天然药物提取分离技术实验指导

金华职业技术学院实验教学大纲

一、课程名称：天然药物提取分离技术

课程性质：必修课，面向专业：生物制药，课程总学时：16学时 二、实验的地位、作用和目的

天然药物提取分离技术实验教学是天然药物提取分离技术课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握天然药物有效成分提取、分离和鉴定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力，养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。 三、基本原理及课程简介

天然药物提取分离技术实验中选择天然药物中几个具有代表性的成分类型作为研究对象，实验内容包括单体成分的提取、分离、鉴定等过程。通过这些实验使学生继续巩固基本操作技能，灵活应用于其他天然药物成分的分离。学生自己查阅有关文献，对具体的实验内容、条件提出合理建议，培养学生分析问题、解决问题和独立工作的能力。 四、实验方式及基本要求

带习老师讲述实验原理、流程和注意事项等，由学生每人单独操作完成实验，要求学生以科学的态度和科学的作风进行实验，掌握天然药物生物活性成分的提取、分离纯化及鉴定能力，学习衍生物制备的手段及应用。 五、实验报告

实验报告要求学生以原始记录为基础，书面形式详实叙述每次实验的目的、原理、操作过程、现象和结果等，并以讨论的形式如实叙述实验过程中发现的问题、个人的体会、以及实验应注意的问题等。每次实验报告应包含以下内容：实验题目、实验目的、实验原理、实验内容、实验结果、以及讨论。 六、考核及考试

本实验以学生的预习报告、原始记录、实验操作、科学作风及实验报告做为考核标准。

七、基本设备与器材配置

烘箱，磁力搅拌，电热套，电炉，紫外分析仪，旋转蒸发仪，真空泵，红外干燥箱，电子秤，冰柜 八、实验项目及内容提要

1．槐花米中芦丁的提取分离与鉴定

a.预试； b.苷的碱提取、酸沉淀； c. 产品的精制； d苷的水解；e.苷、苷元的定性鉴定；f. 糖的纸层析鉴定准备；g.苷的乙酰化物的制备及熔点测定；h.苷、苷元的TLC鉴定；i. 糖的纸层析鉴定 2.大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

a.预试； b.氯仿浸提； c. 产品的精制； d蒽醌类化合物的定性鉴定；e.蒽醌化合物的TLC鉴定；h. 蒽醌纸层析鉴定 3．汉防己生物碱的提取分离与鉴定

a.预试；b.酸提取、碱沉淀；c.洗、烘砂80克；d.抽滤提取物，拌砂后烘干；e.铺板；f.萃取亲酯性叔胺总碱，重结晶；g.生物碱的TLC鉴定

实验一 槐米中芦丁的提取及鉴定

一、概述

芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。

芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。

芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。 二、实验目的和要求 1、实验目的

① 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 ② 通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 ③ 了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 2、要求： 要拿到芦丁化合物。 三、实验方法：

（1）芦丁的提取与分离（见下图）

槐花米粗粉（20g）置500ml烧杯中，加水300ml，在搅拌下加入石灰乳（1~1.5g），调至PH8~9，加热至微沸，保持30min，趁热抽滤。残渣滤液在60~70℃下用浓盐酸调至PH4~5，精置1hr,抽滤。滤液沉淀（粗制芦丁）重结晶将沉淀悬浮于蒸馏水中，加热煮沸15min，趁热过滤残渣滤液充分静置后过滤，60~70℃下干燥芦丁（精制品）

芦丁的提取与分离流程图

（2）芦丁的鉴定 ① 芦丁的定性反应

取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验：

A. 取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。

B. 取上述溶液1~2ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。 C. 取上述溶液1~2ml，然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。 ② 芦丁水解后糖与苷元的鉴定

A. 水解方法：精密称取芦丁1g（±0.01g），加1%硫酸100ml，加热40min，放冷静置，过滤。所得沉淀用少许水洗除酸，干燥称重，计算苷元与糖的重量比。然后用乙醇（95%大约10ml）进行重结晶，即得苷元。

B. 苷元的鉴定：用纸色谱法与对照品对照。 四、实验指导

1．本实验讲解要点及注意事项

① 芦丁提取方法，重点介绍碱-酸法的原理及注意事项。 ② 定性实验的目的、意义及注意事项。 2．实验报告要求

① 碱-酸法提取芦丁的原理 ② 定性反应的反应机理 ③ 详细记录定性反应结果

④ 绘制色谱结果模拟图，并计算Rf值 3．思考题

① 苷类结构的检识大体程序如何？ ② 苷类水解有几种催化方法？

③ 怎样确定芦丁结构中糖基是连接在槲皮素3-O-上？ ④ 怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖基一个鼠李糖？ ⑤ 苷元的结构是怎样确定的？ ⑥ 怎样确定苷键的构型？

⑦ 芦丁的全乙酰化物的制备与苷元乙酰化物（槲皮素）的制备有何不同？为什么？

试验二 大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定

一、概述

大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。 自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L），大黄（R. officinale Baill）及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：

OHOOHR1OR2 晶 形 黄色针晶 橙色针晶 素

橙色细针晶 砖红色针晶 金色片状结

晶

熔 点 318~320℃ 256~257℃ 206~208℃ 207℃ 196℃

R1 -H -H

R2 名 称

大黄素(Emodin)

荟

大

黄

(Aloe-emodin)

-COOH 大黄酸(Rhein) -CH2OH 芦

-CH3 -OH

-CH3 - -H

-CH3

大黄素甲醚(Physcion) 大黄酚(Chyrsophanol)

大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH，酸性最强；大黄素连有β-OH，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH3和-CH3，后者只连有-CH3，因而后者酸性排在第四位。 二、实验目的和要求

1．学习缓冲纸色谱的基本操作技术，并能根据色谱结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案。

2．掌握PH梯度法的原理及操作技术。

3．通过磷酸氢钙柱色谱分离大黄酚及大黄素甲醚的试验，进一步熟悉柱色谱操作技术。

4．学习蒽醌类化合物鉴定方法。 三、实验方法

1．大黄总蒽醌苷元的提取

黄色沉淀为止，抽滤收集沉淀，顺次以少量水乙醚洗涤，乙醇重结晶，得汉防已甲素苦味酸盐，mp 235~242℃（dc）。 2．有机胺碱的TLC

吸附剂：青岛海洋化工厂薄层层析硅胶G，用0.3%CMC-Na水液制板，110℃活化1小时。

样品：分出的汉防已甲素①、乙素②、总碱③ 展开剂：环己烷- EtoAc-NHEt2（6：2：1）

显色剂：改良碘化铋钾试剂（展开后用电吹风吹干再喷显色剂，以免二乙胺干扰）

现象：甲素显色后呈淡棕色，2小时左右就褪色，而乙素呈棕色，久置不褪色，可帮助其辨认。

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