【整理总结】关于MTT实验总结--心血啊

【整理总结】关于MTT实验总结－－心血啊！

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 MTT

步骤如下：

1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.

2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS <ph=7.4>配)20ul.

继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

注意事项：

（1）选择适当得细胞接种浓度。

（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓

度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025

有一个公式可供参考; lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm:lg 最大剂量 I:lg(最大剂量/相临剂量) P:阳性反应率之和 Pm:最大阳性反应率 Pn:最小阳性反应率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 例：

用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。

一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显.

呵呵，写得不错，顶一个

谢谢楼主辛苦了～

写的好，谢谢

楼主说细胞放进９６孔板后培养３～５天，这样好象不行，细胞经过那么长时间的生长早就长满了，会产生细胞之间的生长抑制，我觉的细胞再生长一天就可以了，还有利用酶标仪测定５７０nm处的光密度OD值也可以．

多谢楼主的辛勤劳动。

我是新手想做MTT和IC50。请同行多指点

感谢，共同努力！

不错,正好用的上.

呵呵，貌似不是你的心血？网上到处都是

不错，很有帮助！

我觉得就算网上到处都是,楼主也是将好的经验和大家分享,这就是我们园子所倡导的我帮人人,人人帮我啊!还是要感谢楼主工作的!

八错！

谢谢楼主了

不错不错~辛苦啦

谢谢楼主！

致谢 ！！

要学习一下 谢谢LZ

不易！

对于我这种新人来说真是太好了!我长本事后也要这样！嘿嘿 谢谢搂主！

"MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系"请问搂主你这是针对波长490而言还是对所有的波长而言呢 我的测定值就有1以上的，是不是不对啊

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