发酵工程工艺设计

发酵工程 课程设计说明书

年产1吨工业纤维素酶发酵工艺设计

学生姓名： 学号：

学 院： 化工与环境学院 专 业： 生物工程 指导教师：

2011年 06月

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前言................................................................................................................................. 1 1纤维素酶简介 ................................................................................................................ 1

1.1纤维素酶的分类 ................................................................................................... 1 1.2纤维素酶的作用机理............................................................................................ 2 1.3纤维素酶的分子量、分子结构及等电点................................................................ 3

1.4产纤维素酶的主要微生物类群.............................................................................. 4 2产纤维素酶的菌种选育 .................................................................................................. 5

2.1 里氏木霉的特性 .................................................................................................. 5 2.2培养基 ................................................................................................................. 5 2.3 菌种 ................................................................................................................... 6 2.4酶活力测定 .......................................................................................................... 6 2.3菌种筛选与鉴定 ................................................................................................... 6 2.4诱变处理 ............................................................................................................. 7 2.5菌种保藏 ............................................................................................................. 8 3培养基的优化 ................................................................................................................ 9

3.1产酶培养基 .......................................................................................................... 9

3.2摇瓶种子培养 ...................................................................................................... 9 3.3产酶发酵培养 ...................................................................................................... 9 3.4生长曲线的绘制 ................................................................................................... 9 3.5纤维素酶活力测定 ............................................................................................... 9 3.6培养基的优化方法 ............................................................................................. 10 4培养基的灭菌 .............................................................................................................. 15

4.1微生物的热死灭动力学方程 ............................................................................... 15 4.2温度对K的影响 ................................................................................................ 15 4.3湿热灭菌 ........................................................................................................... 18 5种子扩大培养 .............................................................................................................. 20

5.1种子制备 ........................................................................................................... 20 5.2车间种子制备 .................................................................................................... 20 5.3 发酵过程 .......................................................................................................... 21 6发酵设备选取及物料衡算： ......................................................................................... 23

6.1发酵罐的工艺尺寸 ............................................................................................. 23 6.2物料横算 ........................................................................................................... 24 7下游加工 ..................................................................................................................... 25

7.1分子筛层析 ........................................................................................................ 25

7.2离子交换层析 .................................................................................................... 25 7.3 酶活力测定 ....................................................................................................... 25 7.4浓缩 .................................................................................................................. 27 7.5低温结晶 ........................................................................................................... 27 7.6分离、洗涤 ........................................................................................................ 27 7.7干燥磨粉 ........................................................................................................... 27 参 考 文 献 .................................................................................................................. 28

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前言

资源和环境问题是2l世纪人类面临的最主要挑战，纤维素与木质素、半纤维素及其它多糖一起构成植物细胞壁的主要成分，是生物圈最丰富的可再生资源和能源物资，是地球生物圈碳素和能量循环的主要部分。据估计，植物每年大约合成1000亿吨以上的纤维素中国的天然纤维素。原料也很丰富，每年的产量是11．45亿吨，仅农作物秸秆、皮壳一项，每年就可以达7亿吨，其中玉米秸秆占35％，小麦秸秆占21％，稻草占19％，大麦秸秆占1096，高粱秸秆占5％，谷草占5％，燕麦秸秆占3％秸秆占2％，可见，玉米秸秆、小麦秸秆和稻草是中国最主要的三大秸秆。此外，来自于林业副产品、城市垃圾、工业废弃物中的天然纤维素原料数量也相当可观汹。

1纤维素酶简介

目前，纤维素材料除少量用于纺织、造纸和建筑外，人们对其开发利用还相当有限在当今不可再生资源和能源日益枯竭的今天，大力开发和转化利用木质纤维素这些可再生资源则十分必要。纤维素酶在现阶段已经广泛应用于包括食品在内的各个领域，今后还将在应用深度和广度上进一步扩展，现在纤维素酶的应用还存在一些问题，主要是生产菌种的优化问题和应用的成本问题，解决问题的主要方法在于现代生物技术的应用和酶工程的进一步探索，只要解决好这些问题，纤维素酶必将在各领域发挥更大作用。总之，纤维素酶是大有前途的新兴产业，其发展方兴未艾，前景广阔。

1.1纤维素酶的分类

纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，它是一类复杂的复合物，称之为纤维素酶系，根据其中各酶功能的差异，可将其分为以下三大类：

(1)内切葡聚糖酶：

来自真菌简称EG，来自细菌简称Len．又称为Cl酶，这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量含非还原性末端的小分子纤维素。

(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖酶：

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来自真菌简称CBH，来自细菌简称Cex，又称为Cx酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-D糖苷键，每次切下1个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶。

