一系列新的小RNA

一系列新的小RNA

—源自于tRNA的RNA片段

新型的不同于miRNAs的小RNA分子随着时间的推移逐渐的在不同的生物体中发现。为了发现这种新型的小RNAs，我们用前列腺癌细胞系创建了一个17-26个碱基长的RNA库并用高通量的测序方法对其进行了测序。结果表明很大数量的这种序列是非常确切的来源于成熟的或者前体RNA分子5’末端或者3’末端，它们整体形成了三种类型的tRFs。即：tRF-5, tRF-3, 和 tRF-1。这些序列共同组成了一种类型的小RNA分子，而这种类型的小RNA分子的丰富度是仅次于miRNAs的。用杂合反应、定量反转录PCR、夹板结扎化验方法独立的测定了至少17种tRFs。从而证明了tRFs在生物中的重要性，我们进一步研究了tRF-1001,这是一种起源于3’末端的Ser-TGA 前体tRNA转录区，而这种tRF分子在成熟的tRNA分子中是不存在的，tRF-1001在癌细胞系中很大范围的高度表达，而在组织中却很少表达。而它的表达是和细胞增殖密切对应的。通过siRNA调停的方式敲掉tRF-1001缺陷细胞在细胞分裂的G2期有明显的积累，而通过引入寡核糖核苷酸2’-O末端甲基化的tRF-1001分子使表型逆转的个体对siRNA是有抵抗性的。tRF-1001是由前列腺癌易感基因在tRNA的3’末端形成的。我们得出的数据表明tRFs不是在tRNA退化或者生物进化过程中的随机产物，而是大量的新型的小RNA分子都是有着精确的序列结构，这些序列结构有着特殊的表达模式和生物学规则。 非编码RNAs分子在生物的很多方面扮演者重要的参与者。关于这方面的最多研究是miRNAs,,它调整动植物中目的RNA的转录后加工。另外一系列与miRNA密切相关的小RNA是siRNA,它在RNA干扰途径中起着关键性的作用。在植物中，自然发生的siRNA（trans-acting siRNA和natural antisense transcripts siRNA）已经发现。在果蝇和哺乳动物中的报到最近才发现，与此同时合成的双链DNA和siRNA已经作为一种敲除基因的工具在动物方面应用很多年了。一系列其他的小RNA分子也在不同的物种中鉴定了出来，包括tncRNA、21URNA、rasiRNA、hcRNA等。尽管它们中的一部分被证明在异染色质形成和转位子沉默中起生物作用，最近表明它们中的大部分是没有弄清楚的。我们相信其他的小RNA分子亟待发现，特别是通过高通量测序技术的应用去发现。

在本研究中，我们用454深度测序的方法分析了人前列腺癌细胞系中的小RNA的全部表达产物，接下来是siRNAs，最多的是起源于tRNA的片段。除了它们在翻译中的知名作用外，tRNA也表现出了在细胞中的其他作用，像反转录、卟啉生物合成等。在这里，我们鉴定了tRNA的新作用。其特点和大量的tRF个体表达产物如以下所示。就像它们的精确序列曲线一样，结果表明tRFs不是生物进化过程中的随机退化的中间产物，而是组成了一种具有更深入监察作用的小RNA。任何一种tRFs在细胞活力中都是不可缺少的。 结果

tRF-5, tRF-3, and tRF-1的克隆、鉴定和特征描述。

从两个前列腺癌细胞系中克隆了17-26nt长的小RNA分子，然后454深度测序。得到了658068个序列结果，萃取之后发现40%的序列是miRNAs，剩下的部分是属于不同于人类基因和序列标签的原序列。两个不匹配的序列结果可以用来补充nmsRNA的结果，这些序列是序列错误或转录后翻译，比如RNA编辑。 我们主要致力于30个序列，相比之下一个非常有名气的具有生物学功能的miRNA，miR-18a，被克隆了473次，与此同时，一个高丰度的miRNA,let-7a,被克隆了17856次。数据库中的695中miRNAs中，一大部分（635个）被克隆的次数小于200次。这些nmsRNA中的大多数都在经过了进一步的鉴定，而这鉴定方法是在USUC的基因组浏览器上审查它们所在的区域。28种序列可以映射到人类基因组上，在很多情况下是多基因位点。这其中的6个起源

