Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程

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未来的中国科学家们，加油！ Genloci Classic CRISPR-Cas9内

部操作流程

Protocol No. PT140726-1

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：

1 ～20bp

-3’ - CACC G 5’

-5- CAAA ’ 3’

设计2条单链oligo序列；退 火形成双链DNA。

2 将双链 DNA连接到载体中。

3 转化 G10 Competent Cell；筛 选阳性克隆；测序验证序列； 质粒大提；电转染靶细胞。

4 在细胞内 crRNA识别靶位点， Cas9对靶位点进行随机剪切。

5

CruiserTM酶切细胞池，计算突变 率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆； 将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。

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U6 pGK1.1

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2，操作步骤

实验前，请您务必做好以下验证实验：

A． 单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可

以形成单克隆。 B． 目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增

靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。

1. 设计Oligo DNA序列

首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计： ●麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/

●德国癌症研究中心的E-Crisp：www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr

下面我们选择麻省理工学院的CRISPR Design工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。

点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”

根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与BbsI酶切后的载体相互补的部分）： Fut8-F: caccGAATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-R: aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC

※注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。

另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。

2. T4 DNA Ligase连接

将合成后的2条单链oligo DNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA Ligase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。

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退火反应体系如下：

正链Oligo(100μM) 负链Oligo(100μM)

ddH2O

Annealing Buffer(20x)

0.5μl

0.5μl 18μl 1μl 20μl

将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1.75μl的杂交后的双链DNA进行T4 DNA Ligase连接反应，反应体系如下：

pGK1.1 linear vector 2μl

1.75μl 双链DNA

T4 DNA Ligase 1μl 10xT4 DNA Ligase Buffer 1μl ddH2O 4.25μl 10μl

※注意：请您根据步骤1自行设计正链Oligo序列和负链Oligo序列，合成后的2条单链 oligo DNA退火复性成双链DNA，再进行T4 DNA Ligase连接反应。

连接产物可以直接转化DH5a高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》，pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。

3. 电转染靶细胞(推荐)

转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg/μl浓度，再取4～7μg进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。

另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。

4. 混合克隆pool检测

48-72小时后做有限稀释，一般5块板足够，并取电转后细胞的pool 1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞冻存。

PCR检测（以Fut8基因为例）：

11步骤所制备的模板 5ul

Fut8-seq-F(10mM): 1ul Fut8-seq-R(10mM): 1ul dNTP Mixture(10mM each): 1ul Taq酶： 0.5ul 10XTaq酶buffer： 5ul Mgcl2 3ul

H2O: 33.5ul Total 50ul 程序： 95℃ 2min cycles 1x 95℃ 20S

cycles 35x X℃ 20S

72℃ 30S

72℃ 5min cycles 1x 95℃ 变性 5min

}

PCR产物使用CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。

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5. CruiserTM筛选阳性克隆

上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。

将剩余的pool的靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用Cell Plaza?(Cat.No.: GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组，推荐使用Genloci TNA抽提试剂盒 (Cat.No.: GL10851S)。

然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用Genloci CruiserTM突变检测试剂盒(Cat.Nos.: GCMD025, GCMD100)，对CruiserTM筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。

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IV． FAQ

Q-1：靶位点设计有哪些注意事项

A-1：目前有几个在线设计软件，我们推荐使用Zhang Feng lab：http://crispr.mit.edu/，该软件会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否存在脱靶现象。在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G对于起始转录非常重要。

Q-2：转染效率低，怎么办？

A-2：因为Cas9蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（8kb左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂质体等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer，所以不推荐使用；Life的Neon系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而Genloci的CTX-1500A电转仪，转化效率高，不需要单独配制buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。

Q-3：单个细胞不生长，怎么办？

A-3：对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用Cell PlazaTM（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。

Q-4：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？

A-4：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶：CruiserTM酶、T7E I和Surveyor酶。其中，CruiserTM酶和Surveyor酶属于Cel I家族，这两种酶的筛选特异性比T7E I高。在酶切筛选过程中，T7E1的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐CruiserTM酶，它特异性高且价格合理。

