6.8，定容到100ml】；

电极缓冲液【将3克Tris，14.4克甘氨酸和1克SDS，加水溶解后定容到1000ml，pH应为8.3】；

样品缓冲液【将1克SDS，2mlβ-巯基乙醇，5ml甘油，1ml试剂⑹和1.0ml0.1%

21

生物化学实验报告

溴酚蓝，用水溶解并稀释到50ml】； 0.1%溴酚蓝溶液； 已知分子量的标准蛋白； 未知分子量的蛋白质样品；

考马斯亮蓝溶液【称取0.25克考马斯亮蓝R-250，加入45ml乙醇，10ml冰乙酸和45ml水过滤后使用】；

脱色液【37.5ml冰乙酸，25ml乙醇加水到500ml】； 蛋白溶解液； 上样缓冲液；

标准蛋白液（Marker）【用0.15mol/L NaCl配制1mg/mL牛血清白蛋白溶液】

3.3.器材：

透析袋；层析柱（2.6×30cm）；高速冷冻离心机 分光光度计 恒温水浴锅

垂直板电泳槽；双稳电泳仪

4实验步骤

4.1试验流程图

22

生物化学实验报告

样品准备 树脂再生及 前期准备 阳离子交换层析 硫酸铵沉淀 分子筛层析 透析浓缩 酶活力测定 蛋白含量测定 Km 测定 脲的抑制作用 酶最适pH 酶最适温度 分子量及纯度

图4-2

4.2具体步骤

【样品准备】

取新鲜鸡蛋4个，破壳取出蛋清，加入1.5倍体积的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0，搅拌均匀，并始终调pH7.0，然后用八层纱布过滤，留取上清液，量取体积并记录，留0.5mL上清液（定为步骤Ⅰ样品）-20℃冻存备用。

【树脂再生及前期准备】

把准备好的Amberlite-CG-50阳离子交换树脂用0.5mol/LNaOH浸泡30min，

23

生物化学实验报告

水洗至中性，再用0.5mol/L HCl浸泡30min，水洗至中性。

在烧杯中将再生好的阳离子交换树脂用0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0平衡。

【阳离子交换层析】

1. 吸附：在已平衡好的阳离子交换树脂中加入蛋清样品，并用玻璃棒搅拌

吸附1h以上。

2. 洗涤：留0.5mL上清液（定为Ⅰ’步骤样品）-20℃冻存备用。倒去其

余上清液，树脂用100mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤三遍。 3. 装柱：将数值搅拌均匀装入2.6×30cm层析柱，再用350mL含0.05mol/L

NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0洗涤杂蛋白。

4. 洗脱：用300mL含0.5mol/L NaCl 的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0

以3mL/min的流速进行洗脱，合并光吸收高峰管，量取体积并记录，留0.5mL上清液（定为Ⅱ步骤样品）。

【硫酸铵沉淀】

每100mL上清液中缓缓加入35g硫酸铵固体，溶解后静臵1h以上，以10，000rpm〃min-1离心15min，沉淀用0.5mL左右含0.1mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0溶解0.5-1h。再用同一转速离心几分钟，留取0.05mL上清液（定为Ⅲ步骤样品）-20℃冻存备用。

【分子筛层析】

将溶解的硫酸铵沉淀样品以10，000 rpm?min-1离心3min，上Sephacyl S-100 HR柱、洗脱。流速控制在15mL/h，分部收集洗脱峰，2mL/管。合并光吸收及酶活高峰管。

【透析浓缩】

用含有50%甘油的蒸馏水，pH7.0透析浓缩4h，-20℃分装冻存（定为Ⅳ步骤样品）备用。

【蛋白含量测定】

标准曲线的制定：取14支试管，按下表分两组进行平行操作。

表4-1

管号 0 1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液mL 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水mL 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝３mL G-250 摇匀，４０min以0号试管为空白对照，在595nm处比色 A595