(3)β-葡萄糖苷酶：简称BG酶，这类酶将纤维二糖和寡糖水解成葡萄糖分子。

1.2纤维素酶的作用机理

1.2.1几种纤维素酶的作用位点

纤维素酶是—类酶的总称，而非单一的酶。目前在各种酶对纤维素的作用机理上，特别是对Cl-Cx酶假设尚有争议。不过，下述四种酶的存在是众所公认的：(1)内切β-1，4-葡聚糖酶(endo-β1，4-glucanase，EC3．2．1．4，简称EG)。(2)外切β-1，4-葡聚糖酶(exo-β-1，4- glucanase，EC3．2．1．74)。(3)纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，EC3．2．1．91，简称CBH)。(4)纤维二糖酶(cellobiase，E C 3．2．1．21，简称BG)。所谓的Cx酶，系指(1)和(2)。其中纤维二糖水解酶又有内切和外切之分。而C1酶则被认为是(3)。图1-3表示这几种酶的作用位置。

图1-1 各种纤维素酶的作用部位

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1.2.2对纤维素分子的吸附作用

纤维素酶对纤维素的降解，一般首先需要吸附到纤维素上，但并不是好的吸附才有好的催化。纤维素酶的吸附不仅与酶本身的性质有关。也与底物的特性有密切相关，其能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。至于吸附过程是否可逆应视具体酶的种类而定。Nidotsky等发现，里氏木霉的CBH II和EGIII对纤维素的吸附是个可逆过程，而CBHI是个不可逆过程，同时还发现除CBHI外，酶组分吸附与相应的水解活力之间没有线性关系。此外，纤维素酶的吸附机制并末完全弄清，仍需做进一步研究。 1.2.3纤维素酶中单个组分的作用机制

纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制，即作用部分的两个色氨酸参与与基质结合，而处在将被裂解的键及相邻一个非离子化的甘氨酸和一个离子化的谷氨酸残基参与催化作用。这些残基被非极性化的侧链围绕，以促进质子转移。打断N-乙酞粘质酸-N-乙酞氨基葡萄糖键。人们用定点突变技术和酶专一性抑制剂实验证明了谷氨酸位于细菌和真菌的CBH．EG和葡萄糖苷酶的催化位点，也有的纤维素酶是天门冬氨酸、组氨酸和精氨酸位于催化位点，参与催化反应。推测谷氨酸-33和天门冬氨酸-50参与葡萄搪内切酶催化：实验证明谷氨酸-65和天门冬氨酸-81，92可能是纤维二糖水解酶的催化残基。 1.2.4纤维素酶的协同降解机制

前面提及的几种不同功能的纤维素酶在分解过程中存在协同作用。该协同作用不但其作用顺序不是绝对的，就是各酶的功能也不是这样简单固定的。研究表明，EG和CBH都能引起纤维素的分散和脱纤化(沿着纤维素的经度轴方向分层，形成更薄更细的亚纤维)。这样纤维素的结晶结构被打乱，导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性微结晶利于进一步被降解。

1.3纤维素酶的分子量、分子结构及等电点

不同微生物产生的纤维素酶分子量差异很大，即使同一酶系中的酶也有较大差异。一般β-葡萄糖苷酶的分子量最大，常大于70kDa，有的甚至达400kDa。

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外切纤维素酶的分子量一般在50kDa-60kDa左右。内切β-葡萄糖苷酶一般低于50kDa文献报道中，最小的内切纤维素酶分子量为5．3kDa。

多数真菌和少数细菌的纤维素酶都含糖基。糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解。同时纤维素酶由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异。导致酶的多形式和分子量的差别。

研究人员通过对纤维素酶一级结构和三级结构的研究发现。纤维素酶分子普遍具有类似的结构。由球状的催化结构域(catalytic domains，CD)、连接桥(1inker)和纤维素结合结构域(cellulose．binding domains，CBD)三部分组成。(1)连接桥：纤维素酶的连接区大多富含脯氨酸(Pro)和氢基氨基酸。连接桥的作用可能是保持CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体：(2)纤维素结合结构域：它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用。(3)催化结构域：它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。

等电点是蛋白分子的重要理化特征。纤维素酶系中各组分的等电点，随着菌种来源、培养条件的变化而差别较大。以棘抱曲霉为例，液体培养时各酶组分的等电点在3.5-5.02．间。但固体麸皮培养产生的酶组分，在等电聚焦电泳时，甚至可布在两性电解质载体3.5-10的整个pH跨度上。

1.4产纤维素酶的主要微生物类群

(1)细菌：主要有梭菌属Clostridium、纤维单胞菌属Cellulomonas、杆菌Bacillus、高温单胞菌属Thermomonospora、瘤胃球菌属Ruminococcus、拟杆菌Bacteriodes、欧文氏菌属Erwinia、醋弧菌属Acetovibrio、小双孢菌属Microbispora和链霉菌属Streptomyces等。纤维单胞菌C．firei和高温单胞菌T．f．sca是被广泛研究的两种产生纤维素酶的细菌。

