Primer Premier 5.0中文使用说明书

Primer PREMIER

Version 5.0 for Windows and Power

Macintosh

使用说明书

PREMIER

Biosoft International

3786 Corina way,

Palo Alto, CA 94303-4504

电话 650 856-2703

传真 650 843-1250

电子邮件 sales@PremierBiosoft.com

目

录

目录 ...........................................………………...................................2

版权声明.................................…………………………….….................5 简介..............…………………………….............................…...............6

新版更新............……………………………………….........................................................6 基础指南.............................................................……………………..................6

GeneTank Window 序列编辑窗口 ………………………………………………7

查看序列..............................................…………………………………….............................7

打开已有序列 ................................................................……………………………….........7 创建新序列...............................................................…………………………………............7 保存序列 .................................................................…………………………………...........8 编辑序列 ..................................................................………………………………..............8 查找.........…………....................................................................................8

查看不同链.....................…………………………...……………..........................................8 语音校读........................…………….....…………….................................................8 编辑序列比较结果.........…………………...............................................................9

GENETANK 序列编辑 ...........................................…................7

序列粘贴窗口..............…………….……………………………............................9 参数设置 .. . . . . . .. . .. . . . . . . . .. . . . . . . … … … … … . . . . . . .. . . . .. . . . . . . . .. . .. .. . .. . . . . . . . .. . . . .. . . . 9 Rating Parameters 评分参数 .......................………………………………….................10

序列比较..................... .......……………………….......................10

Alignment Parameters 序列比较参数设置 ...................………………...........................10

序列翻译...........................………………………………………….....................12

Edit Codon Table 窗口...........………………………………………………………...............12

Primer Premier 引物设计 窗口 ........................…….....................................14 Direct Select 即点即选 14

框.....................................................................…..........

在序列比较中应用即点即选功能..........………………………….............................…........14

性状列表 ....................................……………........................................15 二级结构 ........................................................................…………..15

PRIMER 引物设计 .........................…….............................….....14

Edit Primer 引物编辑 窗口 .............…..........……..........................................16

Search Criteria 搜索标准 窗口 ............……..................................................16

Search Parameter 搜索参数 窗口 ....……………………................................17

2

Automatic Search 自动搜索 ........... …………………....................................................17 Manual Search 手动搜索 及引物设计原理......………………………...............................18

Search Results 搜索结果 窗口 ...........……………........................................20

Multiplex/Nested Primer 复式及巢式PCR反应引物 窗口 ...………………...21

Database 引物数据库 窗口 ..............................…….....................................21

...................................Reports 分析报告……....................................22

Synthesis Order Form 合成订单 ................…………...............................22

Optical Activity 比吸光度 ..................................………………....................................22

Degeneracy 多义性………………..................................................23 ..........................

..........................Graphs 图表………...................................................23

Restriction Enzyme Analysis

……..........24 Restriction Enzyme Analysis 限制性内切酶分析 窗口 .............

Restriction Sites 酶切位点 窗口 ..............................…………..................24

Edit Enzyme 限制内切酶编辑 窗口 .....…………………...............................24

Filter 特征筛选 窗口 ....................................…………....................................25

限制性内切酶分析 .………....24

Motif Analysis

Motif Analysis 基序分析 窗口…………….....................................26 ...............

窗口.....................……......................................26 Motif Sites 基序位点

窗口....................……..........................................26 Edit Motif 基序编辑

基序分析 ......... ……………...........................26

Menu Commands

GeneTank 主菜单.............................. …….........................................27

菜单命令 ...... ………....................................27

File....................................................……………...................................................27

Edit ..................................................…………….................................................27 View...................................................………….................................................27 Search ...............................................…………................................................27 Function............................................…................................................27

Translate ...........................................……………...............................................28 Window......................................………........................................................28 Help .........................................………….....................................................28

Primer 主菜单.................................................................................28

3

File.....................................................................................................28

E d i t .. . .. . .. . . . . . . . .. .. . . . . .. . .. . .. . . …… … … … … . .. . .. . . . . . . . .. .. . . .. . .. .. . .. . .. . . . .. . .. . .. 2 8 Function.......................………………….....................................................28

Report.................……………................................................................................28 Graph..............…………..................................................................................28

Window...........……………….....................................................................................29 Help ...........………….......................................................................................29

Enzyme Results Menu 主菜单..........……………….....................................29

File...........................…………...........................................................................29 Function..............……………................................................................................29 Window.........................…………….....................................................................29 Help ............................…………........................................................................29

Motif Menu 主菜单..................................................................................29

File...........................……………...........................................................................29 Function..................……………….........................................................................29 Window.....................……………….........................................................................29 Help ........................................………………..........................................................29

附录......................………………............................................30

…………….…………………………………………..........31 附录 A 公式法则

.………………..…………………………......................33 附录 B 多义碱基表

……….….………………………………..................34 附录 C 氨基酸缩写代码

...…………….…………………………….......................35 附录 D 软件上限

.……………….…………………….............................36 附录 E 参考文献

……………….………………………………..................37 附录 F 系统要求

服务与技术支持.............…………………………….............................................38 其他信息...................…………………….....................................................38 译者后记...................……………………….....................................................38

4

版权声明

Copyright ? 2000 by PREMIER Biosoft International. All rights reserved.

Information in this manual may change without notice and does not represent a commitment on the part of PREMIER Biosoft International.

The software described in this manual is provided by PREMIER Biosoft International under a License Agreement. The software may be used only in accordance with the terms of the agreement.

PREMIER Biosoft International claims copyright to this program and documentation as an unpublished work. Claim of copyright does not imply waiver of Premier's other rights.

This program and documentation are confidential and the property of Premier. Use,

examination, reproduction, copying, decompilation, transfer, and/or disclosure to others are strictly prohibited except by express written agreement with Premier.

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版权所有 本说明书中的内容可以 PREMIER Biosoft International 简称 Premier 由Premier单方面更改而无需另行通知 本说明中涉及的软件由 Premier提供 并应有书面授权

软件的使用必须在授权范围之内 该软件及相关文档作为一项未公开发表的工作 其版权归

Premier所有 对版权的声明并非意味放弃其他权利 该软件及相关文档是Premier的机密与财 产 除非有Premier 检查 再生产 的书面授权 任何的使用 复制 分割 传递或 /和解密行 为均被禁止

以上版权声明仅是原英文声明的翻译 如有歧义 应以原英文声明为准

译者声明

本软件说明书著作权归PREMIER Biosoft International 所有 译者则保留中

文翻译的相关版权 并授权生物软件网 www.bio-soft.net 共享发布该说明书的 中文翻译 本中文翻译仅限于软件使用者参考 其内容如有歧义应以原英文说明书 为准 译者及生物软件网不承担由翻译 打印 网页等错误带来的直接和间接损失

译者 Wenkelly

电子邮件 wenkelly163@163.com

5

简介

PRIMER PREMIER 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件 利用它的高 级引物搜索 引物数据库 巢式引物设计 引物编辑和分析等功能 可以设计出有高效扩增能

也可以设计出用于扩增长达 以上的PCR产物的引物序列 力的理想引物50kb 该软件主要由一下四个主要功能板块组成 GeneTank 序列编辑 Primer 引物设计

Align 序列比较 酶切分析 Enzyme Motif 基序分析

新版更新

种间交叉引物设计 利用来自多个物种的序列设计扩增引物 病理检测引物设计 可用来在高保守区域设计引物 等位基因特效引物 设计专用于扩增某一类相关序列中特定成员的引物

基础指南

这段指南并非详细的说明 仅为使用者对PRIMER PREMIER的菜单选项有一个直观的了 解 四个功能板块都有各自的窗口和菜单 正在使用中的窗口就是您所见到的窗口 以下列出 了各功能板块的主要菜单选项

GeneTank File, Edit, View, Search, Function, Translate, Window,Help.