24

生物化学实验报告

表4-2

标准溶液体积/ml OD值 0.1 0.154 0.2 0.237 0.4 0.523 0.6 0.699 0.8 0.823 1.0 0.911 绘制标准曲线：

以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

OD值1.210.80.60.40.200

测定未知样品蛋白质浓度：

标准曲线y = 0.8737x + 0.10640.8230.6990.5230.1540.2370.20.40.6图4-3

0.9110.81标准溶液体积1.2取未知样品测A595值，用标准曲线求其含量和浓度。

表4-3

编号 0 1 2 3 4 5 未知蛋白含量mL 0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 蒸馏水mL 1.0 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 考马斯亮蓝G-250 ３mL 摇匀，４０min以0号试管为空白对照，在595nm处比色 A595

【酶活力测定】

25

生物化学实验报告

表4-4

管号 1 2 测活缓冲液mL 1.50 1.25 底物溶液mL 1.25 1.25 酶液mL 0 0.08 在室温，以1号管为对照，每隔30s测2号650nm处的光吸收值 时间s 0 30 60 90 120 150 180 OD650

【Km测定】

取6个试管编号，按下表加样：

表4-5

管号 1 2 3 4 5 6 测活缓冲液mL 1.8 2.4 2.7 2.85 2.92 2.96 底物溶液mL 1.2 0.6 0.3 1.2 0.08 0.36 酶mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 对照管以测活缓冲液代替酶液，测3分钟时样品管650nm处的光吸收值的下降值 OD650

以1/[S]对1/v作图。

【脲的抑制作用】

取6个试管编号，按下表加样：

表4-6

管号 1 2 3 4 5 6 测活缓冲液mL 0 0.6 0.9 1.05 1.11 1.16 底物溶液mL 1.2 0.6 0.3 0.15 0.08 0.04 10mol/L脲mL 1.8 酶mL 0.08 对照管以测活缓冲液代替酶液，测3分钟时样品管650nm处的光吸收值的下降值 OD650 26

生物化学实验报告

以1/[S]对1/v作图，与底物影响之双倒数图对照比较，推出抑制类型。

【酶最适pH】

取8支试管，按记录表中要求加样

表4-7

管号 pH 缓冲液（ml） 酶液（ml） 底物溶液（ml） OD650 1 4.0 2 5.0 3 6.0 4 7.0 2 0.08 0.05 5 8.0 6 9.0 7 10.0

在室温先将缓冲液和酶液保温10min，再加入底物溶液，测定3min时样品管650nm处的光吸收值的下降值，对照管以测活缓冲液代替酶液。

【酶最适温度】

在室温到90℃之间选择不同温度测定酶活力，以找出酶在此条件下的最适温度。

取8支试管，按下表加样：

表4-8

管号 温度（℃） 测活缓冲液（ml） 酶液（ml） 底物溶液（ml） OD650

1 室温 2 30 3 40 4 50 2.5 5 60 6 70 7 80 8 90 20uL 2.5 先将缓冲液和酶液在相应的温度下保温10分钟后，再加入底物溶液，继续

27

生物化学实验报告

在相应温度下保温，测定3分钟时样品管的650nm处的光吸收下降值，对照液以测活缓冲液代替酶液。

【分子量及纯度】

做胶板

将玻璃板洗净去污，干燥，插槽（内高外低），双手均匀用力，压实，注分离胶至红线，加水层，等到凝固后倒出水层，吸干，注入浓缩胶，插梳子待凝胶后拔梳子，去掉密封条，板子方向掉个（内低外高）。

制胶液

SDS—不连续体系凝胶配制

表4-9

试剂名称 分离胶贮液 分离胶缓冲液 浓缩胶缓冲液 10%SDS 1%TEMED 蒸馏水 10%AP 点样

浓缩胶 1.5ml - 3ml 0.1ml 18μl 5.3ml 0.1ml 分离胶 8.5ml 2.5ml - 0.2 15μl 8.6ml 0.13ml 用微量注射器加样品和Marker各20μl至样品槽（Marker与样品间隔一个样品槽）。

