原料药中有机杂质研究与控制

原料药中有机杂质研究与控制——综述

1.1 前言

随着公众和媒体对药物安全性的日益关注，控制药物中的杂质已成为药品质量控制中的重要问题。人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)已经制定了与杂质控制相关的切实可行的指导原则[1]，其基本理念已经逐步被国际社会接受。目前，英国药典(BP)[2]、欧洲药典(EP)[3]和美国药典(USP)[4]均在附录中设有专门的杂质检查通则；中国药典(ChP) [5]二部从ChP(2005)开始，附录中开始设有“药物杂质研究指导原则”；2005年国家食品药品监督管理局(SFDA)发布了《化学药物杂质研究的技术指导原则》[6]；之后，2007年又颁布了《药品注册管理办法》，在药品注册审评过程中，对药品中的杂质评价都予以高度重视，极大地促进了药品质量的提高。

1.2 原料药中杂质控制理念的变迁

原料药(化学药物)中所含有的杂质，按照《化学药物杂质研究技术指导原则》定义是指任何影响药物纯度的物质。其杂质一般分为三类：有机杂质、无机杂质和残留溶剂，是包括工艺中引入的杂质和降解产物。无机杂质是指在原料药及制剂生产或传递过程中产生的杂质，包括：反应试剂、配位体、催化剂、重金属、无机盐等。残留溶剂是指在原料药及制剂生产过程中使用的有机溶剂。对于无机杂质和残留溶剂，各国药典都收载了经典、简便、有效的检测方法，故可采用药典的相关方法对其进行控制。而有机杂质因其化学结构一般与活性成分类似或具渊源关系，故又称为有关物质。由于有机杂质其产生的途径与工艺流程密切相关，且可能产生毒副作用，从而给原料药本身在药物使用的安全性和有效性方面带来诸多影响，所以各国药品监督部门在对原料药的质量标准制定上，均对有机杂质的控制予以高度重视，并随着新测试仪器的开发利用、分析技术水平的提高，不断地对有机杂质的分析与控制提出更高的要求。下文中所提“杂质控制”均指有机杂质的控制。

追溯人们对药品中杂质控制理念的变迁，可概括为三个主要阶段：主成分纯度控制阶段、非确定性杂质限度控制阶段和确定性杂质定量限度控制阶段。

早期的药物质量控制主要基于容量法、分光光度法等经典的化学分析方法，

对杂质的控制主要是通过对测定与药品的主成分纯度相关的特征物理化学指标控制间接实现的，如测定双醋炔诺醇的紫外光谱中236nm处的吸收值，当加入3,5-双烯杂质时，此处吸光值会随着杂质量的增加而增大。此阶段，由于分析方法的局限性不能将杂质与主成分有效分离，对杂质的控制能力是极其微弱的，达不到定性与定量的水平。Johnson CA[7]撰文综述了1986年前20~30年间BP的一般质控策略及新分析方法(HPLC、GC)对BP的影响。虽然BP(1980)已经提出了有关物质(related substances)的概念，但此期间对药品质量的控制主要为对药品主成分纯度的控制。

进入20世纪90年代，伴随着色谱分析技术的飞速发展，对化学药品中的杂质分析成为当时药品质控分析研究的主流。在药品质量控制理念方面，BP(1988)已明确，“与已知杂质相比，对药品中的未知(潜在)杂质的控制更为重要；在良好的药品生产条件下，药品中不应当出现性质未知和量不可控的杂质”。从BP(1988)起，历版的BP逐渐增加了对各类化学药品有关物质的检查；BP(1998)是药物杂质控制的重要“分水岭”，该版药典在附录中首次增加了有关物质和残留溶剂检查通则，增加了杂质控制指导原则；同时在各论中对化学药品的已知杂质给出了具体的名称、分子式和结构式，并通过“已知杂质”、“任意单个杂质”和“总杂质”实现对化学药品中杂质的控制；标志着对药品中杂质的“限度控制”理念已经成熟。ChP(2000)和ChP(2005)均遵循该“限度控制”理念控制化学药品中的杂质。