Primer File, Edit, Function, Report, Graph, Window, Help. Enzyme File, Function, Window, Help. Motif File, Function, Window, Help. 使用功能菜单时 该菜单所属的窗口就会被激活 利用各菜单中的window选项记录的所 有打开的窗口 可以方便的在各个窗口之间进行切换

所有的列表都有复选功能 对于CTRL 系统而言 在点击同时按住 windows或Power Mac 键即可将当前的选择加入选单 按住 SHIFT键同时点击 可以选择两次点击之间范围内的所有 选项

6

GeneTank

利用GeneTank您可以打开DNA或者蛋白质序列 也可以选择不同的阅读框架 共三种

将DNA翻译成蛋白质或利用蛋白序列反推出DNA序列 为方便使用 软件已经提供了普通密

码子列表和几种线粒体密码子列表 您也可以输入您自己的其他线粒体密码子列表 序列编辑

器提供了包括多媒体语言校读在内的完整的序列编辑功能

这一功能板块包括以下部分

GeneTank 打开 编辑及翻译序列 浏览

Translation 将打开的序列翻译或反推成其他序列

Edit Codon Table 编辑翻译所依据的密码子列表

GeneTank窗口

GeneTank的窗口用来显示序列及其文件题头信息 序列可以 3碱基10碱基一组显示 您 可以将打开的序列翻译或反推成其他序列 您也可以使用通常的拷贝 剪切和粘贴命令编辑当 前序列 GeneTank的窗口上也有启用Primer Align Enzyme Motif 功能板块的快捷键

查看序列

点击相应按钮或从View菜单中选择 您可以查看文件题头 改变5 末端序列起始位置

选择3碱基或10碱基一组的显示方式 文件题头是指存在于序列文件中 位于序列信息上游的

文字内容 点击 改变 5 末端序列起 header按钮或从View菜单中选择可以显示文件题头信息

始位置 默认为1 序列将从您指定的5 位置开始显示序列

可选操作

View >Show Header

View >Grouping

View > 5’ Seq No 某些版本没有这一项

打开已有序列

使用菜单File >Open 可以激活文件选择对话框 文件

用来打开您希望处理的包含特定序列的

Windows用户请注意 默认设置的DNA序列文件后缀为SEQ 您可以使用其它的任何序列文件类型 蛋白序列文件后缀为PRO 当然

如果序列文件是GenBank的标准格式PRIMER PREMIER会自动识别打开文件中的序列起 始位置 或是您曾经使用本软件菜单中File > Save命令以PRIMER PREMIER默认格式保存过

该文件 序列将自动打开 如果打开其他格式的序列文件 将出现一个可卷动的Import Sequence

窗口并显示全部序列 在序列第一行的起始处双击 则双击处以前的所有信息将被认为是文件 题头 然后PRIMER PREMIER会自动剔除非序列字符并将序列在GeneTank里打开

使用提醒 如果您选错文件 重来一次即可

发现并没有您所希望的序列

只需要关闭Import Sequence 窗口

创建新序列

该项功能可以让您手动键入一个新的序列 您可以键入任何DNA或蛋白序列并存在您指定

的文件夹内 并可以象其他如GenBank格式的文件一样进行操作

7

保存序列

使用本软件保存的序列 可以被软件自动识别而无需让您指出序列起始位置 建议您在诸 如以下情况保存序列

您需要经常使用同样的序列

您已经编辑完一段序列并希望保存结果 您已经输入一段新序列

编辑序列

只需在GeneTank窗口内您就可以方便的编辑DNA或蛋白质序列 而编辑翻译或原始序列 十分方便 在任一序列上的改变将会正确的反应到与之相关的其他序列 例如如果你在一 段蛋白序列上DNA的原始序列 删除一个氨基酸残基 无论该序列是被翻译的或是用来反推

在相应DNA上的对应三位密码子将同时被删除 但如果您改变一段翻译出的序列 这一改变将 仅仅在另一段由此翻译出的序列而不会出现在原始序列上 编辑序列可以使用直接键入或利用 剪贴板

通常的剪切 拷贝 其快捷键分别是CTRL-X, CTRL-C和 粘贴同样可以方便的在此使用 CTRL-V

软件提供三碱基一组的显示方式

在键入DNA序列时可以使用A C G T或者附录B所列出的多义碱基 时可以使用附录C中所列出的氨基酸单字母记号

以利于蛋白相关的工作

在键入蛋白序列

当您完成编

可以从任何文本编辑器如记事本中的剪贴板中拷贝一段序列并将其粘贴进来

辑后请注意保存序列

查找

利用GeneTank窗口上的 Find 按钮 您可以从指针起始位置开始查找序列中一段特定

字符 查找到第一个后 您也可以使用 Find Next 使用Search 按钮在余下的序列中继续查找

菜单 选择Go To Position可以将指针移到您指定的位点

可选操作 某些版本在Edit菜单下

Search >Find

Search >Find Next

Search >Go To Position

查看不同链

要查看该序列的互补链 您只需要点击GeneTank窗口上的A按钮 就会显示该序列的互

此时互补 而点击S按钮 就能恢复成原来的序列 您亦可点击dsDNA按钮以双链形

补链 式显示

可选操作

View > Sense Strand

View > Anti-sense Strand View > ds DNA

语音校读

在GeneTank打开一段序列后 您可以按下语言按钮启用语音校读功能 序列将从指针所

在的位置开始被依次朗读序列 再次按下语音按钮将停止朗读 按下键入朗读键将在键入的同

8

时朗读输入的序列 再次按下该按钮可以停止键入朗读

可选操作

Function > Speaker

编辑序列比较结果

当一项多序列比较完成后 比较结果可以通过编辑来获得更准确的配对 通常ClustalW法 则能够给出一个准确的比较结果 但对于个别情况或出于特殊要求 因而手工编辑并非必要 可能有这种需要 所以本软件也提供这一功能 将点击指针指向的碱基可以实施改动 按下空 格键可以插入一个空隙 按下 一旦比较结果被改动 最大和最 Delete键则可以删除一个空隙 小同源性参数也会自动改变