(2)真菌：主要有白绢菌Sclerotiumrolfsii、白腐真菌P．chrysosporium以及木霉属Trichoderrna、曲霉属Aspergillus、裂殖菌属Schizophyllum和青霉属Penicillium等种属中的一些真菌，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌。世界纤维素酶市场中的纤维素酶20％是来自木霉属和曲霉属。

(3)放线菌：主要有链霉属，高温放线菌属和heremomonospora curvata等。

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2产纤维素酶的菌种选育

本实验选用里氏木霉发酵产纤维素酶。里氏木霉为好气菌，其菌落在PDA平板上生长快，菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生分生孢子呈深绿色产孢区常排列成同心轮纹状。菌落背面无色，有时呈浅黄色。菌丝透明，有隔，细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分支多，对生或互生二至三级分支，整体想树枝；分支与分生孢子梗近似直角，末端为小梗，小梗瓶行，分生孢子球形或长椭圆形，表面粗糙，布满小刺；单胞，靠粘液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。以里氏木霉为出发菌种，经初筛、复筛、诱变后，用液体深层培养发酵生产纤维素酶，里氏木霉发酵生产的是胞外酶，经过分离纯化后，就得到纯化的纤维素酶制剂。

2.1 里氏木霉的特性

里氏木霉能用于生产纤维素在于以下几种特性：

1、 里氏木霉生产纤维素产量高。而且可以通过物理或化学诱变产生

高产菌株；

2、 里氏木霉容易培养和控制。

3、 里氏木霉产纤维素酶的稳定性好，不易退化。 4、 里氏木霉产生的纤维素酶是胞外酶，容易分离纯化。

5、 其代谢物安全无毒，不会影响人员和环境，也不会对纤维素酶的

生产造成不良影响。

2.2培养基

2.2.1 筛选培养基

磷酸二氢钠0.1％。硫酸镁0.05％，硫酸铵1.5％。琼脂2.0％．纤维素粉0.5％～1.0％，pH值为5.8～5.9。 2.2.2刚果红纤维索培养基

刚果红纤维素培养基的配制见参考文献[6]。 2.2.3液体发酵培养基

种子培养基(1)：葡萄糖20 g／L、蛋白胨1 g／LMandels营养盐浓缩液100 mL／L、Mandels微量元浓缩液1.0mL／L、l mol柠檬酸缓冲液50mL／L。

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种子培养基(2)：用10 g／L微晶纤维素取代20g／L葡萄糖，其余成分与种子培养基l相同。

其中，Mandels营养盐浓缩液有：(NH4)2SO4 14 g／L、(NH2)2CO 3 g／L、KH2P04 20 g／L、CaCl2?2H2O 4 g／L、MgS04·7H2O0.2 g／L；Mandels微量元素浓缩液有：FeS04·7H：0 5 g／L、MnS04·H2O 1-6 g／L、ZnS04·7H2O1.4 g／L、CoCl2·6H2O3．7 g／L；lmol／L柠檬酸缓冲液：柠檬酸(C6H8O7·H2O)210 g，H2O 750 mL，加NaOH 78 g，冷却后测pH约为4．2，加水至l 000 mL，pH约为4．5。

2.3 菌种

木材厂土壤中筛选到l株产纤维素酶活较高的里氏木霉。

2.4酶活力测定

2.4.1酶活力的测定方法

取发酵液于5000dmin离心10min，上清液即为用于测定的粗酶液。取50 mg Whatman NO．1滤纸条(1 cmx6 cm)，加l mL 0．05 M柠檬酸一柠檬酸钠液冲液(pH值为4．8)，加入适当稀释酶液50μI。，50℃反应30 min，加入DNS终止反应．沸水浴5 min。测还原糖。以上酶活均扣除发酵液中的还原糖后计算酶活力。

2.4.2酶活力计算方法

1个滤纸酶活力国际单位(FPAIU／mL)定义为：酶解反应中每分钟生成1.0mol/L葡萄糖(以还原糖计)的酶量。 4.2.3计算公式

1个滤纸酶活力国际单位(FPAIU/mL)?葡萄糖量(mg)?1000?稀释倍数180(葡萄糖分子量)?30min(反应时间)?0.05mL(酶液)

2.3菌种筛选与鉴定

通过初筛．从土样中选取92株能够在以纤维素粉为惟一碳源的平板上生长旺盛的菌株。将纯化后的菌株点到刚果红鉴别培养基上进行复筛。选取透明圈较大的菌株10株。通过摇瓶液态发酵。测定酶活力，最终选取1株活力最高的霉菌(见图1)。菌种鉴定特征为：在察氏培养基上，肉眼观察菌落迅速蔓延。形成较薄的菌丝层，菌落初期为白色、平坦，后期因产生分生孢子而呈深绿色。产孢

