骨髓间充质干细胞的生物学特性及临床应用前景

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骨髓间充质干细胞的生物学特性及临床应用前景 骨髓间充质干细胞的概念骨髓间充质干细胞 (Mesenchymalstemcells,MSCs) 是骨髓中的非造血干细胞 , 早期分离培养时 , 其外观呈成纤维细胞样而被称为“成纤维细胞集落形成单位 (Colony-formingunit-fibroblastic,CUF-F) ”或“骨髓基质成纤维细胞

(Marrowstromalfibroblasts,MSF) ”。随着研究的深入 , 人们发现其对骨髓血系细胞起支持诱导作用 , 可促进造血细胞克隆的形成 , 因而推测这种细胞可能是间质细胞的前体细胞 , 又因其来自于骨髓基质 , 因而称其为“骨髓基质细胞

(Bonemarrowstromalcells,BMSCs) ”。近年来 , 因其在不同的诱导条件下能分化成成熟的间质细胞 , 如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、网状细胞、血管内皮细胞等 , 又称其为“间充质干细胞”或“间充质祖细胞”。研究 MSC 的细胞周期发现 ,MSC 中有 90% 处于 Go/Gl 期 [1], 说明 MSC 具有高分化潜能。目前的研究显示 ,MSC 的终末分化有可能跨越胚层界限 , 超越传统意义上的分化为中胚层来源的间质细胞 , 而向实质细胞转化 , 如分化为心肌细胞、神经细胞等 , 这一研究成果不仅具有重大的理论意义 , 而且有着广泛的临床应用前景。 2 骨髓间充质干细胞的分离、培养骨髓中间充质干细胞的数量极少 , 成人骨髓平均 10 万个有核细胞中含有 1 个 , 且随着年龄的增加 , 细胞数量逐渐减少 , 因此 , 如何获取高纯度的 MSC 相当重要。常用的分离 MSC 的方法有全骨髓法和离心法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性 , 定期换液除去不贴壁细胞 , 如造血系细胞等 , 达到分离纯化 MSC 的目的。离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同 , 提取单核细胞进行贴壁培养。为了获得更高纯度的 MSC, 有人利用流式细胞仪法、免疫磁珠法等对 MSC 进行分离纯化 , 结果令人满意。 MSC 的培养采用常规的组织细胞培养方法 , 艾国平 [2] 的研究表明 , 选用 4 ～ 24h 贴壁的有核细胞进行传代培养最适宜 , 培养基中胎牛血清含量为 5% ～ 10%, 细胞接种密度为 (4 ～ 8) × 104/ml 最利于细胞生长 , 培养细胞在 3 ～ 4d 进入对数生长期 , 随后进入平台期 , 分裂相细胞明显减少 , 前 10 代细胞传代周期为 3 ～ 4d, 以后生长速度逐渐减慢。另有报道骨髓 MSC 在 12 代以内核型正常 , 且保持端粒酶活性 [3], 表明 MSC 有很强的体外扩增能力 , 但又有别于恶性肿瘤细胞而不具备永生性的特点 [4] 。 3 骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及在组织工程方面的应用前景组织工程学是刚刚发展起来的新兴的应用学科 , 它是利用体外培养的方法将某些具有干细胞特性的细胞诱导分化为我们所需要的组织甚至器官以供临床所需。大量的研究表明 , 骨髓间充质干细胞具有高度的自我复制能力和多向分化潜能 , 在不同的诱导条件下 , 可分化为骨及软骨组织 , 肌肉及肌腱组织 , 心肌细胞 , 神经细胞等。由于 MSC 可取自自体骨髓 , 取材方便 , 由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥等问题 , 因此可作为组织工程的种子细胞来修复各种病变和缺损组织 , 从而使得器官、组织的修复和重建成为可能。 3.1 MSC 可分化为骨及软骨细胞用于骨及软骨组织损伤的修复 : 人类由于创伤、疾病所导致的骨及软骨缺损是一个发生率高治疗难度大及费用昂贵的医学难题。特别是软骨细胞由于没有迁移能力导致软骨的内在修复能力极弱甚至不存在

, 因此软骨缺损修复无法依赖病人的自然康复。动物实验证明 , 通过体外扩增并诱导骨髓 MSC 为所需细胞 , 然后植入受损组织加以修复 , 可收到较好的效果。目前使用较多的方法是先用体外培养扩增后的 MSC 与支架材料复合制备成细胞 - 材料复合体 , 然后再植入缺损部位。如 Kadiyala[5] 等将犬的 MSC 在体外培养扩增后 , 贴附在生物材料上 , 修补股骨骨干缺损 ,MSC 成骨分化较对照组快。同样 , 通过 MSC 体外培养及诱导分化 , 将覆盖有已分化为软骨细胞的碳纤维网植入兔受损关节部位 , 结果比单纯植入碳纤维网也显示出更明显的促进关节软骨修复的作用 [6] 。这些研究为骨髓 MSC 在骨和软骨损伤的治