粘贴序列窗口

这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同的方式粘贴上去

分别为正向 As is 以及反向互补 reversed reverse 反向 互补 complemented

complemented 这样便于从其他程序中粘贴序列而无需考虑其序列保存的方向

参数设置

Preferences 参数设置 窗口可以改变本软件所使用的多种默认参数

看及更改引物评分参数 设定二级结构在引物评分中所占的权重系数

也可以允许您查

默认引物长度 默认值为25

默认引物长度在Primer Premier窗口使用即点即选功能时得到的引物长度

Primer Premier窗口启动时的初始默认值这项数值可以设定为1到70个碱基

该项参数也是

引物对搜索最大值 默认值为100

在自动搜索引物时 由于该软件按照引物评分来衡量引物效率 得到的结果数量可以很多

有些引物虽然合乎标准但评分较低 可能没有全部列出的必要 尽管我们设置了100对引物这 一较大的数值 您仍然可以改变该项参数为10到1000之间的任意值 核酸浓度 默认值为250 pM

根据文献 这是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的总浓 7 Freier等 提供的计算公式

度 它即不是引物浓度也不是起始模板浓度 而是PCR过程模板的 产物的浓度 由于在PCR

浓度变化很大 很难确定具体数值 根据文献11的建议 Rychlik等 一般经验公式在普通PCR 反应中将其当作 250 pM 这项数值被用来计算引物的退火温度

9

单价离子浓度 默认值为50 mM 这项数值是指反应混合液中所有单价离子的总浓度 游离Mg2+离子浓度 默认值为1.5 mM

这项数值是指反应混合液中充当辅基的Mg2+离子浓度

总Na+当量

这项数值是根据单价离子浓度和游离Mg2+离子浓度计算得来 计算公式如下 方根

总Na+当量 单价离子浓度 4 Sqrt Mg 2+离子浓度 1000 游离 这项数值用来计算引物的退火温度

Sprt 即取平

自由能计算设置温度 默认值为25????

这项数值用来计算自由能 G 自由能计算公式为 评分参数

G= H T

S.

Rating parameters 评分参数 窗口是用来设定二级结构在引物评分中的权重系数 二

级结构越稳定 引物评分就会越低 相对于在引物中间形成的二级结构来说 3 末端的二级 结构对PCR扩增的影响会更大 为了将这一效应计算在内 软件将3 末端的二级结构的自由

能数值 G减去3 末端的二级结构显得更加稳定 1 这一修正会使

这一修正值是根据未公开实验结果制定的 您可以根据自己的需要来更改

软件只标注是引物二级结构中最稳定的一个自由能数值 如果没有检测到二级结构 G 则该数值为0

序列比较

这一部分仅在Primer Premier的Windows版本中使用 对于Macintosh系统 序列比较是

提交到网上完成并下载比较结果 在Primer的教程中有关于这方面的完整信息

Align 序列比较 窗口让您将已经打开的序列进行比较 序列选择框显示所有将要比较

的序列 使用 Add 和 Delete 按钮可以增加一个序列或移除一个序列

序列比较参数设置

您可以利用Alignment Parameters 序列比较参数设置 窗口来修正ClustalW法则用来优

化比较结果的各项参数 序列比较可以用两种模式完成 一种准确但较慢 slow/accurate

一种快速但较粗略 fast/approximate 选择不同的模式将会得到不同的结果 SLOW/ACCURATE模式的序列比较参数

这些参数无法改变序列比较的运行速度 它们被用来对序列比较评分然后换算为百分比数

即最后显示的百分数 并转化为进化树上的进化距离 值

1 Gap Open Penalty 比较结果中一个空隙的罚分

2 Gap extension penalty 比较结果中一个空隙每延长一碱基的罚分 3 Protein weight matrix 这是描述氨基酸之间的相似性的评分标准 4 DNA weight matrix 为核酸配对制定的评分标准 包括IUB多义密码子

使用 Options 按钮可以打开序列比较的参数设置窗口

10

FAST/APPROXIMATE模式的序列比较参数

这种同源性评分是由一种快速粗略的通用比较方法计算得来的 方法用以快速获得序列比较结果

1 只计算准确配对的部分 k-tuples

2 只计算最佳配对的情况

它包括4项参数

有两种

K-TUPLE SIZE 这是默认的准确配对的片段长度 增加这一数值可以提高运行速度 对 于蛋白序列最大值为2 减少这一数值则可以增加灵敏度 对于较长的 对于 DNA最大值为4 序列 例如大于1000字符 您可能需要增加默认值

GAP PENALTY 这是快速比较种每个空隙的罚分 影响不大

若非设定成很大的值

对比较的速度

TOP DIAGONALS 在一个虚拟的点划分分析法中 需要计算的在每个对角线上使用的k-

tuple配对数量 在比较中 只有最佳配对的情况才会被使用 由这项参数指定其数量 增加 这一数值可以提高运行速度 减少这一数值则可以增加灵敏度 多序列比较参数

这些参数控制最终的多序列比较 每个多序列比较包括多个双序列比较的过程 按照预定

顺序依次进行 相应的基本控制参数有两种空隙罚分 gap penalty 以及位置同源或替代的 权重系数 scores for various identical/nonidentical residues 1 和2 GAP PENALTY由菜单选项1和2控制

它们设定空隙以及空隙长度造成的罚分增加空隙罚分可以减少比较结果中空隙的数量

加空隙长度的罚分可以使空隙更短 末端的空隙不会被罚分

3 DELAY DIVERGENT SEQUENCES 打开这一选项将会先比较同源性高的序列 后

比较同源性较低的序列 该项数值即将特定同源性百分数设定为阀值 低于该同源性的序列将 会推迟比较 4 The TRANSITION WEIGHT 为碱基转换 A< >G或C < >T 即嘌呤之间和嘧啶之 间的替换 设定从0到1的权重系数 系数0意味将碱基转换看作一个完全的错配 系数1意味 将其看作一个完全的配对 对于远源序列 建议将其设置为0 而对于同源性较高的序列 将

这一系数适当增加会有好处

增

5 PROTEIN WEIGHT MATRIX 该 选 项 可 以 打 开 一 个 让 你 选 择 权 重 矩 阵 weight

matrices 的菜单 对于蛋白质分析默认的矩阵是由Jorja和Steven Henikoff 创建的BLOSUM 系列矩阵 请注意 是使用一系列矩阵 因为到底使用哪一个矩阵取决于序列之间的同源程度