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区常排列成同心轮纹状．菌落背面无色．有时也呈浅黄色。镜检菌丝透明、有隔、细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出、无色、分枝多，对生或瓦生二至三级分枝．整体像树枝；分枝与分生孢子梗近似自角，末端为小梗，小梗瓶形；分生孢子球形或长椭图形，表面粗糙，布满小刺，单孢，靠黏液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。据此初步鉴定为半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科木霉属里氏木霉。

2.4诱变处理

2.4.1诱变处理过程

诱变前培养：把经在PDA培养基培养7天的孢子，用含0.1%吐温-80的缓冲液冲洗下，并移接到液体完全培养基上培养一段时间。

孢子悬液制备：把上述培养液经离心后，加入生理食盐水或缓冲液制成孢子悬液，孢子浓度为10个/mL~10个/mL。

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物理诱变：把用生理食盐水制成的孢子悬液，移接到平面皿中，在无菌条件下在15W紫外灯下，进行诱变处理。

化学诱变：把用缓冲液制成的孢子悬液，转移到一无菌试管中，并加入化学诱变剂（NaNO2或NTG），在摇瓶机内30℃、200处理一定时间后，经离心加入缓冲液制成孢子悬液。

中间培养：把 0.5mL 经处理的孢子悬液移接到10 mL、一定量的2-脱氧葡萄糖（2-DG）的完全培养基试管中，150r/min、28℃培养48h，再移接到一定量的2-脱氧葡萄糖完全培养基的试管中，150r/min、28℃培养24h。

取一定量上述培养液进行表面皿分离鉴定。 2.4.2变异菌株的筛选

表面皿筛选：把经上述诱变的菌悬液，首先涂布在含有一定浓度的2-脱氧葡萄糖培养基表面，经28℃，7~10天倒置培养，把出现较大纤维素水解透明圈的菌落，作为表面皿筛选的优良菌种。

初筛：把经表面皿筛选出的菌落移接到 50m╳150mL的L型大试管中，经150r/min、28℃、5~6天摇瓶培养后，分别测定滤纸酶活和CMC酶活，并把酶活较高的菌株作为初筛优良菌株。

复筛：把L型试管初筛的优良菌株，移接到装液

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50mL的300mL三角瓶，经150r/min、28℃、6~8天摇瓶培养后，分别测定滤纸酶活和CMC酶活，把酶活较高的菌株作为复筛的优良菌株。

分离纯化：把产酶稳定性比较好的菌株，再经表面皿分离纯化，摇瓶筛选出酶活较高的菌株作为下次诱变的出发菌株或产酶生产菌株。

用同样的方法，反复诱变，可得到抗分解代谢物阻遏的纤维素酶高产突变菌株，同时液使得纤维素酶的活力有了较大提高。

2.5菌种保藏

菌种保藏的要点是：选择适宜的培养基﹑培养温度和菌龄,以便得到健壮的细胞或孢子；保存于低温﹑隔氧﹑干燥﹑避光的环境中，尽量降低或停止微生物的代谢活动，减慢或停止生长繁殖；不被杂菌污染，在较长时期内保持著生活能力。

本设计中里氏木霉采用沙土管法保藏。将沙或土过筛﹑烘干﹑装管﹑灭菌﹑然後将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀﹐放到盛氯化钙的干燥器里吸除水分﹐干燥後保存或用火焰封管後保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态﹐可保存较长时期。

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3培养基的优化

3.1产酶培养基

用10g/L微晶纤维素取代20g/L葡萄糖，加入吐温-80 1.0 mL／L，其余成分与种子培养基(1)相同，pH调至4．8。

3.2摇瓶种子培养

将50 mL原始菌种接种到种子培养基(1)的250 mL锥形瓶中，121℃，30 min灭菌。接种后，于28℃，200 r／rain震荡培养2.5-3d，培养液浑浊，作为种子液。

50 mL种子培养基2的250 mL锥形瓶中，121℃，30 min灭菌。吸取2.5mL种子液，接人装有50 mL种子培养基2的250 mL锥形瓶中，28℃、200 r／min培养2 d。

3.3产酶发酵培养

吸取2.5 mL种子液，接入装有50 mL产酶基础培养基的250 mL锥形瓶中，28℃、200 r／min下发酵培养。

3.4生长曲线的绘制

菌丝体干质量曲线：从接种开始，每隔1 d取样，菌丝烘干称质量，直至9 d，绘制该菌株生长曲线，了解其生长周期。细胞干质量的测定方法：取5 mL稀释到适当倍数的培养液，加入5 mL l mol／L高氯酸溶液，沸水浴20min，测OD260，得[A]；同上面方法测得接种前培养基测OD260，得[B]。

质量浓度(g／L)=0．65 ╳([A]一[B])。

滤纸酶活的曲线：从接种开始，每隔1 d取样，测定产酶基础培养基中单氏木霉产生的纤维素酶的滤纸酶活，直至9 d，绘制该菌株滤纸酶活曲线，了解其生长周期内产酶情况，以利于找到菌体生长周期中最大的产酶的时间。