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疗中展示了良好的应用前景 , 特别是通过开发新型的可吸收的组织工程材料 , 与 MSC 联合应用 , 将具有重要的应用价值。 3.2 MSC 可分化为骨骼肌细胞用于肌肉组织退行性疾病的治疗 : 随着年龄的增长 , 机体的组织器官会出现退行性的改变 , 并造成一些相关疾病 , 如肌萎缩、肌营养不良等。但肌细胞的再生比较困难 , 有赖于分散的卫星细胞 , 而卫星细胞数量少 , 难于分离和培养 , 因此如何促进肌肉组织的再生一直是人们关注的问题。实验证明 MSC 体内和体外能分化为肌细胞 , 使其有望成为肌组织再生的靶细胞。 1995 年 Wakitanis[7] 等将兔 MSC 用 5 氮胞苷诱导后 , 产生含多个长核的肌管细胞。 1998 年 ,Ferrari[8] 等将带有 lacZ 基因小鼠的骨髓移植给胫骨肌肉损伤的免疫缺陷小鼠 , 移植后 2 ～ 3 周取小鼠的骨骼肌和心肌检测 , 发现β - 半乳糖苷酶明显超过肌卫星细胞数 , 进一步证明了 MSC 的成肌能力。将 MSC 与支架材料复合在一起有望再造肌肉组织 , 从而使肌萎缩、肌营养不良等疾病得到有效治疗。 3.3 MSC 可分化为心肌细胞及内皮细胞用于治疗冠心病 : 冠状动脉病变所引起的急性心肌梗死以及心梗后心衰是临床常见的心血管疾病 , 由于后果严重 , 常常会危及病人的生命 , 因此被视为临床急重症之一。目前的研究资料显示 : 心脏不是一个终末分化器官 , 尤其在心衰终末期和急性心肌梗死时 , 心肌细胞的有丝分裂成倍增长。但单纯依赖存活的心肌细胞加快有丝分裂难以彻底恢复心脏泵血功能、控制心衰发生。所以适时将 MSC 导入梗死周边地带的心肌 , 在心肌微环境中诱导分化出能与存活心肌协同工作的心肌组织 , 就有希望治愈心梗 , 减少心梗后心衰的发生。 1999 年 ,Makino[9] 等人第一次体外在 5- 氮胞苷的作用下将 MSC 诱导分化为心室肌细胞。 Kocher[10] 等将成人 MSC 分化出的内皮细胞前体导入缺血损伤的心肌 , 可以显著促进心肌梗死部位的血管生成 , 缩小心肌梗死面积 , 减少疤痕组织形成 , 改善心室重构 , 提高心功能。 2001 年 8 月 , 德国 Heinrich-Heine 大学医院宣布自体成人骨髓干细胞移植治疗 1 例急性前壁心肌梗死的 46 岁男性病人获得成功 [11], 表明心梗治愈成为可能。 3.4 MSC 可分化为神经细胞用于治疗神经系统疾病 : 神经细胞属于终末分化细胞 , 因此 , 神经系统受损伤后无法通过神经细胞的再生而得以恢复。中枢神经系统中干细胞群的发现使人们对于神经再生有了新的认识。人们已经开始通过神经干细胞的移植来治疗神经系统疾病。但是成人的神经干细胞不易获得 , 从活体组织中获得神经干细胞具有一定的危险性 , 异体移植也容易产生排斥反应。因此神经细胞的组织来源一直是这一领域最棘手的问题。近年的研究发现,MSC 不仅易于获取 , 而且在一定的诱导条件下能分化成神经细胞 , 使其可能成为神经移植供体细胞的新来源。在 Lu[12] 等建立的脑创伤模型中 , 创伤后 ld 尾静脉途径输注 MSC,15d 后处死动物。期间观察神经功能的指标的恢复情况发现 MSC 迁移到受损大脑的实质 , 并表达 NeuN 和 GFAP 。实验组运动和神经功能受损情况明显好转。 Li[13] 等建立了鼠栓塞性大脑中动脉闭塞模型 ,4d 后在麻醉状态下纹状体内注射 MSC,28d 后处死动物 , 发现供体的 MSC 在脑内存活 , 并迁移到距注射部位 2.2mm 处。其中有 1% 的细胞表达 NeuN,8% 的细胞表达 GFAP, 表明 MSC 在体内已经分化为神经元和神经胶质细胞 , 实验组的神经功能恢复情况明显好于对照组。由此可见 MSC 自体移植治疗神经系统疾病的可行性 , 这打破了以前认为脑细胞受损后不能再生和功能不能恢复的观点 , 为中枢神经系统功能重建和再生提供了新的途径。 4 骨髓间充质干细胞在基因工程方面的应用前景 MSC 不仅具有多向分化潜能 , 近年还发现其易于外源基因的转染和表达 , 因而被认为是很好的基因载体。研究者认为 , 对于由基因突变引起的疾病 , 其治疗可以通过将正常基因转入患者自身的 MSC 内 , 经体外培养扩增后再回输到病人体内而实现。如成骨不全是由 I 型胶原编码基因的一个碱基发生突变引起的。携带有正常基因的自体 MSC 输回病人体内后将定居骨髓并自我繁殖 , 当它们最终的后代自然替代了病人原有的成骨细胞时 , 骨就将由正常的 I 型胶原基质构成 [14] 。除此以外 , 还可将骨生长诱导因子 , 如 BMP2 和 BMPl2 等基因转入 MSC, 用于刺激骨生长 , 加速创伤修复。因