于已知的转录本和snoRNA，从这一点看，小RNA很可能起源于这里。值得注意的是，过半的丰富nmsRNA序列和tRNA的位置是一一对应的。考虑到克隆片段是大概反应细胞内的小RNA水平。这些tRNA相关的小RNA分子应该是比大部分的miRNA多。

成熟tRNA的初级转录物由RNA聚合酶Ⅲ转录，包括5’端前导链和在tRNA成熟过程中被修整的3’端后随链。对于大多数的真核生物tRNA来说，CCA序列在酶的作用下加到修整过得tRNA中间产物的3’末端。在这17种tRNA相关的小RNA中。第五个和第八个分别精确的对应于成熟tRNA的5’和3’末端。在所有8种tRF-3 RNAs分子都包含在tRNA成熟过程中序列加到3’端的CCA序列。tRF-1系列的四种小RNA分子被定位在RNA的前体物中，而且它们的5’端合成在成熟tRNA的3’末端。所有克隆产物的末端序列精确保留明显表明一个精确的分裂事件在这些tRF传代过程中是非常重要的。

为了得到一个更加综合性的tRFs分析，我们扩大分析范围到所有的小RNA序列，而这些序列的扩增都是是不少于五次的。用与人类基因相对应的1541种nmsRNA，40%的对应的位点包括一个tRNA，其侧翼长25nt。它们中的77%是由于它们精确的开始和结束位点才被识别的，同时剩下的23%存在于体内tRNA的随机位点。所有沿着成熟tRNA分子分布的小RNA分子的5’和3’末端的分布规律显示了一个重要的丰富的tRF-5和tRF-3类型的分子，显示了这些并不是tRNA退化的随机产物。

如果推测一下的话，tRF-5 and tRF-3起源于tRNA的成熟，是有内切核酸酶的内切和外切核酸酶的外切作用而生成的。从454深度测序数据来看，我们测定的是内切酶的切割位点分布和长度分布。A在tRF-5类型的3’末端较为丰富。tRF-3类型的切割位点优先定位在A/U和A/U之间。tRF-5这种类型的分子显示了15-25nt范围内正常分布的一种模式，这和我们在小RNA克隆中的片段大小选择是非常相似的。相比较而言，tRF-3则偏向于分布在13-22nt这个较小的范围内。20 nt的tRF-3耗费非常严重。酶切位点的选择和tRFs的大小分布，更进一步支持了其产生不适随机的。这对于tRF-3更为如此。

tRF-1的百分比低于 tRF-3的百分比，tRF-1的较低的百分比可以用一个假设来解释，而这个假设就是其在前体RNA分子时期以3’末端裂解的方式释放了。就人662个tRNA基因位点而言，成熟tRNA的3’末端和RNA聚合酶Ⅲ的终止信号的距离是可变的。只有14.6%的tRNA基因座能够产生16-27个碱基长的tRF-1，这是包含在我们的克隆片段里的，这也解释了tRF-1的数量少的问题。如果所有前体RNA分子的裂解都能产生tRF-1，那么tRF-1类型的分子的大小分布和期望的理论分布不能完美的契合。这种变异表明某种类型的tRF-1被选择性的加工或者保留在细胞中为了某种特定的生物学功能。

tRF-5, tRF-3, and tRF-1组成了人前列腺上皮细胞中大部分的小RNA，这仅次于miRNAs。除此之外，它们精确的开始和结束位点或附近的tRNA末端，和它们在大小和酶切位点方面非随机的性质共同强有力的表明其起源于tRNA一种特殊形式的裂解。 通过其他技术确认的tRFs的表达。