3.5纤维素酶活力测定

(1)葡萄糖(G)标准曲线的制作

取8支洗净烘干的25 mL具塞刻度试管，编号后按表3加入标准葡萄糖(G)溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加人3 mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至25 mL，

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充分混匀。在540 nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。

(2)滤纸酶活力的测定根据Ghose推荐的方法测定滤纸酶活。一个酶活单位(IU)定义为50℃下每分钟水解底物生成1 μmol葡萄糖。

0．5行加入10 mm×60 mm的滤纸条(约50 mg)，50℃水浴中保温60 min，迅速加入3 mLDNS溶液，混匀，沸水浴5 min，取出置于冷水中冷却。加纯水至25 mL，混匀，以1号试管溶液为空白对照调零点，540 nm下测定2、3、4号试管液的光密度值(光密度值在0．2～0．8 log之间)，根据3个重复光密度的平均值，存标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按式4.2.3计算出滤纸酶活力(U／g)：

3.6培养基的优化方法

3.6.1最佳工业纤维素浓度的选择

分别以浓度为10、20、30、40、50、60 g／L的工业纤维素作为单一碳源，替代产酶基础培养基中的微晶纤维素，制备液体发酵产酶培养基，各取50 mL分装于250 mL锥形瓶中，做一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2．5 mL，接入上述培养基，28℃、160 r／min下培养24 h。

取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8 d的发酵液，用滤纸酶活力(FPA)法测定酶活，选取最佳工业纤维素浓度。 3.6.2最佳(NH4)2S04质量浓度的选择

以工业纤维素(浓度为30 g/L)为单一碳源，分别以浓度为8、10、12、14、16、18 g/L的(NH4)2S04。，制备液体发酵产酶培养基，各取50 mL分装于250 mL锥形瓶中，做一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2．5 mL，接入上述培养基，28℃、200 r／min下培养24 h。

取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8 d的发酵液，用滤纸酶活力(FPA)法测定酶活，选取最佳(NH4)2S04浓度。 3.6.3最佳Mandels营养盐浓缩液浓度的选择

选取浓度为30 g／L工、Ip纤维素为单一碳源，浓度为12 g／L的(NH4)2S04。，分别吸取50、75、100、125、150、175、200 mL的Mandels营养盐浓缩液，制备液体发酵产酶培养基，各取50 mL分装于250 mL锥形瓶中，做

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一组平行，灭菌后待用，吸取培养好的种子液2.5mL，接人上述培养基，28℃、200 r／min下培养24 h。

取培养时间1、2、3、4、5、6、7和8 d的发酵液，用滤纸酶活力(FPA)法测酶活，确定最佳Mandels营养盐浓缩液浓度。 3.6.4结果与分析 3.6.4.1葡萄糖标准曲线

根据不同浓度葡萄糖下测定的光密度值数据以葡萄糖含量(mg)为横坐标，对应的光密度值为纵坐标，绘出葡萄糖标准曲线，如图3-1所示。

图3-1 葡萄糖标准曲线

3.6.4.2生长曲线

菌丝体干质量曲线：从接种开始，每隔l d取样，菌丝烘十称质量，直至9 d，以培养天数(d)为横坐标，对应的菌体干质量(mg)为纵坐标，绘制该菌株生长曲线，了解其生长周期，绘制细菌生长曲线，如图3-2所示。

滤纸酶活的曲线：从接种开始，每隔l d取样，测定产酶基础培养基中纤维素酶的滤纸酶活，直至9 d，以培养天数(d)为横坐标，对应的滤纸酶活(U·mL-1)为纵坐标，绘制该菌株滤纸酶活曲线，如图3-3所示。

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图3-2 菌株生长曲线

图3-3 菌株产酶曲线

3.4.6.3最佳工业纤维素浓度的选择结果

在其他条件不变的情况下，以不同工业纤维素浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以工业纤维素浓度(g／L)为横坐标，对应的滤纸酶活(U·mL-1)为纵坐标，绘制图3-4。

由图3-4可知，其他条件不变的时候，工业纤维素含量为30 g／L，在5d时滤纸酶活达到最高，所以确定工业纤维素的最佳浓度为30 g／L。

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图3-4 不同工业纤维素浓度下的滤纸酶活

3.4.6.4最佳(NH4)2S04浓度的选择结果

在其他条件不变的情况下，以不同(NH4)2S04浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以(NH4)2S04浓度(g/L)为横坐标，对应的滤纸酶活(U·mL-1)为纵坐标，绘制图3-5。

由图3-5可知，其他条件不变的时候，(NH4)2S04浓度为12 g／L，在5d滤纸酶活达到最高，所以确定(NH4)2S04最佳浓度为12 g／L

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图3-5 不同(NH4)2S04浓度滤纸酶活

3.4.6.5 最佳Mandels营养盐浓缩液浓度的选择结果

在其他条件不变的情况下，以不同Mandels营养盐浓缩液浓度，对各个时间段滤纸酶活绘制曲线，以Mandels营养盐浓缩液浓度(mL／L)为横坐标，对应的滤纸酶活(U·mL-1)为纵坐标，绘制图3-6。