进入21世纪，伴随着人们对药品中的杂质特性，特别是生物学特性的深入了解，发现不同的杂质可能具有完全不同的生理活性，如β-内酰胺抗生素中的微量聚合物杂质可能导致过敏反应，“致突变杂质”与其他杂质相比对人体的危害更大，仅用“限度控制”杂质总量和非确定的单个杂质的控制方式，是无法实现针对此类“致敏、致突变类”杂质进行定量控制的目的。此时药品的“非确定性杂质限度控制”理念暴露出明显缺陷。药品中的诸杂质的种类与相应含量被总称为杂质谱或杂质概况(impurity profiles)。理想的控制理念应是针对药品中的每一个杂质，依据其生理活性逐一制定其质控限度。1997年，GorogS等[8]撰文较详细地阐述了利用杂质谱控制药品中杂质的策略，并以甲哌地强龙(mazipredone)为例，提出了利用色谱(TLC、HPLC、GC)、光谱(UV、NMR)和联用技术(HPLC-PDA，GC-MS，HPLC-MS)组合分析药品杂质谱的方法。之后，药品“杂质谱控制”的理念逐渐形成。ChP(2010)中的部分化学药品已开始尝试利用杂质谱控制的理念进行杂质控制。

1.3 原料药杂质谱研究与控制的意义

原料药杂质谱研究与控制具有如下的重要意义：

首先，杂质谱的研究有助于对原料药合成工艺进行有效监控，从而保证原料药生产流程的质量稳定性。原料药杂质(有关物质)可能是在原料药生产过程中带入的起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等物质，也可能是在生产、贮藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质[9]。同一种原料药由于合成路线和合成工艺的不同而会产生多种不同杂质，而其中的一些杂质的产生是与特定的合成路线和合成工艺密切相关的，这类杂质又称为合成路线标记杂质，它们的生成量的大小往往取决于合成路线和合成工艺中关键控制参数的优化水平、以及日常生产稳态控制水平，它们当中在含量与种类上的微小变动都可能是药物在合成工艺过程中的某些因素的改变(甚至是较大幅度的变更)所造成的

[10]

。对原料药杂质谱进行研究与控制，通过对比同一厂家不同时期的生产批中

杂质的种类与数量关系，可了解厂家在不同阶段工艺改进与参数优化方面的变更情况；对近期连续生产批中杂质谱进行种类数量分布统计，以此为指标可动态反映当前阶段生产工艺控制水平；而对不同厂家生产的同种原料药中杂质谱的比较，则不仅反映出产品质量在杂质控制水平上的差异，还可反映出产品在合成工艺上的差异性。此外，原料药杂质谱研究在合成工艺专利保护上还有特殊意义，由于合成路线标记杂质，与特定的合成路线具有唯一的确认关系，有些在合成工艺上取得专利的原料药厂商，为保护自身利益，通过对比其它厂家同一产品杂质谱，以是否存在合成路线标记杂质作为依据，来判定其它厂家是否有盗用专利合成工艺的侵权行为[11]。

其次，杂质谱的研究为原料药进一步进行毒理学安全评价、药理学临床研究、药剂学研究提供数据参考。《化学药物杂质研究的技术指导原则》规定了原料药杂质限度(见表1-1)的要求，定义了三类杂质限度：

报告限度(Reporting Threshold)：超出此限度的杂质均应在检测报告中报告，并应报告具体的检测数据。

鉴定限度(Identification Threshold)：超出此限度的杂质均应进行定性分析，确定其化学结构。

质控限度(Qualification Threshold)：质量标准中一般允许的杂质限度，如制订的限度高于此限度，则应有充分的依据。

每日最大剂量 报告限度 鉴定限度 界定限度

≤2g/day >2g/day

>0.05% >0.03%

>0.10%

or 1.0mg/day(取最小值) >0.05%

表1-1 原料药杂质限度

>0.15%

or 1.0mg/day(取最小值) >0.05%

当原料药存在化学结构相近的杂质(有关物质)且含量超过鉴定限度或界定限度时，药物研发者有义务对杂质的安全性进行评价。如果可以降低杂质含量至质控限度以下，或者通过研究文献资料可以提供杂质安全性证据的，可以免于杂质的安全性评价。否则，必须进行杂质毒性(包括遗传毒性)实验，评价杂质可能产生的毒副作用。具体研究方法可以采用含有一定杂质的样品(杂质量可能与临床研究用样品不同，但杂质种类和个数应该一致)在啮齿类和非啮齿类动物进行急性毒性试验和长期毒性试验，确定原料药的NOEL(No Observed Effect Leve，不能观察到反应的量)或LOEL(lowest observed effect level即能观察到反应的最低量)，从而计算出每日可接受的最大摄入量(PDE，permitted daily exposure)。

