包含体纯化步骤

同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，

1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。

2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50Mm NaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。

3、4℃ 12,000 rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。

4、加20mL的包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，（旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h ），4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。 2.2.2 亲和层析纯化表达的蛋白

pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。根据表达蛋白的溶解情况分两种方法对蛋白进行纯化。 2.2.3 天然条件下纯化可溶形式的目的蛋白

目的蛋白的表达和收获：用3.2.2.1所述的方法大量表达目的蛋白。4℃下10,000 rpm离心5 min弃上清，向细菌沉淀中加入4℃用冰预冷的1×Ni-NTA结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH8.0)，每100 mL培养液加入4 mL结合缓冲液，重悬菌体。－40℃冷冻，室温溶解，反复冻融三次。再在冰水浴中超声10 min(超声10 s, 间隔10 s)，破碎菌体。4℃下10,000 rpm离心20 min，保留上清液。

Ni-NTA His·Bind resin的准备：将树脂充分重悬，取4 mL悬液(每2mL树脂悬液可吸附5-10 mg蛋白)加到10 mL沉降柱(gravity column)中，树脂自然沉降后，加1×Ni-NTA结合缓冲液洗两次。

目的蛋白的吸附和洗脱：将菌体上清液加到处理好的树脂中，4℃轻柔混匀，结合2h。树脂自然沉降后，打开沉降柱下端的管帽，让缓冲液缓慢流出。液体流完后，加1×Ni-NTA漂洗缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑，pH8.0) 5mL，轻柔混匀，漂洗两遍。结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。然后加1×Ni-NTA洗脱缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, pH8.0，咪唑浓度

分别为100、200、300、500、750和1000 mmol/L)，按照咪唑浓度由低向高洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。SDS-PAGE电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。

2.2.4 变性条件下纯化包涵体形式的目的蛋白

1、包涵体的纯化：收集的菌体按每100 mL培养基所得菌体加入20 mL 1×变性结合缓冲液(0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl, pH8.0, 不含尿素) 冰浴30 min，按前述方法进行超声，重悬菌体。5,000×g离心15 min，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。移去上清，将沉淀重悬于20 mL 1×变性结合缓冲液，重复上述步骤。移去上清，按每100 mL培养基加5 mL缓冲液的比例，加入含8 mol/L尿素的1×变性结合缓冲液重悬沉淀。冰浴孵育1 h，彻底溶解包涵体。16,000×g离心30 min去除不溶成分。

Ni-NTA His·Bind resin的准备、目的蛋白的吸附和洗脱方法同前。1×变性漂洗缓冲液(8 mol尿素，0.1 mol/L NaH2PO4, 0.01 mol/L Tris-Cl, pH6.3)漂洗两遍后，加入pH5.9的1×变性洗脱液(8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4, 0.01 mol/L Tris-Cl) 0.5mL洗两遍，再用pH4.5的1×变性洗脱液洗脱并收集目的蛋白，每0.5 mL收集一管。结合、漂洗过程中收集上清100 μL，以备电泳分析。SDS-PAGE电泳分析各管收集液，合并有目的蛋白的收集液。

2.2.5 变性条件下目的蛋白的切胶回收

将变性条件下纯化的目的蛋白的收集液进行SDS-PAGE电泳，切胶回收。－20℃保存胶条。所有胶条放于研钵中，加入适量0.7%的生理盐水，研磨成很细的颗粒状，用1mL的针头可以吸入。电泳检测，估计蛋白浓度。 2.2.6 兔和小鼠多克隆抗体的制备

用作免疫的动物为日本大耳兔，体重2 kg左右，由武汉病毒所动物饲养中心提供，按以下免疫程序来免疫。500ug纯化的pQE-40-MT-2和pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白多点注射兔腘淋巴结和脚掌，每点注射0.2 mL。第一次注射2周后加强免疫2次，各次剂量为上次剂量的二分之一，每次间隔两周。第二次、第三次蛋白溶液背部皮下、脚

掌多点注射。在第三次免疫2周后，自颈动脉抽取血液。将兔血37℃放置1h后再在4℃放置过夜，1500×g离心30 min，吸取上层的多抗血清，分装后于－70℃冻存。同时还用pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白免疫了5只4周龄的昆明雄性小鼠，每只每周一次皮下注射40ug，6周后眼球取血，小鼠抗体血清的处理方法和兔抗体血清的处理方法相同。 2.3免疫印迹检测鳜MT-2在各组织内的分布

实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。用于免疫印迹的器官包括鳃、肝脏、心脏、肾脏、肌肉、头肾、脑、脾脏和肠道。将所取的组织分别在MEB缓冲液（100 mmol/L β-磷酸甘油，20 mmol/L HEPES，20 mmol/L EGTA，15 mmol/L MgCl2，pH 7.3，临用前加入1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，2.5 μg/mL leupetin，2.5 μg/mL aprotinin）中匀浆，-40 ℃冻存。临用前将组织匀浆液14,000 rpm 4 ℃离心10min取上清，用于免疫印迹检测。