由图3-6可知，其他条件不变的时候，Mandeis营养盐浓缩液浓度为150 mL／L，在5 d时滤纸酶活达到最高，所以确定Mandels营养盐浓缩液最佳浓度为150 mL／L。

3.4.6.6正交试验结果与分析

根据单因素实验得到的各因素最优浓度，选取各因素上下共3个因素水平，利用正交试验设计软件设计正交试验，并记录该条件下滤纸酶活。根据记录的数据分别进行正交试验直观分析(极差分析)、方差分析。根据R值的大小可知，3个因素的主次顺序为：工业纤维素>(NH4)2S04>Mandels营养盐浓缩液。比较各因素不同水平的平均效果值知道本正交试验最优组合为30 g／L工业纤维素、12g/L (NH4)2S04、150 mL／L Mandels营养盐浓缩液效果较好。

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4培养基的灭菌

4.1微生物的热死灭动力学方程

实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动

?dNdt?k?N?1?力学，即：

N：任一时刻的活细菌浓度（个/L） t：时间（min）

lnNN0??K?t?2?K：比热死速率常数（min-1）取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得

N?N0?e?Kt?3?或

图4-1

实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120?C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。

4.2温度对K的影响

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微生物的热死灭动力学接近一级反应动力学，它的比热死灭速率常数K与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征

K?A?e??E/RT?4? A：频率因子（min-1） ΔE：活化能（J/mol）

R：通用气体常数[J/（mol.k）] 从方程（4）可以看出：

（1）活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件相同时，ΔE越高，K越低，热死速率越慢。

（2）不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。 对方程（4）两边取对数，得方程（5）

lnK???ERT?lnA?5?

图4-2

dlnKdT?ER?T2??6?K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与有关，对方程（5）两边对T取导数，得方程（6）。由方程（6）可得出结论：反应的ΔE越高，lnK对T的变化率越大，即T的变化对K的影响越大试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而某些有效成分热破坏反应的ΔE较低（见下表）。将温度提高到一定程度，会

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加速细菌孢子的死灭速度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少。

表4-1

受热物质 维生素B12 维生素B1盐酸盐 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 肉毒梭菌孢子 枯草杆菌孢子

ΔE（J/mol） 96232 92048 283257 343088 317984

如嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的ΔEBS =67000× 4.184（J/mol），维生素B1的ΔEVB=22000× 4.184 （J/mol），将灭菌温度从105?C提高到127?C，KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min-1），KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min-1）。

图4-3 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和维生素B1的lnK-1/T图

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响

灭菌温度（?C）

达到灭菌程度的时间（min）

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维生素B1的损失（%）

100 110 120 130 140 150

843 75 7.6 0.851 0.107 0.015

表4-2

99.99 89 27 10 3 1

4.3湿热灭菌

在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌广泛采用湿热灭菌法。在工厂或实验室，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，湿热灭菌法是一种简单而又廉价、有效的灭菌方法。在利用蒸汽进行灭菌的过程中，由于冷凝时会释放出大量的潜热并具有强大的穿透能力，在高温及存在水分的条件下，微生物细胞内的蛋白质极易变性或凝固而引起微生物的死亡。如果培养基中含有大量的不耐热 （敏感性）微生物和相当数量的耐热性（芽孢）微生物则灭菌是微生物的残留变化可成为图 1 所示的情况从图 1 可知，如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时

残留的活微生物等于 0，则灭菌所需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的。考虑到灭菌时间对培养基营养成分的破坏，最常用的灭菌条件是 12℃，20 ～ 30 min。 4.3.1无菌的标准

根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。在此工程设计中取N=10-3。 4.3.2连续灭菌

连续灭菌也叫连消，就是将将配制好的并经预热（60～75℃）的培养基用泵连续输入由直接蒸汽加热的加热塔，使其在短时间内达到灭菌温度（126～132℃）。然后进入维持罐（或维持管），使在灭菌温度下维持5～7分钟后再进入冷却管，使其冷却至接种温度并直接进入已事先灭菌（空罐灭菌）过的发酵罐内。其过程均包括加热、维持和冷却等灭菌操作过程。培养基的冷却方式有喷淋冷却式、真空冷却式、薄板换热器式几种方式。 连续灭菌的基本设备一般包括：

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①配料预热罐，将配制好的料液预热到60-75℃，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温差过大而产生水汽撞击声；

②连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132）℃；

③维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；

④冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50℃后，输送到预先已经灭菌过的发酵罐内。

图4-4

连续灭菌流程图

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5种子扩大培养

种子扩大培养简称种子扩培是发酵工程的一个组成部分，其实指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。 其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。