因此，在对原料药杂质进行毒性(包括遗传毒性)实验前，必须提供该原料药杂质谱的研究数据，并且要求临床研究用样品的杂质量不得高于毒性试验研究用样品的杂质量。如果合成工艺发生较大的变更，终产品的杂质种类和数量均发生变化，则需要重新进行杂质的毒性研究，确定新杂质的PDE值。

同时原料药杂质谱研究也为进一步药剂学研究开发，提供了初期药物稳定性数据。原料药的杂质可能是工艺过程产生的杂质和生产储存过程中自身降解物。对原料药进行初期药物稳定性试验(加速试验、强制降解试验)，通过对比试验样品与空白试验样品中的杂质谱，可分清楚哪些杂质是由工艺生产带进(此类杂质在稳定性试验中含量无显著改变)，哪些杂质是由降解产生的(此类杂质在稳定性试验中含量显著改变)。原料药的降解产物对于剂型选择、处方组成、剂型工艺确定、以及剂型产品的储存方式等均产生较大的影响。通过对初期药物稳定性试验样品中降解杂质谱进行分离，并进行结构确证，可了解原料药降解杂质基本组成以及产生的原因，为剂型药中杂质的定性、定量分析提供实验准备，所以原料药杂质谱研究应是药品质量研究、质量控制和安全性研究的基础。

1.4 原料药杂质谱中的杂质结构分析基本步骤

目前，杂质结构定性研究仍是国内有关物质研究中的薄弱环节，在一定程度上限制了我国药品研究水平和药品质量的提高。由于各研究机构采用的分析方法

手段不同，使用仪器设备的差异，以及不同原料药的特性差异，导致各研究机构对不同原料药杂质谱研究的步骤会有所差异。但有关物质结构研究的途径还是有迹可循的(见图1-1)[9]。

图1-1原料药杂质结构分析的步骤

图1-1 有关物质结构研究的途径

总体上，它包括以下步骤：1)采用不同分离机制的色谱分离方法检测有关物质，结合合成、制备路线与MS的检测推测有关物质的可能结构，然后取可能存在的杂质(如合成过程中的原料、中间体等)与含杂质的药物进样，在相同的色谱条件下考查已知化合物与该杂质的保留时间是否一致；也可将已知化合物加入含杂质的药物中，考查拟确定的杂质峰面积是否有变化。2)利用光电二极管阵列检测器(DAD)，观察拟定性的有关物质的紫外吸收，或与已知化合物的紫外吸收光谱进行对比，分析该杂质结构中可能存在的官能团。3)采用GC-MS或LC-MS-MS联用技术，为有关物质的结构确定提供相关信息；或利用LC-IR和LC-NMR等联用技术，在不分离杂质的情况下在线获得杂质的IR和NMR图谱；或利用制备型色谱获得有关物质的样品，然后通过IR、MS、NMR的检测，确定有关物质的结构。4)合成已知结构的有关物质，并与药物杂质的色谱数据和光谱信息进行对照，以确定有关物质，并建立其定量测定方法。

1.5 国内外对原料药中杂质谱的分析方法及最新进展

有关物质的种类与药物的合成路线和制剂工艺密切相关，药物在合成和制剂工艺过程中的任何一个因素的改变都可能导致其有关物质的种类不同，因而有关物质的检测和控制过程相对复杂。药物中的有关物质大多具有潜在的生物活性，有的甚至会与药物发生相互作用从而影响药物的安全性和有效性，严重时甚至会产生毒性作用[12]，因此有关物质研究是药物质量研究中最重要的一个方面，同时也是药品开发过程中的一个重要内容。根据人用药品注册技术规范国际协调会(简称ICH)准则的要求，药物中杂质的限度仅为0.10%(毒性药物限度则更低)，高于此水平的所有未知杂质均应被鉴别且定量，此外，还应对这些杂质进行毒性研究[6]。因此，有关物质的测定对于确保药物质量和用药安全、有效是非常必要的。因有关物质多为微量，必须选择专属性强、灵敏度高、重复性好的检测方法，目前首选的是色谱法，可根据新药的具体品种及其有关物质的性质选用高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)等或波谱分析技术，包括HPLC-MS或GC-MS等联用技术。有关物质的常用测定方法主要包括如下几种。