进化差异不同所使用的矩阵也不同

6 DNA WEIGHT MATRIX 该选项打开一个菜单 选择一个 而不像蛋白分析那样是一

系列 核酸权重矩阵 默认的一个是BESTFIT用来比较核酸序列的矩阵

7 在权重矩阵中 如果您愿意 可以使用正值也可以使用负值

系统将默认使用正值 负值权重矩阵 选项MATRIX

蛋白序列空隙参数选项 PROTEIN GAP PARAMETERS

8

11

如果不使用NEGATIVE

可以打开一个菜单让您可

以设置蛋白序列比较结果的空隙罚分参数 该选项仅在蛋白序列比较中可用 更多信息

如果您想得到关于设置参数和ClustalW法则的更多信息 请从以下网址获取由原作者提供

的完整文件 www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/clustalw.html

序列翻译

激活序列

在GeneTank窗口的一个列表框内显示了原始序列以及由它翻译出的其他序列

产生翻译序列的机制如下

Translated DNA 从原始的蛋白序列推导DNA序列 由蛋白序列反推出的DNA 序列

注意 如果您多次翻译一段序列 忽略

或由原始DNA翻译出蛋白序列

再

只有最后一次的翻译结果才能被保留 而以前的翻译结果将被

Translated Protein 从原始DNA序列 DNA翻译而成蛋白序列 或原始蛋白序列翻译出

再由DNA序列反推出蛋白序列 推导DNA按钮

当前序列为原始或推导DNA时 该按钮不可用 当前序列为蛋白序列时 点击该按钮将会

激活一个Codon Table Selection窗口 您可以选择密码子列表和阅读框架 翻译结果中的多义 碱基请参照说明书的附录

可选操作

Translate > To DNA

翻译蛋白质按钮

当前序列为原始或推导蛋白序列时 该按钮不可用 当前序列为DNA序列时 点击该按钮

同样将会激活Codon Table Selection窗口 您可以选择密码子列表和阅读框架 如果原序列中 存在的多义碱基使密码子无法翻译成为蛋白残基 该残基位点会用*号代替

可选操作

Translate > To Protein

Edit Codon Table窗口

使用这一窗口 您可以创造新的密码子列表 删除或编辑已有的密码子列表 但PRIMER

PREMIER 提供的标准密码子列表是不能编辑的 使用 ADD 按钮创建新的密码子列表会

> 使用 Edit Codon Table Name对使用标准列表 并初始命名为

12

按钮则删除当前列表 话框可以编辑列表名称 使用 要改变某一密码子对应的氨 DELETE 基酸 只需要用鼠标将其拖放到相应位置就可以 点击密码子时鼠标指针会发生变化 提示您

正对其操作 任何拖放操作会改变两行内容 一行 即某种氨基酸 得到一个密码子的同时

另一行失去这个密码子

13

Primer 引物设计

Primer功能板块包括了设计引物的搜索引擎 软件包含了强大的自动搜索法则 只需要简 单的操作就可以得到合适的引物 PRIMER PREMIER 也提供了人工控制搜索引擎的方法 便

于根据您的特殊要求制定标准 输出的引物通过全面的即时分析工具计算出引物的多种参数和

二级结构 关键参数如Tm值 GC含量和自由能 G还能以图形显示 还有另一个窗口来显示

引物的比吸光度 activity 还可以将当前引物输 单位 nmoles/OD和ug/OD 及引物的分子量 入数据库打印或填写引物合成定购单

为设计用于定点突变的引物 该项功能板块也提供包括即使分析和限制性酶切位点分析的

引物编辑工具 您可以通过输入碱基或氨基酸残基来手动修改引物 为分析多对反应引物 如在复式及巢式PCR中 使用function菜单下Multiplex/Nested选项 您可以分析所有想用到的引物 软件提供将引物储 可以选择事先搜索的引物或手动添加引物 存到数据库的功能 也提供填写引物合成定购单的功能 定购单上会自动填入引物序列和其他 重要信息

Primer Premier 引物设计 窗口

Primer Premier 窗口是分析引物的关键 即点即选 Direct 引物设计 Select 引物性状列表和二级结构显示 具体介绍如下

Direct Select 即点即选 框

当您将鼠标指针移至该框中 指针将变为铅笔型 点击框中任何一处 会产生一条起始位 置最接近点选位置并与原序列互补的引物所有引物性状将即时更新 引物5 和3 末端也会标

记上以区分引物的扩增方向

如果点选一组序列比较结果 这使得您很容易知道引物 引物序列将依据保守序列来确定 与某一特定序列有哪些错配位点

在序列比较中应用即点即选功能

在利用高保守序列区域设计引物时 Primer Premier会在引物窗口显示序列比较 这样您

很容易知道引物与每一特定序列有哪些错配位点 点击序列任一地方将根据保守序列产生一条

引物并加以分析 引物也可以被编辑以便同某一特定序列匹配 这些可以用来设计针对等位基 因的引物 通过 View Majority or Minority 菜单选项可以切换显示多数倾向和少数分歧碱基

切换到显示少数分歧碱基可以看出哪些核苷酸不能很好的与所有序列匹配 Consensus

该项功能板块由以下部分组成

Preferences 参数设置 窗口 Primer Premier 引物设计 窗口 Edit Primer 引物编辑 窗口 Search Criteria 窗口 搜索标准 Search Parameter 搜索参数 窗口 Search Results 搜索结果 窗口 Multiplex/Nested Primer 复式及巢式PCR引物设计 窗口 Database 引物数据库 窗口

Synthesis Order Form 生成引物合成订单 Reports 结果报告 Graphs 图表

14

性状列表

这一列表显示了当前引物对的各种性状 您可以通过以下三种方式选择一对引物作为当前 引物对

Direct Select框 根据上述使用Direct Select的方法选择一条引物 切换到另一条互补链 选择反向引物 得到一对引物对

在Search Results 搜索结果 窗口里选择一对引物对

使用输出命令在数据库窗口里选择一对引物对.

注意 如果您想使用上述方法选择一条例如如正向引物而不是一对引物 反向引物来和新引物配对

您需要手动回复原来的

性状列表能自动更新正反引物的长度 起始位置 融链温度GC多 Tm 含量 GC% 义性 比吸光度 Optical Activity 单位ug/OD 长度条显示了 对于引物对来说 PCR产物的 长度 而PCR反应适宜的退火温度 各种引物性状计算公式请参阅附录A Ta Opt项显示了

二级结构

PRIMER PREMIER能即时分析引物二级结构 在左下的两排按钮可以想您显示发现了哪

些二级结构 而按下的按钮表明相邻的图框里显示的是何种二级结构 除了二级结构 图框里 也显示二级结构的自由能数值 G 单位kcal/mol

注意 如果有至少连续三个碱基配对 就会被认为能形成发卡

二聚体或错配之类的二级结构

在PRIMER PREMIER窗口内的图框里显示的是最稳定的二级结构 连续碱基配对用实线

就会给出当前二级结构的报告 您选 显示 而不连续碱基配对用虚线显示 按下按钮 All

择正向引物的发卡结构 并点击 All 就会显示以下内容

可能出现的二级结构按照稳定性大小自动排序

看到未显示的部分

除了上述功能 这一板块还具有激活以下功能的快捷按钮

Search Criteria 搜索参数

如果已经实施过搜索 窗口以及Edit Primer 引物编辑 搜索结果 窗口 Search Results

点击按钮可以使相应部分伴随引物对以图形显示 窗口

最稳定的一种排在最前

使用卷动条可以

15

Edit Primer 引物编辑 窗口

引物编辑 Edit Primer 窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列 Power Mac 在windows系统或的Command-X Command-C 及Command-V系统中 您可以