5.1种子制备

（1）母瓶制备：从保藏的沙土管中无菌操作接种适量沙土于处理好的斜面上，28℃培养7-10d。孢子成熟后立即放入4℃冰箱备用，保存期不可超过1个月。

（2）子瓶制备：无菌操作从母瓶中选取孢子丰满的菌落5-7个，放置3mL无菌水中制成悬液，然后取1满环孢子悬液接种于已处理好的斜面上，28℃培养7-8d，孢子成熟后即可使用。子瓶菌落要求成片，孢子布满整个斜面。4℃冰箱中存放不能超过1个月。

（3）种子罐种子制备：发酵液的体积为500×70﹪=350L，取1﹪接种进发酵罐，则需要种子的体积为350×1﹪×1000=3.5L。取10L的种子发酵罐进行培养将上述的揺瓶种子的种子全部接入其中培养2-3.5天。然后接入发酵罐进行工业发酵。确证无污染后，按 1%接种量接入28℃的液体发酵培养基。

5.2车间种子制备

本实验采用二级种子罐，三级发酵进行种子的扩大培养。

将生产菌种的孢子悬浮液用微孔接种法接入种子罐进行扩大培养，种子罐之间的转接采用压差接种法，种子罐接入发酵罐也采用压差接种法。

里氏木霉的接种量为1﹪。种子罐大小为10L。

种子罐培养的目的是使孢子发芽并使种子量增大，以缩短发酵罐的发酵延滞期。

一级种子罐的装液为70%，在121°C灭菌30min后，冷却至40°C以下。将种子接入50mL培养基摇瓶搅拌转速250-300 r/min，通风量0.2-0.3m3/h条件下培养。

36h后转移到10 L二级种子罐中，在温度28-30℃，搅拌转速250-300 r/min，

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通风量0.2-0.3m3/h条件下增殖。灭菌、装罐、发酵与以及种子罐类似。

由图1知，里氏木霉在10 L发酵罐中的增殖曲线符合微生物的增殖规律，接种量为0.5%的里氏木霉接入10 I培养基中，经过2-3h的迟滞期，菌体细胞即进入对数生长期，在4-28h内菌体细胞呈对数增长，菌体干重(单位体积)从0.05 g迅速提高到3.08 g,28 h后菌体进入生长较慢的稳定期，增殖培养36 h,培养基中葡萄糖浓度从初始的10.0 g/L降至1.2 g/L，菌体干重从0. 02g上升到3.5g

5.3 发酵过程

本设计采用补料-分批发酵。目的是使里氏木霉增殖并产生大量纤维素酶。发酵接种量为0.1%，发酵管体积为500L,共有5个发酵罐,发酵周期为7d。发酵期间，pH在5.5左右，温度温度在28℃，通风量0.2-0.3m/h。每隔一定时间要取样进行生化分析、镜检和无菌检验。分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。

3

21

由图2可知，里氏木霉在500L发酵罐中以纸浆为碳源间歇产酶，30 g／L工业纤维素、12g/L (NH4)2S04、150 mL／L Mandels营养盐浓缩液时，完成一个产酶周期需5.5d，滤纸酶活力和纤维二糖酶活力分别为2.15FPIU/mL和0.20 IU/mL，酶产率和酶得率分别为16.3FPIU/(L·h)和143.3 FPIU(每克纸浆)，与摇瓶产酶结果相似。里氏木霉合成纤维索酶主要发生在产酶中后期，随着纤维索酶的合成与分泌，产酶液中蛋自质浓度随着滤纸酶活力的增加而提高，产酶结束时，蛋自质浓度达0. 70 mg/mL.

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6发酵设备选取及物料衡算：

6.1发酵罐的工艺尺寸

常用的机械通风发酵罐的结构和主要几何尺寸已标准化设计（见附图二）。 其几何尺寸比例如下：

H0/D=1.7～3.5 H/D=2～5 d/D=1/3～1/2 W/D=1/12～1/8 B/D=0.8～1.0 h/D=1/4

发酵罐大小用公称体积表示，V0=∏D2×H/4+0.15D3 其中：H0-发酵罐圆柱形筒身高度

D-发酵罐内径 H-罐顶到罐底的高度 D-搅拌器直径 W-挡板宽度

B-下搅拌器距罐底的距离 S-搅拌器间距

h-底封头或顶封头高度 发酵罐的计算:

本设计是年产1吨的纤维素酶工艺设计。一种纤维素酶的发酵周期为约为7天(菌体生长36h左右，在54、72、84h时添加纸浆和硫酸铵，约第5天时调节ph)，产生滤纸酶活力和纤维二糖酶活力分别达3. 90 FPIU/mI和0. 35 IU/mL,酶产率和每克纸浆酶得率达23.2 FPIU/(I·h)和141. 8 FPIU。69.6经过一个周期可以产酶约232g/L本设计采用5个50L的二级发酵罐,装料系数为75%。