1.5.1 薄层色谱法

TLC法的特点是简便，易于操作，可同时分离多个样品，分析成本低，对样品预处理要求低，且可同时检测极性大和极性小的杂质[13]，故在药物杂质检查中应用十分广泛，在各国药典中都有多种药物采用此方法检查有关物质。而且，也有人尝试将TLC法用于药典中未采用此法测定其有关物质的药品，如罗功才

[14]

采用硅胶G板，以甲苯-甲醇(8：2)为展开剂，1%二苯胺硫酸溶液为显色剂，

对硝酸异山梨酯的有关物质进行了检查。结果显示：该法简便易行，重复性好，杂质的最低检出量为90ng。但在有关物质的测定中TLC法只能达到定性或半定量的目的，且由于灵敏度受操作条件影响较大，因此难以满足快速定量分析的需要。

1.5.2 高效液相色谱法

HPLC法具有分离效能高、分析速度快和检测灵敏度高等特点，已被广泛应用于药物中有关物质的测定。目前，HPLC测定有关物质的定量方法主要有杂质对照品法(外标法)、主成分自身对照法和峰面积归一化法。 1.5.2.1 杂质对照品法

当药物中有关物质已知并可获得其对照品时，可采用杂质对照品法测定单个杂质的含量。该法专属性强，灵敏度与准确度均较高，但由于通常较难获得杂质对照品，不能广泛使用。Chandorkar等[15]采用该法对盐酸坦索罗辛中已知杂质[5-(2-氨基丙基)-2-甲氧基苯磺酰胺]进行了测定，色谱条件为：色谱柱为Lichrosphere C8柱；流动相为乙腈-磷酸二氢钾缓冲液(50：50，用磷酸调节pH至5.0)；检测波长为275nm。结果，该方法回收率达99%，重复性和回收率的RSD均小于1%，检测限为6ng。 1.5.2.2 主成分自身对照法

主成分自身对照法又可分为加校正因子和不加校正因子两种。

(1)若杂质已知但无对照品，可采用加校正因子的主成分自身对照法对杂质进行定量检测。例如，刘文华等[16]以Alltech C18柱为色谱柱，乙腈-磷酸二氢铵缓冲液(10：90)为流动相，在280nm检测波长下测定头孢丙烯合成起始原料和中间体以及头孢丙烯的色谱峰面积，计算各校正因子，采用该法对头孢丙烯原料药等有关物质进行了测定，结果各有关物质均达到了较好的分离。该法的优点是可减小杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差，故准确度较高；缺点是在检验时没有杂质对照品，必须根据相对保留时间确定杂质峰在图谱中的位置，而相对保留时间在不同实验条件下可能有所波动，特别是当供试品中存在多个杂质且分离效果不佳时，更难确定色谱图中的杂质峰。

(2)若杂质未知或无法获得杂质对照品，可采用不加校正因子的主成分自身对照法对杂质进行检测。该法不但操作简便，且无需对照品，但由于忽略了各杂质与主成分的响应因子有可能不同，从而使实验测得的杂质含量可能存在误差，其测定误差要比加校正因子的主成分自身对照法更大。当杂质对主成分的校正因