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VI．附录

附录A pGK1.1 linear Vector

以下为pGK1.1的插入位点示意图和质粒图谱，线性化pGK1.1所用的酶为BbsI。

： pGK1.1

Guide RNA：

～20bp

Figure 3. pGK1.1插入位点图示

Figure 4. pGK1.1质粒图谱

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VII CruiserTM操作说明

1，操作步骤

1） 基因组 DNA 的准备

提取细胞的基因组 DNA，推荐使用 Genloci 公司专为阳性克隆筛选设计的 TNA 抽提试剂盒（Cat. No.: GL10851S），只需 500 个左右的细胞即可提取全基因组 DNA，详细实验步骤请参看 Genloci TNA 抽提试 剂盒（Cat. No.: GL10851S）说明书。

2） 杂交 DNA 的准备

a) 第一轮和第二轮（巢式）PCR 引物设计

分别设计 First Primers 和 Nested Primers。其中 First Primers 要求具有较高的特异性，其扩增产物推 荐为 500～1000 bp，Nested Primers 推荐扩增产物长度为 300～600bp。First Primers 和 Nested Primers 引物对应目的序列的位置如下：

模板 DNA

第一轮 PCR 产物

第二轮（巢式）PCR 产物

1/3 突变 位点 2/3 Nested Primer First Primer

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b) 第一轮 PCR：获得目的片段

将已经提取的基因组作为模板，使用 First Primers，以高保真 DNA 聚合酶扩增获得目的片段，要求目 的片段明亮（允许少量杂条带，以及少量弥散）。同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增产物。 推荐扩增循环数 35～40 cycles，反应体系 25 μl，100 ng≤模板量≤300 ng。PCR 完成后，取 7～8 μl 进

行电泳检测。

c) 第二轮（巢式）PCR：获得杂交 DNA

根据第一轮 PCR 电泳检测中目的条带的亮度，用无菌去离子水稀释扩增产物（可参照 Marker 的亮度 估算产物中 DNA 的浓度，稀释至总核酸浓度为 10～20 ng/μl，一般需要稀释 10～50 倍）。其中野生型模 板扩增产物标记为：WT DNA；待检测的突变型模板扩增产物标记为：MT DNA；根据您的检测样本量的大 小取合适量的稀释产物作为第二轮 PCR 的模板。小量样本的反应体系如下：

MT DNA WT DNA 5×Nested Buffer Mg2+ Buffer

dNTP（10mM each） Nested Primer-F Nested Primer-R GNest DNA polymerase ddH2O Total Volume

大量样本的反应体系如下：

2.5 μl 2.5 μl 5 μl 1.5 μl 0.5 μl 1.2 μl 1.2 μl 0.3 μl 10.3 μl 25 μl 1 μl 1 μl 2 μl 0.6 μl 0.2 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.1 μl 4.1 μl 10 μl

MT DNA WT DNA 5×Nested Buffer Mg2+ Buffer

dNTP（10mM each） Nested Primer-F Nested Primer-R GNest DNA polymerase ddH2O Total Volume

※注意：

? 若第一轮 PCR 的扩增模板为混合模板，即同时含有野生型和突变型模板，则在第二轮 PCR 无需混合

WT DNA，取稀释后的扩增产物 2 μl 作为第二轮 PCR 的模板。 ? GNest DNA polymerase 置于-20℃保存，且避免操作污染。在 60 s 内，GNest DNA polymerase 可扩 增

1 kb 的 DNA 片段。

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PCR 反应程序推荐如下：

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94℃ 94℃ Tm* 72℃ 72℃ 95℃

自然冷却 40℃以下

*Tm 值由 Nested Primer 决定，一般为55℃左右。

#

#

45 s 10 s 10 s 15-30 s 45 s 3 min 10 min

35 cycles

产物片段长度≤500 bp 时，建议为 72℃，15 s；产物片段长度＞500 bp 时，建议为 72℃，30 s。

扩增结束后，取 2 μl PCR 产物（实验组）用于下一步 CruiserTM 酶切检测。

3） CruiserTM 酶筛选阳性克隆

对照组和实验组杂交 DNA 同时进行 CruiserTM 酶切，步骤如下： 1. 取一个新的 0.20 ml 的 PCR 反应管，加入 2 μl Positive control DNA，此为阳性对照组； 2. 分别向实验组和对照组反应管中加入 CruiserTM 核酸酶和 5×CruiserTM 缓冲液，总体积为 10 μl，移 液器吹打混匀，此步骤应置于冰浴上操作。酶切体系如下： 3. 将实验组和对照组置于 PCR 仪中 45℃孵育 15～20 min。