拷贝和粘贴 删除当前引物序列使用CTRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷键来实施剪切 并从

Paste 粘贴 剪贴板上粘贴是分析一条已有引物的好方法 进行粘贴时窗口会激活 用以

将引物序列转化为反向 互补或反向互补形式 您也可以手工键入引物序列 一旦引物被编辑

按钮即可分析编辑后的引物 发生变化 Analyze 按钮就可以使用 点击 Analyze

您可以修改实际序列或是翻译后的氨基酸残基 如果您修改氨基酸残基 相应位置可能出现多

义密码子

除了上述的引物性状和二级结构资料 具体参阅PRIMER PREMIER窗口的章节 该窗

口也提供了限制性酶分析功能 您可以通过点击 Enzyme 按钮 通过手动或软件提供的筛 选方案来选择一组限制性酶

您可以使用 Prime 按钮来将引物移动到更合适的结合位点 通常这项功能可以让您确 认是否有其它比当前位点更稳定更适合的结合位点存在

其他信息 如果您希望改变阅读框或使用其它密码子列表 请关闭本窗口 从主菜单上选 择Function >GeneTank激活GeneTank窗口 再选择 打开 Translate > Change ParametersSelect Codon Table窗口来改变阅读框或选择其它密码子列表然后重新打开本窗口

可选操作

Function > Edit Primer Search Criteria 搜索标准 窗口

以下是基本搜索标准的详细信息

根据PCR引物 测序引物或杂交探针的不同要求 选择不同的搜索标准是很有必要的

PRIMER PREMIER 会根据您的选择来调整自动搜索的标准 某些用以优化引物扩增能力的

标准不一定也适合测序引物或杂交探针的设计 这两者需要的是较高的退火温度 因此当您选 择不同的搜索标准 PRIMER PREMIER将对相关标准作出调整以适应不同的要求 搜索公式 中使用的具体参数请参看后面的Automatic Search Parameter 自动搜索参数 章节 Search Type 搜索类型框

当前引物找寻合适的反向引物

默认设置下 Search Range 搜索范围 是当前序列的全长 默认PCR产物长度为100 bp

到500 bp 如果您是搜索单个引物 该数值将不会起作用 您也可以为搜索设定Primer Length 引物长度 您将会在下一章节了解该项设定的具体作用

将指定您要搜索的是单个引物

两条单独引物 引物对或为

最后您可以设定Search Mode 搜索模式 为自动或手动 除非您有很特殊的要求或想完

全控制特定的搜索参数 建议您使用自动搜索 利用PRIMER PREMIER找到多条引物 再从

中通过详细分析来挑选合适的使用

可选操作

Function > Search

16

Search Parameter Windows 搜索参数窗口

搜索可以使用其它的自动搜索方法或者手动搜索

当您希望搜索的引物不会与其它存在与反应中序列发生错配 您可以在激活False Priming

按钮选择这些序列文件 选项后 利用 Files

Automatic Search 自动搜索

尽管PRIMER PREMIER已经自动设置了一些数值 您还是可以选择在自动搜索中需要使

用哪些参数 点击去掉相应参数左边框中的 则该参数在搜索中不会被考虑

自动搜索开始的标准很严格 但如果没有找到合适的引物 则标准会自动降低直到找到合 适的引物 下列图表中显示了在PCR 其中Tm值范围是 引物设计中自动搜索初始的严格参数 根据指定搜索范围中所有可能引物的Tm平均值确定的

如果您是搜索测序引物 则相应参数会有所不同 具体列表如下图

17

如果您是搜索杂交探针 则相应参数如下图

其他信息 如果您选择手动搜索 并点击Stringency 更新的图表

严格度

按钮

您会得到类似以上的自动

Manual Search 手动搜索 及引物设计原理

在过去十年中 PCR 二级结 为获得高效扩增 方法得到的很大发展 我们对引物稳定性 构和适宜长度的了解使得我们在保证引物特异性的前体下 大大提高了引物的扩增效率 而

PRIMER PREMIER 软件的搜索法则很好的维持了高效性和特异性之间的平衡

引物长度

引物的长度控制着引物的特异性和在PCR反应中的退火温度 对越多数实验 适宜引物长 度为18到24个碱基 等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建 library protocol 28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样

本的克隆能起到重要作用 长PCR 引物能给扩增带来更好的特异性 长引物也允许您通过降低 退火温度来能提高反应的灵敏度 不过长引物通常更易于形成包括发卡结构 二聚体 自身互 补等二级结构

理论上 在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡

PRIMER PREMIER 已经包含了合适的引物长度范围 如果您改变了它们 软件将会自 动记录并在下次使用 直到您再次改变它们 因此 您最好根据不同实验的特殊要求输入合适 的长度范围

PRIMER PREMIER 以最短的指定长度开始搜索引物 如果找到的引物的Tm值小于设定 范围或GC含量不符合要求 它将给引物增加一个碱基长度并重新计算Tm值和GC含量看其是否

符合要求 如果引物长度达到最大值还不能符合要求 则该引物将会被剔除 这种搜索机制保 证找到的引物是符合Tm值和GC含量要求的最短引物 为设计一条高效引物 有几个参数必须考虑 PRIMER PREMIER搜索所考虑的参数依次 如下

Tm 融链温度

PRIMER PREMIER根据相邻二碱基对作用理论 nearest neighbor theory 来计算融链

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温度 请参看附录A中关于公式的说明 选择的 Tm范围应该为退火提供足够的热度 在自动搜

PRIMER PREMIER 索中 使用的范围选择机制如下

首先 计算出指定搜索范围中所有可能引物的Tm值 得出平均值后 按照不同的严格度

要求确定的波动值 根据这一平均值来计算出Tm范围 根据已发表的实验数据 文献 Tm范围为56到63°PCRC 以上机制是被设 8 反应的合适 计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物

GC% GC 含量

对于 GC GC PCR反应来说 含量在50%左右比较合适 而对于测序引物和杂交探针来说

含量至少应为50% 请参看上文体参数 Automatic Search章节中的图表标明的各种搜索方法使用的具

Degeneracy 多义性 当设计多义引物时 应尽量减少引物多义性

这样会带来更好的特异性 应尽量避免 3 末端的多义性 因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸Degeneracy 多义性 详情请参看本说明的

章节

3’ End Stability 3 末端稳定性 引物稳定性影响它的错配效率 稳定性较弱的3 末端 一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5 末端和相对 如果引物3 稳定性强

5 末端不配对的情况下造成错 配 形成非特异性扩增条带 secondary bands 有可能在即使

而3 末端稳定性低的引物较好的原因是 在引物发生错配时 由于

3 末端不太稳定 引物结合不稳定 而难以延伸

GC Clamp GC

钳 引物与目的位点的有效结合需要有稳定的

5 末端 5 末端称为钳 它保证引物与模板的稳定结合 这一段有较强稳定性的 选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的