电泳：

在两块板内外层分别加电极缓冲液（内至矮板，外过底线）盖通电（15mA/槽），待溴酚蓝跑到分离胶时，加大电流值（25 mA/槽），至溴酚蓝跑到底边。

染色

取出板胶，加水浸洗，开启胶板，除浓缩胶至界面，加染色剂考马斯亮蓝R-250，臵恒温箱2-4h。

脱色

回收染液，自来水清洗，脱色液脱色（３０h左右），清晰区带。

28

生物化学实验报告

５实验数据及其处理

5.1【分子量及纯度】

未知蛋白浓度测定 阳离子交换树脂出峰图

图4-4

29

生物化学实验报告

分子筛层析出峰图：

图4-5

表4-10

样品Ⅰ 样品Ⅱ 0.399 样品Ⅲ 0.085 样品Ⅳ 0.868 样品Ⅴ 0.445

（稀释10倍） （稀释10倍） OD值 0．404 所得数量关系： y = 0.8737x + 0.1064

样品Ⅰ 2.41 样品Ⅱ 0.313 样品Ⅲ 0.563 样品Ⅳ 0.717 样品Ⅴ 0.902

30

生物化学实验报告

5.2【酶最适温度】

表4-11最适温度

管号 温度（℃） 测活缓冲液（ml） 酶液（ml） 底物溶液（ml） OD650

1 20 2 30 3 40 4 50 2.5 5 60 6 70 7 80 8 90 20uL 2.5 0.058 0.066 0.069 0.056 0.051 0.020 0.044 0.022 OD最适温度0.080.070.060.050.040.030.020.0100

1020304050图4-4

60708090T100

由图示所知，最适温度为70度

5.3【酶最适pH】

31

生物化学实验报告

表4-12 pH值的测定

pH 缓冲液体积/ml 样品体积/ml 底物体积/ml OD值△OD

4 2 0.01 0.05 5 2 0.01 0.05 0.062 0.009 0.053 6 2 0.01 0.05 0.169 0.141 0.028 7 2 0.01 0.05 0.12 0.106 0.014 8 2 0.01 0.05 0.167 0.005 9 2 0.01 0.05 0.07 0.086 10 2 0.01 0.05 0.035 0.072 始 0.063 0.042 （650nm） 末 0.021 0.162 -0.016 -0.037 △OD0.10.080.060.040.020-0.02

pH影响pH0246图4-6

81012

根据图中所示，最适pH为8左右

5.4【Km测定】

3min

表4-13 底物浓度的影响

测活缓冲液一号 1.8 二号 2.4 三号 2.7 四号 2.85 五号 2.92 六号 2.96 32

生物化学实验报告

体积/ml 底物体积/ml 样品体积/ml OD值

1.19 0.01 0.59 0.01 0.381 0.361 0.29 0.01 0.193 0.177 0.14 0.01 0.099 0.078 0.07 0.01 0.054 0.043 0.03 0.01 0.026 0.018 始 0.726 （650nm） 末 0.697 标准蛋白3mg/ml

表4-14

S v 1/s 1/v

一号 1.19 二号 0.59 三号 0.29 四号 0.14 五号 0.07 六号 0.03 0.00267 33.33 375 0.00967 0.00667 0.00533 0.00700 0.00367 0.84 103 1.69 150 3.45 188 7.14 143 14.29 273 1/v4504003503002502001501881501001435010300.005.0010.00双倒数曲线y = 7.7423x + 126.87R2 = 0.90133752731/S15.00