杂合反应发现8种tRFs经手住了考验。我们不仅发现了一系列具有正确大小的tRFs，也发现了80-100nt是非常明显的并且能成为成熟tRFs的前体。就tRF-1001, tRF-1002, 和tRF-1003而言，其中较大的一种包括pre-tRNA，tRF便起源于这里。就tRF-5和tRF-3而言，探针也显示对应的成熟tRNA，其存在要比tRFs要多.除了成熟的tRNA外，这里也有一些中等大小的，相当于tRNA的分裂产物的东西最近被报道出来。

我们使用了夹板结扎的方式对tRF-1001进行了测试，这种结扎测试取决于tRF-1001的3’末端和5’末端的结扎点，是通过精确的低聚糖退火而实现的。因而，这种结扎测试发现具有精确的3’末端序列的RNA分子在测试产生tRF-1001的的前体RNA的转录物时更具有特殊性。这个结果与杂交测试得出的结果是一致的。值得提出的是tRF-1001的量与它的前体物往往不具有非常完美的关联性。这表明tRF-1001的加工过程和其稳定性可能起了调节作

用。两种tRF-1001、tRF-3001、tRF-3009也进行了这种结扎测试。 一些tRFs的表达水平太低使得我们不能使用结扎测试和杂交测试，特别是对于tRF-3和tRF-5而言，存在着一种来自于成熟tRNA和中间产物的强烈的干扰信号。为了避开这个影响，我们使用了发现miRNA时使用的方法相似的定量逆转录PCR技术。我们切胶净化了17-26nt合成cDNA的RNA，从而消除了来自于大的tRNA成熟物和其他RNAs的干扰。12种tRFs都通过逆转录PCR的方式进行了成功测试。

有趣的是，每一种tRF都在细胞系中表现了一种特殊的表达模式，从而否定了tRF来自于非特异性的tRNA的退化中的随机产物这种可能性，如此非特异性的退化将会使得所有tRFs具有一种相似的模式。 tRF-1001的表达

对tRF-1001做了更深入的研究，因为它是数量最多的tRF，而且也能使用杂交的方法进行精确的测定。tRF-1001在细胞中的表达量比在组织中高。尽管想EB染色所显示的那样，组织中有很多的RNA退化物，tRF-1001在组织中的量也不高。这更强烈的表明了tRF-1001不是来自于非特异性的RNA随机退化产物。tRF-1001在许多不同家系的癌细胞系高表达表明tRF-1001与细胞的增殖有关。

与此一致的是，通过杂家测试和结扎测试的方法得知tRF-1001在血清饥饿的DU145前列腺癌细胞、LNCaP前列腺癌细胞、HCT116结肠癌细胞系中是减少的，通过血清更换的方式修复。当细胞密度非常高的时候tRF-1001也会降低。因此较差的细胞增殖条件，如血清消耗和不断增加的细胞密度都和tRF-1001的下调有关系。相似的tRF-1001的tRNA前体物的降低由于血清消耗而导致的tRF-1001降低是一个细胞新陈代谢中的pre-tRNA转录下调而导致的。与此形成对比的是，相应的成熟tRNA保持不变。 tRF-1001是细胞增殖所必须的。

证明tRFs不是tRNA新陈代谢过程中随机产物的最好方法就是证明至少一种tRFs的功能。为了证明这个，我们使用了siRNA的方法敲出掉了tRF-1001。我们设计了三种针对pretRNA的小分子RNA干扰双链体，它们通过经过退火加入tRF-1001和成熟tRNA。si-tRF1001主要以tRF-1001的上游2nt或nt处,其他两种siRNAs分别设计在下游1nt和2nt处。因此，如果siRNAs在pre-tRNA的中心切割目的片段，那么就会在一个与其tRF-1001后代相矛盾的切割位点切割。非此即彼，siRNAs干扰可以以立体干扰或者RNA前体隔离在RNA诱导的沉默复合体中起作用。