子超出0.9~1.1范围时，应采用加校正因子的主成分自身对照法测定。当采用主成分自身对照法时，检测波长的选择是否合理直接影响到有关物质的检测结果。若将主成分的最大吸收波长确定为有关物质检测的波长，而杂质在此波长下的吸收与主成分差异较大，则所测结果不能真实地反映药品中杂质含量。因此在选择检测波长时应综合考察主成分和杂质的紫外吸收特性，既要保证有关物质在该波长下有较高的灵敏度，又要尽量减小有关物质与主成分之间的响应差异。可通过二极管阵列检测器(DAD)来考察主成分和各个杂质的紫外吸收特性，选取响应基本一致的波长作为有关物质的检测波长。如王桂云等[17]在奥美沙坦酯的有关物质检查中，采用DAD对奥美沙坦酯和5个中间体的紫外吸收特性进行了考察，发现奥美沙坦酯和5个中间体的紫外最大吸收波长分别为254、258、261、264、256和252nm，且吸收强度也相似，故最后选定接近主峰且近似于平均值的波长(256 nm)作为有关物质的检测波长。 1.5.2.3 峰面积归一化法

若只需粗略考察杂质的含量，可采用峰面积归一化法。杨倩等[18]采用该法对盐酸平阳霉素及注射用盐酸平阳霉素中有关物质进行了测定，色谱条件为：C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；以己烷磺酸钠溶液(pH4.2)为流动相A、甲醇-乙腈(70：30)为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm。结果，主峰与杂质能较好分离，最低检测质量浓度达1mg/L。峰面积归一化法的特点是其测定值基本不受称样量及进样量的影响，故重复性良好。但需指出的是，只有在所有成分均出峰、所有杂质均与主成分分离且响应因子相同时，该法的结果方可真实准确。此外，当所含杂质为微量时，需通过增加进样量来确保检测灵敏度，此时主成分响应值可能超出仪器检测范围。

1.5.3 气相色谱法

GC法具有选择性好、灵敏度高、进样量小、分析速度快等特点。李丹等[19]采用毛细管GC法对β-石竹烯醇的有关物质进行了测定，考察了不同色谱柱和柱温程序升温对分离效果的影响，并用气相色谱-质谱(GC-MS)确定了有关物质主要为β-石竹烯醇共存物—α-榄香醇、长叶烯醇和丁子香烯醇。与TLC法和HPLC法相比，GC法要求样品能够气化且具有热稳定性，故较少用于有关物质检查。2005年版中国药典[3]中只有林旦等少数几个化学药品采用GC法进行有关物质的检查。

1.5.4 毛细管电泳法

毛细管电泳法(CE)近年来发展迅速，与HPLC法相比，具有快速、高效、进样量小、分离模式多等优点。尽管目前受自身灵敏度和重复性的限制，CE法在药物的杂质研究中的应用还不普遍，但当HPLC法不能获得很好的分离效果时，CE法可能是一个不错的选择。Jouyban等[20]对近年来CE法在药物杂质研究中的应用做了总结，指出：目前毛细管区带电泳法(CZE)在各种分离模式中应用的最多，主要用于离子型和可电离药物的分析；胶束毛细管电色谱(MEKC)和微乳液毛细管电动色谱(MEEKC)则比较适合疏水性药物的分离；等速电泳(ITP)等其它分离模式应用的较少。有一个例子是Jankovics等[21]采用CE法检查不同厂家的苯磺酸氨氯地平中有关物质，电泳条件为：缓冲液为25mmol/L柠檬酸缓冲液(pH7.0)-甲醇(80：20)；分离电压为30kV；检测波长为223nm；内标为盐酸普鲁卡因。其检测结果与采用欧洲药典规定的HPLC法的结果基本一致。

1.5.5 毛细管电色谱法

毛细管电色谱法(CEC)是20世纪90年代初兴起的一种新型分离分析技术，它综合了HPLC法和CE法的优点，具有高柱效、多选择性、流动相体系相对简单、峰容量大、易于联用等特点。Orlandini等[22]采用CEC法对酮咯酸及其有关物质进行了分离，并通过对缓冲液的pH、乙腈的浓度、有机改性剂的种类和电压强度等因素的优化考察，确定了最佳分离条件：流动相为50mmol/L甲酸铵缓冲液(pH3.5)-水-乙腈(10：20：70)；检测波长为323nm；电压为30V；温度为20℃；内标为氟灭酸。结果，9分钟内主药和3种有关物质达到基线分离。但目前CEC技术还处于研究阶段，在日常分析中使用较少，其检测结果的重复性差等问题还有待进一步解决。