PCR Products 5×CruiserTM Buffer CruiserTM Enzyme ddH2O

Total Volume

Incubation Temperature Incubation Time

2 μl 2 μl 1 μl 5 μl 10 μl 45℃ 15～20 min

※注意：CruiserTM 核酸酶、阳性对照置于-20℃保存，且避免操作污染。

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V． 结果分析

酶切步骤结束后，应向上述 10 μl 反应体系内加入 2μl 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置 于-20℃保存。当酶切后片段预计<500 bp 时，推荐使用 1.5%～2%的琼脂糖凝胶电泳，若酶切片段的大小 相近且需要将其分开显示，可提高琼脂糖凝胶浓度并延长电泳时间，凝胶最大浓度推荐≤2.5%。

试剂盒中 Positive Control DNA 为杂交后的 DNA 片段，经 CruiserTM 核酸酶切割后形成三个明显片段， 分别为 393 bp、134 bp、259 bp，其中 134 bp 和 259 bp 片段是酶切后片段，而 393 bp 片段为杂交形成 的 homo-duplex DNA 片段，无酶切割位点，因此，片段大小不变。

Figure 2 阳性对照的电泳结果 M： 100 bp-DNA Marker CK+： Positive Control DNA

※注意：酶切验证阳性的克隆，若需要进行测序，需以第一轮 PCR 产物为模板，使用相应的高保真 DNA 聚合酶、Nested Primer 引物进行扩增，回收片段送测序即可。

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VI． FAQ

Q-1：电泳结果仅有原片段而无酶切条带？

A-1：造成该实验结果有以下几种可能：

a． DNA 片段中无突变位点，需要重新进行上游实验，可通过对该 DNA 片段进行测序验证； b．DNA 片段中杂交 DNA 含量过低，致使反应后条带不易观察到。该情况常见于 cell pool 检测中，因 cell

pool 中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低，导致获得 DNA 片段中杂交 DNA 含量过少，此时 建议

TM

设立 2-3 个重复分别进行 PCR 检测，只要检测到 Cruiser酶切条带，则可认为敲除成功，存 在阳性克隆。 c． CruiserTM 核酸酶失活。使用试剂盒中的阳性对照同步进行实验以检测活性。

Q-2：电泳结果中酶切条带大小不是预期大小？ A-2：出现该情况表明制备的 DNA 片段中含有其他杂交位点。首先，应确认制备的 DNA 片段是否存在其他 DNA 的污染；其次，根据酶切结果进行判定：若酶切后形成的各条带单一，可能在 DNA 片段上含有其他 杂交位点，需通过 DNA 测序检测；若形成的酶切条带数量远多于预期，且随机分布含一定弥散，则可能是 DNA 片段扩增中，DNA 聚合酶错配扩增导致，使用高保真 DNA 聚合酶重新进行扩增可消除影响。如果 PCR 反应出现非特异性扩增的条带，也会导致同样情况，建议调整 PCR 反应条件，以保证只有特异性扩增的 PCR 产物用于突变检测。

Q-3：反应后，酶切的条带轻微弥散？ A-3：该现象可能原因如下：

当酶切后条带<200 bp，且经较长时间的核酸电泳，条带宽度变大，亮度不足时呈现类似弥散的带型； 当突变位点过长，尤其当突变长度达到 50 bp 以上时，酶切后条带易出现弥散现象，此时弥散程度会因酶 切后条带大小的不同而不同，片段越小弥散情况越明显。

Q-4：CruiserTM Enzyme 检测结果是否会出现假阳性？ A-4：CruiserTM Enzyme 是通过基因工程生产的 Cel I 同源核酸内切酶，具有更好的稳定性、高度的特异性 和高效性，它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源 DNA 双链。目前为止，尚未有文献报道使用 CruiserTM Enzyme 或 Cel I 会出现假阳性，或出现其他核酸酶活性。

