六味地黄丸微生物限度检查检验方法验证方案(2015年度出版)

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文件 湖北****药业有限公司

本文件为受控文件，仅限湖北****药业有限公司内部使用。未经授权，不得使用、泄露或拷贝！ 1 1.概述 1.1六味地黄丸（浓缩丸）是中国药典品种，批准文号：国药准字Z42020681，其处方由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成，具有滋阴补肾之功效，用于肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴。有效期：36个月。

1.2根据剂型与产品处方判断，六味地黄丸（浓缩丸）的微生物限度检查内容应包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，以及大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌检查；根据六味地黄丸（浓缩丸）的成分和历史验证数据分析，该产品无明显的抑菌活性，拟采用“平皿法”进行微生物限度检查，采用“常规法”进行控制菌检查。

2.目的

确认所采用的方法适用于该产品的微生物计数，以确保测定方法的可靠性，确保检验结果的准确可靠。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。

3.依据

《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”、“非 无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、“非无菌产品微生物限度标准”。

4.范围

本验证方案适用于公司六味地黄丸微生物限度检查检验方法的适用性试验。

5.职责

5.1验证领导小组

5.1.1负责验证方案的审批。

5.1.2负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。

5.1.3负责验证数据及结果的审核。

5.1.4负责验证报告的审批。

5.1.5负责发放验证证书。

5.2质量部

5.2.1负责验证所需的培养基、样品、菌液、缓冲液等的准备。

5.2.2负责取样及对样品的检验。

5.3项目验证小组

5.3.1负责拟订验证方案。

5.3.2负责验证方案的实施和收集各项验证试验记录，并对试验结果进行分析后，起草验证报告，报验证领导小组。

6.验证实施条件

* *

6.1验证方案培训：在验证实施前，应对参与验证的人员进行验证方案以及与验证相关的文件进行培训，确保相关人员掌握了验证的相关要求与知识。

6.2微生物限度检测室：检验所使用的检测室应经过HVAC系统确认，并符合要求。

6.3检验用水：验证过程使用的纯化水其制备系统应经过确认并符合要求，纯化水质量应经过检验并符合《中国药典》2015年版二部的要求。

6.4检验仪器设备：验证涉及的检验仪器（设备）与检验方法，应经过技术监督局校验合格或者公司确认/验证合格。

6.5培养基：验证所使用的培养基应经过培养基的适用性检查，其结果符合《中国药典》的相关要求。见附件2:培养基确认。

6.6验证菌种：验证所使用的菌种，其种类与传代次数应符合《中国药典》的相关要求。菌种情况见附件3:菌种确认。

7.合格标准

7.1在需氧菌、霉菌及酵母菌计数的三次独立平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

7.2在控制菌检查的试验中试验组应检出试验菌，阳性对照组应检出试验菌，阴性对照组不得检出试验菌。

8.验证方法

8.1菌液制备：

8.1.1取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物各1ml,分别加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释至10-5-10-7。取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

8.1.2取1ml上述制备的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液分别注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

8.1.3、取1ml上述制备白色念珠菌、黑曲霉菌液注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

8.1.4结果：见附件4:菌液浓度确定。

8.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验

8.2.1供试液制备：称取供试品10g,用胰酪大豆胨液体培养基稀释至100ml，用匀浆仪等适宜的方法混匀，制成1:10供试液。

8.2.2试验组：吸取1:10的供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌悬液后摇匀。

* *

8.2.3菌液对照品：吸取稀释液胰酪大豆胨液体培养基9.9ml ，共5份，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。

8.2.4试验组和菌液对照组摇匀后，分别从所有试验菌试管中吸取1ml 注入直径90mm 的平皿中，倾注胰酪大豆胨固体培养基；另分别吸取白色念珠菌1ml 注入直径90mm 的平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；平行2份。

8.2.5供试品对照组：吸取1:10的供试液1ml 注入直径90mm 的平皿中，平行四份，其中两个平皿中注入胰酪大豆胨琼脂培养基，另两个注入沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇匀。

8.2.6将以上平皿分别置30～35℃或20～25℃培养，需氧菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。

8.2.7计算公式：

25.0-=-菌液对照组菌落数供试品对照组菌落数试验组菌落数

* *

8.2.8试验结果：

8.2.8.1见附件5:需氧菌总数计数方法适用性检查结果

8.2.8.2附件6:霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果

8.3控制菌检查

8.3.1大肠埃希菌

8.3.1.1供试液制备：同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验”供试液制备。

8.3.1.2试验组：取1：10供试液10ml和≤100cfu大肠埃希菌菌液加入100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h；取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48h；取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72h。