1.5.6 超临界流体色谱法

超临界流体色谱法(SFC)是20世纪80年代初发展并得以广泛应用的色谱分离技术。该技术以超临界流体为流动相，以固定吸附剂或键合到载体上的高聚物为固定相，必要时加入甲醇等极性物质为改性剂来改善分离性能。SFC法具有分析速度快、选择性好、分离效率高和样品处理简单等优点，适用于热稳定性差、极性大和挥发性小的药物。Toribio L等[23]采用手性填充柱SFC法对4种抗真菌药进行了手性拆分，并考察了不同改性剂对保留时间和分离度的影响，发现在使用甲醇为改性剂的条件下，咪康唑、益康唑、硫康唑与其各自的对映异构体在10分钟内均能达到很好的分离效果；而伊曲康唑需使用异丙醇-乙醇(85：15)为

改性剂时才能与其3个异构体达到基线分离。由于SFC技术检测结果的重复性差，目前在有关物质测定中并不常用。

1.5.7 联用技术

色谱-质谱联用技术是目前发展最为成熟的联用技术，其中液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术在有关物质的结构确定和降解产物的产生机制研究中有着广泛的应用。Ermer等[24]介绍了LC-MS技术在有关物质研究中的应用情况，一方面，可利用LC-MS法对色谱峰进行峰纯度检查，以验证分析方法的可靠性；另一方面，可通过高分辨质谱提供的元素组成信息和LC-MS-MS法提供的碎片离子信息来推断杂质的结构。

除色谱-质谱联用外，液相色谱-核磁共振波谱联用(LC-NMR)是人们关注的另一个焦点。LC-NMR技术在药物分析中主要用于药物中杂质、药物代谢的产物以及手性药物的分析等。Vasu Dev等[25]在对雷贝拉唑钠片进行稳定性试验研究的过程中，发现经6个月加速试验的样品产生了3个新的降解产物，采用停留模式LC-NMR和高分辨LC-MS技术得到了降解产物的NMR和MS信息，并将这些信息与雷贝拉唑的结构信息进行比较，确定了3个杂质的结构，并推断降解产物可能源自碳硫键氧化断裂和雷贝拉唑自身结构的重排。

目前，对有关物质进行结构鉴定已成为有关物质研究技术要求的重要组成部分。应用色谱-质谱联用技术对有关物质进行结构鉴定屡见报道。例如，在对洛匹那韦原料药中有关物质进行研究时，Chitturi等[26]首先采用HPLC法对洛匹那韦粗品进行初步检测，发现共有10个有关物质(RS1~RS10)，将起始原料、中间体等可能的有关物质与样品中杂质的保留时间进行比较后发现，RS1为合成的中间体，RS2为起始原料，RS3为洛匹那韦的水解产物；然后应用LC-MS和LC-MS-MS技术分析样品，分别得到RS3~RS10的分子质量和碎片离子的信息，进一步结合洛匹那韦的结构及合成过程，推测出这几个未知杂质的可能结构；最后，将通过制备型色谱得到的几个未知杂质的纯品进行NMR和IR分析，以验证先前的推测，从而确定了有关物质的结构。

1.6 结语

药物中有关物质的研究是药物研发和质量控制的一个重要方面，贯穿于药品研究、生产、储存的全过程。药品中的有关物质是否能得到合理、有效的控制，直接关系到药品质量的可控性和安全性。目前含量在0.1%左右的有关物质是人们研究的热点，综合利用各种分析手段建立准确、快速、灵敏度高的检测分析方

法仍是研究人员努力的方向。HPLC法在有关物质分析中仍将占主导地位，TLC法和GC法则是补充手段。随着技术、方法的成熟，CE法也有望成为一种常规分析手段，特别是在手性异构体的检查中能发挥重要的作用。近几年SFC、UPLC、CEC等方法在有关物质研究中的应用逐年增加，但其重复性还有待进一步改善。在有关物质的结构分析中，LC-MS及LC-MS-MS技术已相当成熟。近年来，LC-NMR技术有了较大的发展，凭借着强大的结构鉴定能力，其在有关物质的结构分析中必将有着较好的应用前景。随着检测手段的进一步完善，人们对药物中有关物质的研究将会更加深入，药品质量也将得到进一步的提升。

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