Q-5：电泳结果中酶切条带大小与预期一致，就一定是纯合子吗？ A-5：因为杂交的 DNA 片段是通过巢式 PCR 得到的，所以特异性没有任何问题。在得到与预期一致的酶切 条带后，不能 100%判断该样本为纯合子，因为杂合子也能得出同样的结果。因此，需要进行 PCR 片段的 TA 克隆和测序验证。

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VII．附录

附录 A 阳性对照说明

等量野生型和突变型 DNA 片段混合，经 98℃加热、自然冷却后形成的杂交 DNA，该 DNA 链存在两 处突变，均为单碱基突变，突变点间距 2 bp，如下图所示。经 CruiserTM 核酸酶切割后形成三个明显片段， 分别为 393 bp、134 bp、259 bp，其中 134 bp、259 bp 为酶切形成的片段，393 bp 为杂交形成的 homo-duplex DNA 片段，无酶切割位点， 因此，片段大小不变。

200 ng。 阳性对照推荐用量：10 μl 体系用量

附录 B 目的 DNA 制备说明

提取基因组 DNA 后，在设计 First Primers 用于第一轮 PCR 时，要求其具有较高的特异性，其扩增产 物推荐为 500～1000bp，Nested Primer 推荐扩增产物长度为 300～600 bp。在设计 Nested Primer 时，应 使突变位点位于片段的 1/3～2/3 处，且反应后获得的片段大小不应小于 100 bp，以尽可能增强酶切结果的 可观察性。例如：使用第二轮（巢时）PCR 扩增获得全长为 400 bp 的 DNA 片段，通过调整引物位置，使 得预计的突变位点位于距 5’-端 140 bp 处，则 CruiserTM 核酸酶酶切后获得片段应为 140 bp、260 bp。若以 1.5%～2.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测则可获得 3 条清晰的片段，大小分别为 140 bp、260 bp、400 bp。 在

进行 CRISPR-Cas9、TALEN 和 ZFN 技术进行基因敲除的检测时，推荐检测的 DNA 片段大小为 300～ 600 bp；若用于长片段扩增突变检测，片段大小不受限制，但需适当延长反应时间，如调节反应时间为4 5 min；片段在凝胶电泳时应呈现清晰的单一条带。

附录 C 酶切效果说明

野生型和突变型模板 DNA 混合后进行巢式 PCR 是为了获得特异性的序列和足够的量，巢式 PCR 必须 采用试剂盒中的 5×Nested Buffer、Mg2+ Buffer 和 GNest DNA polymerase 进行反应，以确保不影响后续 CruiserTM 酶切反应。

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VIII. 参考文献

1. Yang B, Wen X, Kodali N S, Oleykowski C A, Miller C G, Ku-linski J, Besack D, Yeung J A, Kowalski

D, Yeung A T. Purification, cloning, and characterization of the CEL I nuclease. Bio-chemistry, 2000, 39:

3533～3541.

2. Perry J A, Wang T L, Welham T J, Gardner S, Pike J M, Yoshida S, Parniske M. A TILLING reverse

genetics tool and a accessible collection of mutants of the legume Lotus japonicus. Plant Physiology, 2003,

131: 866～871.

3. McCallum C M, Comai L, Greene E A, Henikoff S. Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(TILLING)

for Plant Functional Genomics. Plant Physiology, 2000, 123: 439～442.

4. Oleykowski C A, Mullins C R B, Godwin A K Yeung A T. Mutation detection using a novel

plant endonuclease. Nucleic Acids Research, 1998, 26: 4597～4602.

5. Wienholds E, Eeden F V, Kosters M, Mudde J, Plasterk R H A, Cuppen E. Efficient target-selected

mutagenesis in Zebrafish. Genome Research, 2003, 13: 2700～2707.

6. Till B J, Burtner C, Comai L, Henikoff S. Mismatch cleavage by single-strand specific nucleases. Nucleic

Acids Research, 2004, 32: 2632～2641.

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/cvi3.html