8.3.1.3阳性对照：取≤100cfu大肠埃希菌菌液加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中，其他同试验组。

8.3.1.4阴性对照：取100ml胰酪大豆胨液体培养基，30～35℃培养18～24h；其他同试验组。

8.3.1.5结果：见附件6:大肠埃希菌方法适用性检查结果

8.3.2沙门菌

* *

8.3.2.1供试液制备：同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验：供试液制备。

8.3.2.2试验组：

8.3.2.2.1取供试液10ml和≤100cfu乙型副伤寒沙门菌菌液，加入200ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h。

8.3.2.2.2取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，30～35℃培养18～24h。

8.3.2.2.3取少量RV沙门增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48h。

8.3.2.3阳性对照：取≤100cfu乙型副伤寒沙门菌试验菌液，加入200ml胰酪大豆胨液体培养基。其他同试验组。

8.3.2.4阴性对照：取200ml胰酪大豆胨液体培养基，30-35℃培养18-24h。其他同试验组。

8.3.2.5结果：见附件7:沙门菌方法适用性检查结果

8.3.3.耐胆盐革兰阴性菌

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8.3.3.1供试液制备：称取供试品10g,用胰酪大豆胨液体培养基稀释至100ml，用匀浆仪等适宜的方法混匀，制成1:10、1:100、1:1000的供试液，20～25℃培养2h。

8.3.3.2试验组：取10ml/支肠道菌增菌液体培养基3支，分别加入上述预培养的1:10、1:100、1:1000的供试液各1ml，和≤100cfu大肠埃希菌菌液，混匀，30～35℃培养24～48h；取上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，30～35℃培养18～24h。

8.3.3.3阳性对照：取≤100cfu大肠埃希菌菌液加入10ml/支的肠道增菌液体培养基中，混匀，30～35℃培养24～48h；其他同试验组。

8.3.3.4阴性对照：取1支肠道增菌液体培养基10ml管，加入胰酪大豆胨液体培养基1ml，混匀，30～35℃培养24～48h；其他同试验组。

8.3.3.5结果：见表9:耐胆盐革兰阴性菌方法适用性检查结果。

8.3.3.6结论：三个批次样品，试验组均：□检出，□未检出试验菌；阳性对照组均：□检出，□未检出试验菌；阴性对照组均：□检出，□未检出试验菌，拟定该产品耐胆盐革兰阴性菌检查采用法进行检查。

8.3.3.7结果：见附件9:耐胆盐革兰阴性菌方法适用性检查结果

9.异常情况与偏差处理：当出现偏差时，应按《偏差处理管理规程》进行处理。

10.验证结果评定、结论与建议

验证小组组长负责收集各项验证、试验记录，根据验证、试验结果对验证效果进行综合评审，起草验证报告、做出验证结论。对验证结果的评审应包括一下内容：

10.1验证试验是否有遗漏？

* *

10.2验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？

10.3验证记录是否完整？

10.4验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需要进一步补充试验？

11.附件

11.1 附件1:验证实施条件确认

11.2 附件2:培养基确认

11.3 附件3:菌种确认

11.4 附件4:菌液浓度确定

11.5 附件5:需氧菌总数计数方法适用性检查结果

11.6 附件6:霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果

11.7 附件7:大肠埃希菌菌方法适用性检查结果

11.8 附件8:沙门菌方法适用性检查结果

11.9 附件9:耐胆盐革兰阴性菌方法适用性检查结果

11.10 附件10:验证结果审批表

附件1：设施设备验证确认

确认人：确认日期：

* *

附件2：培养基确认

确认人：确认日期：

附件3：菌种确认

确认人：确认日期：

结论：

根据要求，菌数要控制在每1ml中含菌数在≤100cfu，因此，我们确定菌液制备：

铜绿假单胞菌：稀释金黄色葡萄球菌: 稀释大肠埃希菌：稀释

枯草芽孢杆菌: 稀释白色念珠菌（胰酪）: 稀释白色念珠菌（沙氏）: 稀释黑曲霉（胰酪）：稀释黑曲霉（沙氏）：稀释

* *

附件5:需氧菌总数计数方法适用性检查结果

供试品对照组：

胰酪大豆胨琼脂培养基：（）CFU/平皿1，（）CFU/平皿2

阴性对照组：

附件6:霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果

供试品对照组：

沙氏葡萄糖琼脂培养基：（）CFU/平皿1，（）CFU/平皿2

阴性对照组：

附件7:大肠埃希菌方法适用性检查结果

附件8:沙门菌方法适用性检查结果

附件9:耐胆盐革兰阴性菌方法适用性检查结果

* * 附件10:验证结果审批表

附件11：人员培训记录

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/d85l.html