33

20.00图4-7

25.0030.0035.00

生物化学实验报告

图4-8

1/Vm = 7.7423x1/[S] + 126.87 1/Km=16.39 Km=0.061

5.5【脲的抑制作用】

表4-15 脲的抑制

测活缓冲液体积/ml 底物体积/ml 10mol/脲 样品体积/ml OD值始 （650nm） 末 一号 0 1.2 1.8 0.01 0.233 0.165 二号 0.6 0.6 1,8 0.01 0.333 0.258 三号 0.9 0.3 1.8 0.01 0.168 0.108 四号 1.05 0.15 1.8 0.01 0.629 0.511 五号 1.11 0.08 1.8 0.01 0.054 0.027 六号 1.16 0.04 1.8 0.01 0.019 -0.002 34

生物化学实验报告

表4-16 数据

一号 △OD 0.068 [S] 1.2 V 0.022667 1/[S] 0.83 1/V 44

二号 三号 四号 0.075 0.06 0.118 0.6 0.3 0.15 0.025 0.02 0.039333 1.67 3.33 6.67 40 50 25 五号 0.027 0.08 0.009 12.50 111 六号 0.021 0.04 0.007 25.00 143 1/V1601401201008060405044204025005

脲抑制倒数曲线y = 4.6127x + 30.479R2 = 0.82331431111015图4-9

20251/[S]30

35

生物化学实验报告

1/V = 4.6127x1[S] + 30.479 1/Km=6.61 Km=0.151

与前面Km对比，可知类型是：反竞争性抑制

5.6【酶活力测定】

表4-17 酶活力测定

样品Ⅰ 样品Ⅱ 样品Ⅲ 样品Ⅳ 样品Ⅴ 样品Ⅵ 测活缓冲1.25 1 1 1 1 1 液体积/ml 底物体积1.25 2.48 2.48 2.485 2.485 2.485 /ml 样品体积20(稀释 20 20 15 15 15 /μl 5倍)

表4-18 OD值

样品Ⅰ 样品Ⅱ 样品Ⅲ 样品Ⅳ 样品Ⅴ 样品Ⅵ 30s 0.168 0.03 0.013 0.158 0.083 0.066 60s 0.163 0.028 0.011 0.156 0.078 0.064 90s 0.157 0.027 0.01 0.154 0.077 0.062 120 0.153 0.025 0.009 0.153 0.075 0.058 150s 0.149 0.023 0.008 0.151 0.071 0.057 180s 0.142 0.021 0.007 0.149 0.067 0.055 210s 0.137 0.02 0.005 0.147 0.063 0.051 240s 0.134 0.019 0.146 0.048

表4-19 V平均

样品Ⅰ 样品Ⅱ 样品Ⅲ 样品Ⅳ 样品Ⅴ 样品Ⅵ

0.01975 0.00675 0.00333 0.00700 0.00833 0.00975 36

生物化学实验报告

规定UL=0.001OD/s，则 UⅠ=19.75UL UⅡ=6.75UL UⅢ=3.33UL UⅢ=7.00UL UⅤ=8.33UL UⅥ=9.75UL

5.7【蛋白含量测定】

37

生物化学实验报告

图4-10

相对迁移率（Rm）=蛋白质移动的距离/指示剂移动距离 标准蛋白的相对分子质量和移动距离：

38

生物化学实验报告

表4-20

标准蛋白 兔磷碱化酶 牛血清蛋白 兔肌动蛋白 牛硫酸酐酶 胰蛋白抑制剂

相对分子质量移动距离（cm） 相对迁移率 的对数 4.99 4.82 4.63 4.49 4.30 1 1.6 2.8 4.2 4.4 0.22 0.35 0.61 0.91 0.96 标准曲线相对迁移率1.210.80.60.40.204.2

39

y = -1.1856x + 6.11852R = 0.9527蛋白分子量对数4.34.44.54.64.74.84.955.1

图4-11

生物化学实验报告

Marker迁移的距离：4.6cm

蛋白质Ⅰ相对迁移率=3.13/4.6=0.682 蛋白质Ⅱ相对迁移率=3.11/4.6=0.678 蛋白质Ⅲ相对迁移率=2.41/4.6=0.523 蛋白质Ⅳ相对迁移率=2.25/4.6=0.490 蛋白质Ⅴ相对迁移率=2.12/4.6=0.461