将预染Marker、纯化蛋白样品和含5ug蛋白的组织提取液经16.5% SDS-PAGE胶（Bio-Rad Mini-Protein电泳系统）分离，电泳条件：10mA 1 h，20mA 至电泳结束。将电泳后胶板在转膜缓冲液（25 mmol/L Tris pH8.3，192 mmol/L甘氨酸，30%甲醇）中平衡20 min。按照伯乐半干电泳转移系统（Trans-Blot SD semi-dry electrophoretic transfer cell）操作指南装配转膜系统，室温下以15V（120-180mA）转膜30min，将蛋白转移至甲醇浸润过的0.22 um的聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜上。用TBS溶液（10 mmol/L Tris-Cl pH 7.5，150 mmol/L NaCl）轻轻漂洗膜10 min，再用2.5%的戊二醛固定1 h，以防止蛋白在随后的洗膜和孵育中脱落。然后用TBS洗膜10min×3，再用5%脱脂奶粉（溶于TBS中，含 0.05% Tween 20）室温封闭2 h后，用5%脱脂奶粉（溶于TBS中，含 0.05% Tween 20）按1：500稀释一抗，一抗采用两种重组蛋白免疫产生的兔抗MT-2抗体，4 ℃封闭过夜，再用TBST洗膜10min×3。以1：1000的稀释比例加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔二抗室温孵育2h。用TBST溶液洗膜10min×3，每次10 min，再用dd H2O洗膜10min。最后用NBT/BCIP浓缩显色试剂盒配置的底物溶液显色1-5min，滤膜置于dd H2O溶液中终止反应。

2.4免疫组织化学检测鳜MT-2的在细胞内的分布 实验用鳜，体重为400 g左右，免疫前驯养一周。

2.4.1 石蜡组织包埋与切片

1、取材与固定：迅速取肝脏和肾脏组织剪切成1.0×1.0×0.2厘米的小长条放入4%的多聚甲醛固定液中直接固定24h，4℃冰箱保存。 2、冲洗：固定以后，须在自来水下流水冲洗10分钟。

3、脱水：材料要切成薄片必须以石蜡包埋。为使石蜡能透入材料内部，必须除去其内部的水分。这种除去材料内部水分的操作过程，称为脱水。脱水通常用酒精，必须渐进，不能急骤，否则会引起材料不均匀的收缩。脱水时用70%、80%、90%、95%、100%各级酒精。每级10-30分钟。

4、透明：此时材料内部浸满酒精，石蜡仍难渗入，必须用既能与酒精混合又能溶解石蜡的媒浸剂浸渍，本试验采用二甲苯。每次20-30分钟，进行2次，时间不能长，久浸会使材料变脆，造成切片困难。

5、浸蜡：指石蜡浸入材料内部的操作过程。将溶解的石蜡倒入浸蜡杯内，将透明好的组织放入，中间换二次蜡，每次20-30分钟，将温箱温度调到与石蜡熔点相同，如温度过高，包埋物变得硬脆，坚实不易切片。

6、包埋：将材料包埋在石蜡中以便于切片。将熔化的石蜡倒入包埋器中，用热镊子把材料迅速移入包埋器中，并摆好位置，观察面向下摆放。之后，将包埋器放置于水面，缓慢浸入水中。等石蜡完全凝结以后，从水中取出，并注明包埋物的编号和日期等。 7、切片：将材料连同周围的石蜡用解剖刀切修成梯形，四周距离材料1-2毫米，前端离材料宜近。用少许石蜡将蜡块固定在木块上。将有蜡块的木块固定在切片机上，并调节切片刀的固定器或材料固定器，使切片刀与蜡块靠近。调节切片厚度为4微米，进行切片，并将切片用毛笔移在铺有黑纸的盘中。每节蜡带不超过盖玻片的长度。

8、展片与贴片：将切好的蜡带，放入温度为40-50℃的水浴锅内，根据蜡溶与水面的张力，展平组织，取一小滴蛋白甘油涂在载玻片上，用小拇指外侧把它涂成薄层，涂抹面积要超过蜡片所用的面积，涂抹得越薄越均匀越好。用解剖针把蜡片段拖于载玻片上, 玻片45-50℃烘干。

9、脱腊：把玻片放入盛有二甲苯的染缸中，熔去石蜡（3分钟），再经第二缸（3分钟）。 10、水化：经70%--80%--90%--95%各级酒精入水。 2.4.2 柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复

1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3分钟（3×3’）。 2、将组织切片浸泡于蒸馏水中待用。

3、取一定量的pH=6.0柠檬酸缓冲液于烧杯中，放在电炉上加热至沸腾。

4、将脱蜡水化后的组织切片至于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，煮20分钟。

5、烧杯离开火源冷却至室温，才能从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗2次，然后用PBS（pH=7.4）冲洗2次，每次3分钟。 2.4.3 免疫织化学染色

1、每张切片加50ul过氧化酶阻断溶液（试剂A），以阻断内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10分钟。

2、PBS冲洗3次，每次3分钟。

3、甩去PBS液，每张片加50ul的非免疫性动物血清（试剂B），室温下孵育10分钟。 4、甩去血清，每张切片加50ul的稀释好的小鼠MT抗体（抗体的稀释比为1：500），用非免疫血清代替一抗作为阴性对照，放入4℃冰箱过夜。 5、PBS冲洗3次，每次3分钟。

6、甩去PBS液，每张切片加50ul的生物素标记的第二抗体，室温下孵育10分钟。 7、PBS冲洗3次，每次3分钟。

8、甩去PBS液，每加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（试剂D），在室温下孵育10分钟。

9、PBS冲洗3次，每次3分钟。

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