一年放罐次数：200/7≈29次 总提取率为：90%×90%×95%=76.95%

发酵液量V1：V1=106÷232÷76.95%÷75%=7468 (L) 假设用一台发酵罐，则发酵罐的体积V=5601/29=257L 所以选用5个V0=50L发酵罐

由V0（公称体积）=Va（筒身容积）+Vb（底部）≈πDH0/4+0.15D得 则:D=287（H0=2.5D）cm

2

3

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那么：H0=2.5D=2.5×287=717.5 mm H=3D=3×287=861 mm

d=D/2=0.5×287=143.5 mm W=D/12=287/12=23.9mm B=0.9D=0.9×287=258.3 mm S=2d =2×143.5=287mm h=D/4=287/4=71.75mm

液面高度HL=0.7(H+h)=0.7×(861+71.75)=652.925mm 转速340r/min 电机功率0.55KW

径高比为3，初始水温14℃

6.2物料横算

本系统采用5个发酵罐，每个为50 L，纤维素酶产量为232g/L, 发酵液预处理收率约为90%，提取时收率约为95%，浓缩干燥收率为90%，装料系数为75%。

每批5个发酵罐在一个发酵周期纤维素酶产量为： 232*50*5**90%*95%*90%*0.75=33273.25g=33.3kg 5个发酵罐1年产量为: 33.3*29=965.7

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7下游加工

下游加工是得到纯度较高的物质所比不可少的步骤，一般可分为以下步骤：培养液(发酵液)的预处理；固液分离；初步纯化(提取)；高度纯化(精制)；成品加工。

7.1分子筛层析

葡聚糖凝胶Sephadex G - 100充分膨胀,装柱 (Φ1.6 cm×100 cm ) ,用pH 4.8, 0.02 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液平衡,上样量为15 mL ,流速为15 mL / h,每20 min收集1管

7.2离子交换层析

将弱阴离子葡聚糖凝胶DEAE Sephadex A -50膨胀装柱,用pH 5.8，0.02 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡后上样,用0.05 mol/L NaCl梯度洗脱,收集活力峰。

在分子筛层析过程中出现了5个蛋白峰,其中峰 Ⅱ检测到 β-葡萄糖苷酶活,峰 Ⅳ和峰 Ⅴ检测到了内切酶活,将内切酶活力部分和 β-葡萄糖苷酶分别收集合并浓缩,各自经过离子交换层析后,共得到了5个纤维素酶组分 (见图7-1).黄绿木霉的纤维素酶系纯化得到了EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ3个EG组分和BGⅠ、BGⅡ2B 组分.

图7-1 纤维素酶各组分的SDS - PAGE电泳图谱

7.3 酶活力测定

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7.3.1温度对酶活力的影响

图7-2显示各酶组分的最适酶反应温度.EG I、EG 11和EGll这3种EG酶的最适温度是60 0C; B G I和BGII这2种BG酶的最适温度是55 ℃。这5种纤维素酶组分都有较高的温度稳定性，比较这5种组分的温度稳定性，BG I >BGII>EGI >EG1ll>EG11.可能纤维素酶的糖基对于纤维素酶有一定的保护作用.

图2 温度对纤维素酶活的影响

7.3.2 pH对酶活力的影响

pH对各酶组分的影响见图7-3,EGⅠ,EGⅡ,EGⅢ, BGⅠ和BCTⅡ这5种纤维素酶组分的最适pH都是5，当pH为3和7时，纤维素酶的残余酶活力基本上都已经很低.说明这些组分作用的pH范围都比较窄.酶pH稳定性顺序为:EG I> EGⅢ>EGⅡ;BCT I >BCTⅡ.

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图3 pH对纤维索酶活的影响

7.4浓缩

纤维素酶采用超滤浓缩。超滤膜及其组件确定后，根据超滤膜浓缩原理、影响因素以及酶的生物特性，为保证酶活力的前提下最大限度地提高碱性纤维素酶的收率，在工艺流程中从以下方面采取了一定措施。

1. 采用低温超滤以减少酶失活，选用具有冷却装置的循环罐。

2.为避免经过泵的剪切力使酶失活， 使用剪切力泵代替离心泵，如采用工业软泵等；

3.配置稀碱和醋酸罐，以便调节pH

4.酶液循环管口需由上部向下插入循环罐液面，避免产生泡沫。

7.5低温结晶

浓缩液在5℃下静止2-6h；得到纤维素酶的粗晶体。

7.6分离、洗涤

用等体积的乙酸乙酯洗涤，再用食盐加柠檬酸钠洗一次，最后用乙酸乙酯顶洗一次得纤维素酶的湿晶体。

7.7干燥磨粉

在70-80℃下进行气流干燥，再用10-20磨球机磨粉120目过筛即可得到纤维素酶的成品。

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参 考 文 献

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