质粒DNA的提取

质粒DNA的提取、纯化与纯度鉴定

李笃财 生科

1班 201200140048

【实验目的】

1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。 2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理。 【实验原理】

1. 质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

2.质粒DNA抽提过程中各试剂成分及作用：

溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?HCl组成.(保护、缓冲)

①葡萄糖可增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒. ②EDTA 络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 ③ Tris?HCl 能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围，起缓冲作用。 溶液II：由SDS与 NaOH 组成(裂解、变性) ① SDS可裂解细胞、使蛋白质变性。

② NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性。

溶液III：HAc(乙酸)和 KAc(乙酸钾)组成的高盐溶液(复性，分离) ①HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA 变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。

②KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。 冰乙醇：夺取多余的水分。 3.凝胶电泳进行DNA分离纯化：

电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。

琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至百万bp)，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。 【实验步骤】 1、菌体的培养

1、配制LB液体培养基：1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，NaOH调pH至7.2，121℃高温灭菌15min。

共配1L，分装至：20ml×8瓶，100ml三角瓶；80ml×8瓶，300ml三角瓶；50ml×4瓶，300ml三角瓶。分别加入1.5%琼脂粉。 2.准备：dd H2O:40ml/300ml三角瓶，2瓶；200μL、1000μL枪尖各一盒；50mL离心管2个；1.5mL离心管若干（装在500mL锥形瓶中）；一瓶牙签。包装灭菌备用。

3.在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取一环携带有质粒pUC19的E.coliDH5α单菌落，接种于20mL含有氨苄青霉素含量为100μg/mL的LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养。

4.取过夜培养物2-3mL，接种到50mL含有氨苄青霉素含量为100μg/mL的LB液体培养基中，培养4-6h。 2.质粒DNA的提取：

1.称量50mL离心管重量W1，取30mL菌液于已称重的50mL离心管中，配平后6000r/min离心5min。

2.弃上清，向离心管中加入5mL溶液Ⅰ，涡旋振荡，6000r/min离心5min。 3.弃上清并称重W2，求W=W2-W1。

4.按照1.0mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅰ，充分涡旋振荡，冰浴5min，再按照2.0mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅱ，温和颠倒混匀，冰浴2min，然后再按照1.5mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅲ，温和颠倒混匀，冰浴10min，平衡后12000r/min离心15min。

5.取上清至新50mL离心管内，记录体积，加入两倍体积的冰乙醇，混匀后

在-20℃环境下保存30min。取出后12000r/min离心15min，弃上清，加入5mL70%乙醇，12000r/min离心5min，弃上清，重复一次，弃上清，37℃风干5-10min。

6.取出离心管，加入1mLTE溶液得到粗提物，加入50μl RNase A（10mg/ml），使溶液浓度为50μg/mL，37℃保存60-120min。 3.质粒DNA的纯化：

1.取500μl粗提物于1.5mL离心管中，加入等体积的Tris饱和酚，混匀，12000r/min离心5min。 2.转移上清（体积V1）至新管，加入等V1的酚：氯仿：异戊醇溶液，混匀，12000r/min离心5min。 3.转移上清（体积V2）至新管，加入等V2的氯仿：异戊醇溶液，混匀，12000r/min离心5min。

1

4.转移上清（体积V3）至新管，加入 V3的3M NaAc溶液（pH5.2），再加入2V4

10

1

（V4=V3+ V3）的冰乙醇，混匀，-20℃保存30-60min，取出后12000r/min离心

10

15min。

5.弃上清，加入500μl 70%乙醇，10000r/min离心2min，重复洗涤一次。37℃风干5-10min。

6.取出离心管，向一只离心管中加入30μl TE溶液，溶解沉淀后，将溶液全部转移入另一只离心管中，得到30μl纯化质粒DNA。 4.DNA纯度检测—琼脂糖凝胶电泳： 1.1%琼脂糖凝胶的制备： 用50×TAE制备5L 1×TAE；取40ml 1×TAE至300ml干净锥形瓶中，称0.4g琼脂糖，倒入三角瓶混匀，轻塞棉塞，微波炉加热沸腾3-4次，至澄清无颗粒；冷却至60℃左右，倒入制胶槽中，冷却凝固待用。

2.点样：待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内加入1×TAE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面1-2mm。取2.0μl纯化DNA+2.0μldd H2O+1.0μl上样缓冲液（6×loading buffer），混合。用移液枪吸取5.0μl垂直加入点样孔中。

3..电泳：100V，200mV条件下电泳30min左右。

4..EB染色：小心从电泳槽中取出凝胶；加入0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10min，期间轻轻晃动盛EB溶液的盘子2-3次；用X光片小心端起凝胶，沥去多余的液体，转移至去离子水中漂洗10min，期间轻轻晃动盘子2-3次；用X光片小心端起凝胶，沥去多余的液体；用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。

【实验结果】

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

DNA纯度检测凝胶成像结果

【实验分析】

电泳图中，从左边起，第1组为商品化的超螺旋marker，第二组为pUC19质粒, 第三组为被HindIII酶切过的 pUC19质粒。第8组是我们的点样。从电泳图上来看，点样较清晰，点样处亮度不明显，除质粒DNA外中间没有明的染色体DNA的条带，说明我们的杂质去除效果还算理想。从图中可以看出，分子片段小的电泳跑的远，这是因为凝胶是一种分子筛，小片段受到的阻碍作用小，因此能够移动的距离就远，片段越大受到的阻碍越大，不容易移动。因此在最后的结果中，三种质粒DNA从下往上的顺序为超螺旋质粒DNA、线性质粒DNA、开环质粒DNA。我们组的质粒DNA条带较亮，说明纯度较大，而且条带较宽，说明在提取过程中损失不多，最后保留了较多的质粒DNA。与第一组的超螺旋marker比较得出，我们的质粒DNA片段大小正常。与第二组的pUC19条带相比，虽然我们的线性DNA与开环DNA之间的分离不是很明显，但是认真看还是能看出来的，所以我们的结果还是算可以的。 【注意事项】

1．提取过程应尽量在低温环境中进行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净，在沉淀DNA 时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。同时反应中加入的盐浓度一定要控制好，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钾盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的钾溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。一般情况下都是加入的最终浓度达0.1～0.25mol/L为宜。 2．该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只

有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加入SDS后，则要注意不能过分用力振荡，温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理!

.3、加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.

4、加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。 5、乙醇沉淀DNA离心后，要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。否则，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。 6、为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带，加入50μl RNA酶，将管置50℃水浴箱内30min，消化RNA。 7、从细菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液时，一定要彻底，不能留有残余。 8 、用 70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分小心，防止将核酸同洗液一

起去掉。 9、在实验过程中所用的器皿和吸头等都要进行高压灭菌。

10 、溴化乙锭 是一种强烈的 致癌物质 ，使用时必须带手套 。实验结果后，

含溴化乙锭的凝胶要进行净化处理。 11、加样量不宜过大，引起条带拖尾或跑入其他胶孔，小心加样，不要让样品溢

出加样孔。加样梳放整齐，使形成的加样孔整齐，使样品在同一水平位置开始电泳，减少结果偏差。 12、放在冰中沉淀时，一定让冰的高度高于样品的最上限，防止质粒DNA降解。 13、在洗菌的时候要使菌充分悬浮起来，注意吹吸要慢，不能产生气泡，枪尖不

可高于溶液最下端。 14、在混匀时，轻敲Eppendorf管的尖部，使溶液充分混匀。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/cy8f.html