与tRF-1001共用12nt碱基的sitRF1001后随链的杂交使得在进行杂交测试和夹板结扎时掩盖了tRF-1001和它的前体物在进行杂交测试和夹板结扎测试时的发现。实时荧光定量PCR不受其干扰的原因有以下几种。第一，si-tRF1001后随链3’末端的两个dTs指引了实时荧光定量PCR的第一步，小RNA的聚腺苷酸化需要3’末端；第二，在实时荧光定量PCR的第二步使用特意引物能使tRF退火却不能使si-tRF1001得后随链退火。事实上，实时荧光定量PCR时加入sitRF1001不影响tRF-1001的测定。实时荧光定量PCR在测量tRF-1001方面的可靠性被与此同时进行的杂交测验所证明。

qRT–PCR测试证实了si-tRF1001作用能使tRF-1001减少。除了标准的qRT–PCR测试分离的小RNA外，其在测试总RNA方面也表现了出了相似的结果。有意思的是，前体tRNA的量不受si-tRF1001的影响，这表明tRF-1001的减少可能是通过包括前体RNA裂解在内的数种机制进行。

由于tRF-1001的减少，细胞增殖被损害，可用细胞的减少可以表明这一点，这也伴随着DNA合成的减少和细胞周期停留在G2期的细胞的积累。尽管si-tRF1001被期待降低与tRF-1001有关的成熟tRNA。从一些交替的基因位点中挤出来的相同tRNA不同于tRF-1001。事实上在经过si-tRF1001处理后，Ser-TGA tRNA的水平是不变的。由si-tRF1001诱导的细胞代谢瑕疵

不能归功于相应成熟tRNA的减少。另外两种相似siRNAs的转染呈现了相似的结果。

最重要的是，被si-tRF1001诱导的细胞增殖的减少和G2期细胞的积累被2’-O-甲基化的合成tRF-1001所拯救，而不是被一个不相关的基因，荧光素酶基因共转染所拯救。这个结果排除了基于si-tRF1001转染的生长抑制是完全由于pre-tRNA-Ser-TGA的降低和小RNA双链体的脱靶而造成的这种可能。2’-O-甲基化的派生物而不是对实验条件毫无帮助的平的寡核糖核苷酸，因为这种改造可以使寡核糖核苷酸的性质稳定并能抵御细胞核酸酶。

无论tRF-1001的3’末端或5’末端都会造成局部的改善，这表明两个末端区域都对其功能有重要作用。最初的tRF-1001拥有3’羟基和5’磷酸基，我们的克隆过程就依靠这个末端结构。3’羟基和5’磷酸基对tRF-1001的细胞拯救功能都非常重要，无论哪一个发生化学改变都将影响tRF-1001的化学合成。

因为Me-tRF-1001 和siRNAs序列重复了12-14nt,我们想排除营救是由于Me-tRF-1001 和siRNAs退火而引起的可能性并用滴定法排除了非特异的细胞目标。试验中的几组观察结果让我们确认了这个观点。第一，Me-tRF-1001末端区域没有这个能力，尽管它的杂交能力和具有这种能力的寡核苷酸相同。第二，si-tRF1001-3在细胞增殖方面产生了更深刻的影响，这不完全是由Me-tRF-1001引起的。但是，Me-tRF-1001和sitRF-1001-3的重叠要比另外另外两种siRNA多，被期待的是用一种简单的杂交方法去滴定测试前者。此外我们用了一种我控的与si-tRF1001另外12nt重叠的寡核糖核苷酸，但是不同于tRF-1001序列。我控的核糖核苷酸不能拯救由si-tRF1001诱发的生长损伤，也表明由Me-tRF-1001作用的细胞增殖拯救不是由si-tRF1001的加入引起的。

我们得出结论，tRF-1001对细胞增殖非常重要，tRF-1001在通常的生长中没有速度限制。因为在未经处理的细胞中的Me-tRF-1001转染并不能增强细胞的增殖。 tRF-1001在 ELAC2的控制下在细胞质中合成

tRF-1001是tRF-1分子的一种类型，开始于成熟tRNA的3’末端的CCA序列前面，tRF-1分子的3’末端属于带有连续5或6个T的DNA序列，是RNA聚合酶Ⅲ结合的位点。这个序列结构表明小RNA中的tRF-1是来自于前体tRNA的3’拖尾序列，由于tRNA 3’末端成熟时的tRNA核酸内切酶的作用所释放。

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