GC 前提下尽量降低退火温度

使用菜单Report > Internal Stability 选项可以看到象下图所显示的 一个引物的内部稳定性曲线表

19

请注意 上图就显示一个好的引物 3 末端稳定性较弱 而5 末端有一个较强的GC钳

Repeats and Runs 重复和循环

PRIMER PREMIER自动剔除任何有三个及以上的重复或循环碱基的引物 例如引物包含

ATATAT这样AT被重复三次 那么这个引物将被剔除 您可以设定可以接收的碱基重复的数量

Secondary Structures 二级结构

二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素 二级结构能显著影响反应中能与模板正

确结合的引物数量 发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力从而降低扩增效率 形

成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用

Hairpin 发卡结构 发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构 并 由于发卡结构的形成是分子内的反应 仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成 发卡结构的稳 定性可以用自由能衡量 自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需 要的能量 如果自由能值大于 如果自由能值小于0 则 0 则该结构不稳定从而不会干扰反应

PRIMER PREMIER软件中的 该结构可以干扰反应 按下按钮 All 可以使用 Hairpin Report

功能 帮助您回避类似二级结构

Dimer 二聚体 引物之间的配对区域能形成引物二聚体 它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结 构 它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物 二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向 引物之间形成 如果配对区域在3 末端 问题会更为严重 3 末端配对很容易引起引物二聚

体扩增 使用 Report功能可以预测二聚体的形成 Dimer False Priming 错配 如果引物可以结合除目的位点外的其他区域 扩增效率将明显降低 目的产物带将减少或 出现涂布 smear会检查每一条引物是否会与整个序列的其他位点形成 PRIMER PREMIER 局部的错配 3 末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基

配对 您可以分别设定确认为错配的3 末端或引物全长形成连续碱基配对的数量 Pair Rating 匹配度评分

匹配度低的引物对常常不太有效 是因为 Tm低的引物决定扩增的特 在同样退火温度下 异性 而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始 PRIMER PREMIER会计算

每一对引物的匹配度 100分为满分 并按照分数按降序排列 计算引物对匹配度以及单个引 物评分的公式请参看本说明的附录

Search Results 搜索结果

当您点击搜索程序窗口的 OK 按钮接受搜索结果后 Search Results 搜索结果 窗

口将会打开 它显示了搜索中找到的所有引物或引物对 如果您选择了一条引物或一对引物对

在PRIMER PREMIER窗口上将即时显示引物的分析结果 与当前的序列配对的引物的位置和 序列也会在Direct Select框上显示

其他信息 Search Results窗口的位置和大小是可以调节的 这样在其他窗口里您感兴趣的显示 内容 如引物分析结果 就不会被遮住了 可选操作

Function > Search Results

20

Motif Analysis 基序分析

种常用基序的分析功能软件为您提供了包括约165 同时也提供工具让你您方便的添加其

他基序 通过从默认群组中选择或剔除基序 您可以创建一个新的群组使用 并作为当前群组

来进行基序分析 基序分析可以采用以下几种格式显示 列表 图谱或序列

这一功能板块有下列两个部分 Motif Analysis Window 基序分析窗口

Edit Window 编辑窗口

Motif Analysis 基序分析 窗口

PRIMER PREMIER 为您提供的基序分析功能包含约165种基序 您可以启用群组编辑从

All Motif 全部基序 中添加或删除一些基序作为当前使用的群组 Selected Motif 框显 示了当前使用的群组包含的基序 它是全部基序的子集 被用来做基序分析 可以用下述方法 来选择当前群组

从 All Motif 框中选择您想添加的基序 添加到当前群组中 对于windows或Power Mac 系统而言 在点击同时按住CTRL键即可选择多个基序 按住SHIFT 可以选择两 键同时点击

次点击之间范围内的所有基序 使用 按钮将选中的基序加入到当前群组 在 Selected Add

按钮可以从当前群组中剔除特定基序 Motif 框中选择基序并点击 Delete 同样在 All Motif

框中双击某个基序即为添加 在 Selected Motif 框中双击某个基序即为剔除

Motif Sites 基序位点 窗口

按钮可以打开 OK在Motif Analysis窗口点击Motif Sites窗口 可选显示方法有

Table 列表 基序序列和数量 以及在分析序列上的位置 以表格形式列出基序

Sequence 显示所有基序在分析序列上的位置 序列 Map 图谱 在其中使用竖线表示所有的基序的位点 以长条形式显示序列Motifs Absent 列出所有在序列上没有或不符合预设参数的基序 不存在的基序

数字框 您通过指定基序数量限制 来有选择的显示基序分析结果 例如您点选 4 出 现多于或等于5次的基序将不会被显示

注意 如果某个基序出现多于50次 将只显示前50个 其余的则被忽略

Edit Motif 基序编辑 窗口

使用菜单的File >Print 您可以打印以Table Sequence 或Motif Absent 形式的分析结果

想要在All Motif群组中修改某一种基序 选择该基序并点击 Edit 按钮 可以激活 Edit Motif

点击 Add 按 基序编辑 窗口 识别位点和基序说明都可以修改 在这里 基序的名称

钮可以激活新基序窗口 其名称和识别位点采用默认设置 点击 Delete 按钮则可删除选定

基序分析窗口 的基序 点击 按钮则保存所有修改并返回Motif Analysis Window OK

注意 您无需每次修改都点击 OK 按钮 软件能记住您这一次的所有修改 可以保存所有修改 而点击 Cancel按钮则放弃所有修改

点击 按钮 OK 26

Menu Commands 菜单命令

以下功能板块都有自己的主菜单

GeneTank 主菜单

Primer Premier 主菜单 Enzyme Results 主菜单 Motif Results 主菜单

GeneTank 主菜单

File

New Sequence 重新打开一个序列空白的GeneTank 窗口 Open Sequence 提示您使用一个文件来打开已有序列

Save 将当前序列保存为一个文件 无需经过Import Sequence 窗口确认序列起始位置 您就可以打开一个这样保存的文件

Save As 将当前序列另存为指定文件

Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义 Print 使用不同格式及组合进行打印 Quit 退出 PRIMER PREMIER 最近打开的四个文件列表 Edit

通常的剪切 cut 复制 copy 和粘贴 paste 选项 Preferences 让您选择软件种使用的各种参数File主菜单下 某些版本该选项在 View

Show Header 显示在 GeneTank窗口打开的当前序列的文件题头 Sense Strand 显示当前序列的正链 Anti-sense Strand 显示当前序列的负链

ds DNA 显示当前序列的双链 Grouping个碱基一组的显示方式 选择 3个碱基一组或10

5’ Seq no 5 端起始位置并重新排序 某些版本没有该选项 指定序列 捷按钮

但在窗口上有快

Search 注意 相应选项在Edit主菜单下 某些版本没有该主菜单

Find 从当前位置开始在序列中查找特定序列段 Find Next 在序列中查找特定序列段的下一个出现位置 Go To Position 将指针移动到序列的指定位置