蛋白质ⅠlgMr=4.585 蛋白质ⅡlgMr=4.585 蛋白质ⅢlgMr=4.720 蛋白质ⅣlgMr=4.747 蛋白质ⅤlgMr=4.772

蛋白质Ⅰ Mr=38498 蛋白质Ⅱ Mr=38799 蛋白质Ⅲ Mr=52427 蛋白质Ⅳ Mr=55897 蛋白质Ⅴ Mr=59135

６实验过程及结果分析及感想

由于胶的形状并不尽如人意，以致在计算迁移率时会造成一定误差。 这次试验给我印象最深的是我们做的三次胶，一次凝，一次不凝，一次溴酚蓝没有了，到现在我还在反思是试验的失误还是什么其他问题导致。其次便是后面的测定实在是很庞大，不断的测OD值给了我很深的印象。

40

生物化学实验报告

实验感想

在这次生化试验前，我从未感受到实验是一件如此具有挑战性和风险性的事情，虽说假期在中科院实习期间参与了一些大型试验，但作为实验的主人还是相当不一样的。首先来说，当你面对如此庞大的一个不曾接触过的实验时，对于心里就是一种挑战。另外就是我在这一周之内的几点感受：

（1） 事先准备充足：一方面是试验前的预习工作，每个人心中都应知道自己在

做什么，将要做什么，最好能简单列出一个清单，让自己、让伙伴知道团队的进度和剩余工作；另一方面在实验中，每一样要用的都要准备好，试剂、仪器、设备都是如此，尤其第一次做大实验的，本来就容易手忙脚乱，如果实验中要用的东西不在手旁，那可能又是一阵手忙脚乱，很容易出现差错。

（2） 团队合作：在实验室的几天时间里，有同学的帮助、有老师的悉心指导，

但接触最多的还是自己组内的成员，如果沟通出现问题可能会是实验更加繁杂甚至是失败。这次生化试验，注定要熬夜，所以安排好组员的值班时间就是尤为重要的了，组内的人员配臵时间、精力、能力等等都要考虑到。实验中有个很好的配合也会是实验事半功倍的。只有大家一起，才能把整个实验顺利的做完。

（3） 钻研精神：开放性试验，虽然有实验讲义，但实验过程中遇到的问题有很

多并未被列出；而且老师在夜里不能陪我们熬夜，有什么情况也只能自己摸索，这也就是目的所在，就在于锻炼大家的，如何使用各种仪器、如何摸索解决一系列问题、如何优化已有操作步骤，等等都要靠自己的钻研。这也培养了我们遇事独立思考，出情况自己钻研解决的精神。

这次试验中，我们遇到了不知多少困难，就说跑电泳，出现了很多的问题与状况，自己也一直在琢磨原因，没有得到解决：第一次TEMED过期的情况下，我们的三分钟内就凝固住了，结果跑完了什么带也没有；第二次更换了TEMED，我们的胶却不凝了；第三次过程中溴酚蓝却突然消失了……这个让我们很不解，但盯着电泳的不只是我们组员，老师也一起和我们忙，一起与我们琢磨原因，这也是我们十分感谢林老师的原因之一，他的要求十分严格，但很多时候就是和我们一起在探索分析！另外这个结果与班内的同学的帮助也是分不开的。

这次实验中我个人的能力也得到了很大提升，学习冷冻离心机的使用、测量细胞色素C标准曲线、测定标准蛋白的标准曲线，还有帮助同学解决各色问题，让我体会到自我钻研的重要性。还有老师的指导，总是在做画龙点睛的工作，给我指点了很多。

这次庞大的生化试验使我提高了心理素质调整心态、提升了实验能力、做事

41

生物化学实验报告

有了一个良好的顺序、养成好的预习习惯、还和大家建立了更深的友谊，与老师建立了更深的情谊。总之，这次试验确实是使我终身难忘、受益匪浅！

42

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/dakw.html