WB实验基本步骤

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实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓ BCA定量

制备蛋白胶(SDS-PAGE胶)

蛋白样品变性

↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤

↓ 二抗 ↓ TBST洗涤

↓ 显影 ↓ 结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g

加入500ml纯水,调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST(PBS+0.05%吐温-20)

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解

加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷

4.电泳液(1X)

10x稀释,50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST(TBS+0.05%吐温-20)

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉,40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞,PBS(4℃预冷),PMSF(100mM),移液枪(1000ul,10ul),1.5mlEP管2个,高速冷冻离心机4℃预冷

1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液

2.加入1ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,8000r离心5min,然后弃去上清。重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。

3.按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) 4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液,吹匀,于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后,于4℃下12000 rpm离心5 min。

7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于-20℃保存。

二、 蛋白含量的测定(BCA定量)

准备:96孔板,移液枪(1000ul,10ul,200ul),BCA工作液(A+B),50mlEP管,1xPBS,BSA标准液 1.将96孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈的孔最好不用)

2.算好孔数(总的)每孔加200ulBCA工作液(A+B),(A液:B液=50:1,一般配多些,如60孔,A液12000ul,B液240ul)

3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20ul样品(2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍),做三个重复则需要60ul,一般配80ul

4.配蛋白标准样品,将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml,若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液

5.将稀释好的样品加入孔板中(标记的区域),接着标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域,之后在加标准样品的孔内,将孔内溶液用PBS补足到20ul 6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差 7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟

8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量(ml)为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。(R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存)

9.计算蛋白含量(注意定量样品已经稀释了10倍)

序号

标准蛋白量/ul (0.5mg/ml) 背景液(PBS)/ul 标准液浓度mg/ml

1 0 20 0

2 1 19 0.025

蛋白质定量标准曲线加样量 3 2 18 0.05

4 4 16 0.1

5 8 12 0.2

6 12 8 0.3

7 16 4 0.4

8 20 0 0.5

三、SDS-PAGE电泳

1. 配胶(12%,可以提前配好)

准备:玻璃板,梳子,AP(解冻,现拿现用),聚丙烯酰胺(4℃冰箱冷藏) (1)玻璃板验漏5min (2)按表配置分离胶

(3)灌胶,加酒精封压,凝30min(注意不要有气泡)

(4)按表配浓缩胶,倒掉酒精,用吸水纸吸去酒精,灌胶,插梳子(注意不要有气泡),凝30min (5)取胶,用水冲洗一下浓缩胶,加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用 2. 样品处理

准备:PBS,移液枪,1.5mlEP管

(1)稀释样品:一般每孔上样5ul,即1mg/ml浓度的样品,测完蛋白含量后,将样品用PBS稀释至1mg/ml(注意loadingbuffer的加入也得算入)

(2)取出上样样品15ul至1.5 ml离心管中,加入6×SDS 上样缓冲液3ul至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15 μl,加样孔的最大限度可加20 μl样品。) (3)将样品在100℃煮5 min震荡使蛋白完全变性(注意仪器操作) 3. 电泳

准备:电泳液500ml(现配),蛋白胶,10ul移液枪(枪头),样品,Marker,冰盒,电泳装置

(1)将SDS-PAGE胶放入电泳槽中,加足够的电泳液。(短玻璃板面向内,长玻璃板面向外。若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。) (2) 上样。用移液枪贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。)

(3)先设置80V,开始电泳,样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电压,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。(此时准备好电转液)

四、转膜

准备:电转液(现配4℃冰箱冷藏),镊子,滤纸,PVDF膜(0.45um),电转装置,冰盒 注意:拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子,因为手上的蛋白会污染膜。 1. 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫

2. 滤纸浸入电转液中,PVDF膜在甲醇中润湿成半透明,小心将膜放入4℃电转液中平衡至少5min。 3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。(撬时一定要小心,玻板很易裂。)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上(做好标记),用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。)

5. 将夹子放入转移槽中(电转移时会产热,浆槽放入冰中),要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。一般用100mA转移90min。

6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。(准备封闭液)

六、免疫反应

准备:封闭液,一抗,二抗,TBST

1 . 将膜移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭2h。 2. TBST洗4次。每次5分钟。

3. 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记,加入相对应的一抗,室温孵育2h或者4℃过夜 4. 室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗四次,每次5min

5. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1~2 h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗4次,每

次5 min

七、显影

准备:样品胶片,移液枪(200ul),中枪头,吸水纸,显影液(A+B),薄镊子

75kd 28kd

一抗 二抗 兔二抗 鼠二抗 兔二抗 目的蛋白78kd Bip 1:1000 目的蛋白34kd GAPDH内参1:5000 目的蛋白17kd Sep15 1:1000 1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;

2.1 min后,取适量显影液于显影仪台面上,将膜用镊子夹起来正反面充分和显影液接触,注意切角在左上,即正面朝上。

应注意的是:显影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。 3.盖上盖子,将胶片进行扫描或拍照。

本文来源:https://www.bwwdw.com/article/cxpg.html

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