Function

Primer Design 选择该功能即根据预设参数开始设计引物

Restriction Enzymes 即根据预设参数进行限制性内切酶分析

Motifs 即根据预设参数进行基序分析

Bias majority by 当某一碱基不保守时 倾向以哪一序列为准 Speaker 语音校读

这一主菜单下的选项 除了当前使用的功能外都可选

27

Translate

To DNA 从当前蛋白序列反推DNA序列

To Protein 将当前DNA序列翻译为蛋白序列

Change Parameters 改变翻译的阅读框或密码子列表

Edit Codon Table 添加 删除或修改密码子列表

Window

这一主菜单列出除当前窗口外 已打开的所有窗口

选择其中一个将切换到对应窗口

Help

使用这一菜单查阅帮助文件 帮助文件中的信息与本说明大致一样 帮助以屏幕格式显示 并包含超链接 便于您快速转至相关主题 也可以使用搜索功能寻找主题

Primer 主菜单

File

Preferences 让您选择软件种使用的各种参数 Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义

Print 使用不同格式及组合进行打印 Quit 退出 PRIMER PREMIER Edit

Find 在序列中查找特定序列段 Find Next 在序列中查找特定序列段的下一个出现位置

Function

Search 打开 设定参数并开始搜索引物 Search Criteria window 搜索参数窗口

搜索结果窗 Search Results 如果已实施搜索 该选项将激活Search Results window

口

Edit Primer 您可以添加 删除和修改引物序列并进行即时分析 也可以将引物移动到下 一个最适合的错配位点

Multiplex/Nested 从搜索结果中选择相匹配的一组复式或巢式PCR引物 也可以添加或

删除新引物并放在已选择引物群组中分析 Database 添加 修改其中的引物的名称 对应链 序列及起始 删除或修改引物数据库位点 也可以生成引物合成订单 在以上菜单的分界线以下 还列出了另外三个功能板块 Report

Hairpin 显示所选的正向或反向引物的所有发卡结构 Dimer 显示所选的正向或反向引物的引物所有二聚体结构 False Priming 显示所选的正向或反向引物的所有错配位点 Internal Stability 绘出所选的正向或反向引物的内部稳定性图表

Optical Activity 显示引物的分子量及比吸光度 Hybridization Time 计算杂交时间 针对特定长度和浓度的引物 Graph

Melting Temp TmTm 图表 绘出全序列的引物 GC % 绘出全序列的引物 GC含量图表

Internal Stability 绘出五聚体的稳定性图表 单位Kcal/mol

28

Window

参看Gene Tank相关说明

Help

参看Gene Tank相关说明

Enzyme Results 主菜单

File

Preferences 让您选择软件种使用的各种参数 Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义

Print 使用不同格式及组合进行打印 Quit 退出 PRIMER PREMIER Function

Primer Design 选择该功能即根据预设参数开始设计引物 Restriction Enzymes 即根据预设参数进行限制性内切酶分析 GeneTank 显示窗口 GeneTank Motifs 即根据预设参数进行基序分析 Window

参看Gene Tank相关说明

Help

参看Gene Tank相关说明

Motif 主菜单

File

Preferences 让您选择软件种使用的各种参数 Degenerate Bases 给出所有可用多义碱基的列表及其含义

Print 使用不同格式及组合进行打印 Quit 退出PRIMER PREMIER Function

Primer Design 选择该功能即根据预设参数开始设计引物

GeneTank 显示GeneTank 窗口 Restriction Enzymes 即根据预设参数进行限制性内切酶分析

Motifs 即根据预设参数进行基序分析 Window

参看Gene Tank相关说明 Help

参看Gene Tank相关说明

29

附

附录 附录 附录 附录 附录 附录

A B C D E F

公式法则

多义碱基表

氨基酸缩写符号

软件上限

参考文献

系统要求

30

录

附录 A 公式法则

融 链 温 度 的 计 算 基 于 相 邻 二 碱 基 对 热 力 学 理 论 nearest neighbor thermodynamic theory 计算公式出自与Freier 等发表的文章 文献 7 这些是高度精确的相邻二碱基对Tm 计 算法则 为得到尽可能准确的计算结果 对公式进行了部分修正

引物融链温度Tm计算公式

Tm = H/ S + R ln C/4 H 是螺旋结构的焓值 S 是螺旋结构的熵值 C 是DNA浓度 [K+] 是盐浓度

+ 16.6 log [K+]/ 1 + 0.7 [K+] - 273.15

每一条寡聚核苷酸的 H 和 文献2 计算 由于 S 根据 Breslauer K.J.提出的理论

Breslauer K.J.使用的热力学计算方法是在1M的Na+条件下 所以有必要加入一个参数[K +]来 根据盐浓度修正公式 [K+]的计算要同时考虑反应体系中的单价离子和游离Mg2+ [K+]数值由 以下公式计算 Sprt即取平方根

[K+] 单价离子浓度 4 Sqrt 游离 Mg2+离子浓度 1000

盐浓度即[K+] 在参数设定 preferences 中也称为Na+ 当量 会根据单价离子和游离Mg2+

浓度而自动更新 默认单价离子和游离Mg2+T浓度分别为50.0 mM 和 1.5 mM 这样总盐浓度 等于204.9 mM 在文献7 Freier et al. 提供的计算公式中 C值是没有自身配对时退火的寡聚核苷酸的

总浓度 它即不是引物浓度也不是起始模板浓度 而是PCR过程模 产物的浓度 由于在PCR 板的浓度变化很大 很难确定C的具体数值 根据文献 et al. 一般经 11的建议 Rychlik, W. 验公式在普通PCR反应和测序反应中将其当作 您可以打开 250 pM 通过File 菜单下的选项 Preferences窗口来修改这项预设值 产物融链温度Tm的计算公式

由于相邻二碱基对 nearest neighbor 模型只适用于例如引物的寡聚核苷酸 PCR产物

的融链温度不能使用该模型提供的公式来计算 计算较长的双链DNA 可以使用Wetmur J.G. 文献12 的公式

产物Tm=81.5 + 16.6 log

[K+]/ 1+0.7[K+]

盐浓度即[K+] 在参数设定 preferences

物的GC% 和长度也要考虑在内

最适宜退火温度计算公式Ta Opt

PRIMER PREMIER 使用Rychlik的公式 文献11 自动预测引物对的优化退火温度

PCR反应的退火步骤使用该优化退火温度 能提高目的产物产量并减少错误的产物

中也称为Na+ 当量

+ 0.41 %G + %C

也是由上述公式得来

- 500/length

产

Ta Opt = 0.3

引物Tm

+ 0.7

– 25

在公式里的引物Tm是相对不稳定的引物

链温度 计算方法参看上述相关章节

产物Tm

在

产物对的融链温度

产物Tm则是PCR产物的融

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自由能 G 计算公式

焓值和熵值的计算是基于Breslauer等 文献11 其中包含共 建立的热力学参数集 10种

Watson-Crick DNA的相邻二碱基对作用 nearest-neighbor interactions 模式 根据这种方

法一段寡聚核苷酸的自由能可由其中每一双核苷酸的焓值和熵值以及预设参数中指定的温度计 算出来 该预设温度可以在Preferences窗口根据实际的环境温度进行修改 该实验特指在1M

NaCl浓度下的PCR反应

G= H– T H 为焓值 T 为温度 S 为熵值

S

3 末端和内部的配对都能形成二级结构 而3 末端封闭的二级结构对扩增效率的影响更

G值将减去大 考虑到这一点 1 3 末端的二级结构自由能

单个引物评分 Rating 公式

Rating = 100 - G Dimer 1.7 + G Hairpin 1.4 + G False Priming 1.5

错配 二聚体 评分 100 - 发卡 G 1.4 + G 1.5 G 1.7 +

当引物搜索完成后 一般很难判断可供选择的引物中到底哪些引物会有较好的扩增效果

PRIMER PREMIER 将根据引物二级结构的稳定性自动给引物评分并按评分排序 如果引物

二级结构较稳定 其评分就较低 反之 二级结构较不稳定 评分就较高 评分是根据引物形 成二级结构稳定性的热力学数据来计算 这些数据在评分中占的权重系数是根据经验确定的 这些系数可以在Preferences窗口修改

引物对评分 Rating 公式

Rating = Average of sense and anti-sense primer rating - Tm difference between

primers 1.7 1.3 - G Cross Dimer

评分 正反引物平均评分 G 1.3 Tm – 交叉二聚体 差异 1.7

Tm差异和交叉二聚体自由能 G引物对评分是根据正反引物的平均评分 计算的

32

附录 B 多义碱基表

以下是软件可以识别的DNA中多义碱基的代码及含义

代码 含义 B 除了A D 除了C H 除了G I 次黄嘌呤 K G或T/U M A或C N

A C G T/U R A 或G S C或G V 除了T/U W A或T Y C或T/U33

附录 C 氨基酸缩写代码

单字母记号 A C D E 以下是氨基酸的单字母记号和三字母记号

三字母记号 Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr

英文名称 Alanine Cysteine Aspartic acid Glutamic acid Phenylanaline Glycine Histidine Isoleucine Lycine Leucine Methionine Asparagine Proline Glutamine Arginine Serine Threonine Valine Tryptophan Tyrosine

中文名称 丙氨酸 半胱氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 苯丙氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 亮氨酸 甲硫氨酸 天冬酰胺 脯氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 丝氨酸 苏氨酸 缬氨酸 色氨酸 酪氨酸

F G H I K L M N P Q R S T V W Y

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附录 D 软件上限

引物长度

序列长度 最大限制性内切酶识别位点长度 最大切点显示数量 最大引物对搜索数量 70nt 50 kb 19 50 1000

35

附录 E 参考文献

1. Lathe, R. 1986 \

data theoretical and practical considerations\ 2. Breslauer, K.J., Frank, R., Blocker, H., and Markey, L. A. 1986 \

stability from the base sequence\

3. Groebe, D.R., and Uhlenbeck, O. C. 1988 stability\

\

4. Jung, V., Pestka, S. B., and Pestka, S. 1990 \

containing terminal restriction endonuclease recognition sites\ 6156 5. Kwok, S., Kellogg, D. E., McKinney, N., Spasic, D., Goda, L., Levenson, C., and Shinsky,

J. J. 1990 \

human immunodeficiency virus type I model studies\

6. Holton, T. A., and Graham, M. W. 1991 \cloning of PCR products using ddT-tailed vectors\ 7. Freier, S.M., Kierzek, R., Jaeger, J.A., Sugimoto, N., Caruthers, M.H., Neilson T., and

Turner, D.H. 1986 \

stability\

8. C.W. Dieffenbach, T.M.J. Lowe, and G.S. Dveksler Primer Design\

1993

\

9. Shirley Kwok, Sheng-Yung Chang, John J. Sninsky, and Alice Wong 1994 \

the Design and Use of Mismatched and Degenerate Primers\ Applications.

10. Kenneth H. Roux 1995 \

Applications.

11. Rychlik, W., Spencer, W.J., Rhoads, R.E. 1990 \

temperature for DNA amplification in vitro\

12. Wetmur, J.G. 1991 \

Applications of the Principles of Nucleic Acid

Hybridization\

13. Vinay K. Singh, A.K. Mangalam, S. Dwivedi and S. Naik 1998 \

Program for Design of Degenerate Primers from a Protein Sequence\

318-319.

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附录 F 系统要求

处理器 内存

对于Windows操作系统

Windows 98/NT 4/2000

最低配置 Pentium 100 MHz 32 MB

推荐配置 Pentium 166 MHz 64 MB

对于Power Macintosh操作系统 7.0 或更新

处理器 内存 最低配置 Power PC 56 MB

推荐配置 PC G3 64 MB

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服务与技术支持

PREMIER Biosoft International 公 司 保 证 尽 力 提 供 最 好 的 服 务 保 证 为 所 有 PRIMER PREMIER用户提供终身免费的技术服务 可以通过电话 传真或电子邮件提供高度专业化的 技术支持

其他信息

欢迎您通过电话 传真PRIMER PREMIER软件或Biosoft 电子邮件或信件向公司了解关于

International公司其他产品的信息 联系方式如下

PREMIER Biosoft International 3786 Corina Way

Palo Alto, CA 94303-4504 电话 650-856-2703 传真 650-843-1250 电子邮箱 support@PremierBiosoft.com

网址 www.PremierBiosoft.com

译者后记

Primer Premier是一个不错的引物设计软件 据我所知 使用这个软件的研究工作者为数 不少 也许其他高手的忽略 也许是软件的使用本就容易上手 而无需仔细研究 至今我没有

见到其说明书的详尽翻译 这使得我有机会为大家作上一点贡献 来回报多年共享的资源

这篇说明书本身也是比较详尽 我自认为对该软件已经很熟悉 仍通过翻译发现了某些未 曾使用的技巧 而且说明书中关于引物选择等理论阐述相信也会有所帮助 同样因此 翻译中 涉及大量生物学和热力学专业术语 翻译不当在所难免 所以我将大部分术语原英文附后 便 于大家查对 菜单选项 窗口名称为了与软件使用对应 一般采用了英文原文

软件的版本不同 其界面和操作菜单可能也有少许差异 另 我也在说明书中尽量注明了 外 为了清晰起见 本中文说明书中的软件插图均是重新截图 同样因为版本问题 与原英文 说明有些不同 如蛋白质翻译截图 为编辑方便 原说明中的按钮截图都省略了 而以文字 说明代替 术语索引也去掉了 请大家见谅

翻译中留下我的电子邮箱 主要目的是希望大家对于翻译的错误进行指正 如有必要会推 出修正版本 对于软件使用的问题只怕难以一一解答

最后感谢生物软件网 www.bio-soft.net 和谈杰站长多年来对生化专业软件的介绍和推 广 感谢生物软件网支持和鼓励软件说明的翻译汉化 让更多人能在研究中方便的应用优秀的 国外专业软件

Wenkelly

Wenkelly@163.com 2003.08.19

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/cro5.html