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此 ,MSC 有望成为基因治疗的靶细胞 , 在基因工程方面有着广阔的应用前景。 5 MSC 支持造血 , 用于治疗造血系统相关疾病 MSC 是否具有向造血细胞分化的能力 , 目前尚未见文献报道 , 但 MSC 支持造血的作用却得到了公认。 MSC 作为骨髓基质细胞的一部分 , 构成了造血微环境的主要细胞 , 在造血调控中发挥重要的作用。研究表明 , 体外培养的 MSC 能分泌 IL-6 、 IL-7 、 IL-8 、 IL-11 、干细胞生长因子 (SCF) 、巨核细胞集落刺激因子 (M-CSF) 、 Fit-3ligand 、基质细胞源性生长因子 (SDF) 等细胞因子 [15], 其中大部分细胞因子都具有促进造血细胞增殖和分化的作用 , 同时 MSC 在一定诱导条件下具有向基质细胞分化的能力 , 弥补了在损伤情况下由于基质细胞的缺乏导致的造血功能障碍。 Koc[16] 等报告了 32 例乳腺癌患者在接受大剂量化疗后 , 利用自体 MSC 在体外培养扩增 , 与自体外周血干细胞一并移植 , 移植后没有观察到任何的毒性反应 , 移植后 8d 中性粒细胞和血小板的数量恢复到正常水平 , 表明 MSC 能快速恢复造血。王金福 [17] 等利用扩增的脐带血造血干 / 祖细胞的植入潜能来支持患者高剂量化疗 , 患者平均在 26d 后表现出嗜中性粒细胞的植入 , 植入时间较 Koc 的报告略长了些。为了缩短植入时间 , 他们将自体 MSC 与脐带血造血干细胞共培养 , 目的是以 MSC 作为造血干 / 祖细胞培养扩增的基质细胞 , 提供造血干 / 祖细胞扩增所需的造血微环境。结果表明 , 共培养体系的有核细胞开始出现增加趋势的时间比非共培养体系要早 l ～ 2d, 有核细胞扩增的倍数要多 , 进而提高了 CD+细胞的数量。另有研究表明 , 无关供者支持受者造血干细胞体外扩增的过程中不会激活针对供者抗原的反应性淋巴细胞 , 即间质干细胞具有下调异基因免疫反应的特性 , 可减轻 GVHD 的发生 [18] 。 2003 年 3 月 , 江苏省人民医院血液科为两位淋巴瘤细胞白血病患者施行异基因造血干细胞与间充质干细胞联合移植 , 供者分别为人类白细胞抗原半匹配的胞兄和母亲 , 移植后两位患者的造血功能快速恢复 , 无 GVHD 发生。经骨髓细胞形态、染色体分析和分子生物学检查证实 , 再生细胞为供者来源 , 这标志着大多数白血病可得到有效根治。 6 问题与展望最近几年 , 人们对 MSC 的生物学特性和潜在的临床应用的认识有了显著的提高。如上所述 , 骨髓 MSC 具有高度的分化潜能 , 易于分离培养和扩增 , 易于外源基因转染和表达。易于获得及移植且可避免排斥反应 , 使其具有重要的研究和应用前景 , 特别在细胞治疗和基因治疗中有重要临床应用价值。但是仍有许多问题尚未解决 , 如分离 MSC 有效成分的方法尚不稳定 ,MSC 特异性的表面标记尚不清楚 , 在体外扩增、定向分化的条件尚不成熟。早期曾有报道 , 给狗植入基质成分 ,956d 以后有一只狗死于呼吸衰竭。解剖发现 , 其双肺出现多个骨髓移植物造成的骨化位点 , 提示 MSC 有可能出现异常分化。另外 ,MSC 分化为神经细胞后 , 是否具有神经细胞的一系列功能 , 移植后的神经细胞之间能否建立精确的联系 , 分化细胞的寿命如何 , 是否会出现过早夭折等均需进一步研究。再有 , 目前的 MSC 的移植实验多为先在体外诱导分化为相应组织细胞后再植入体内 , 倘若对其进行诱导分化操作会改变细胞特性 , 那么一旦大量运用到临床治疗上 , 就会发生种种无法预测的可能。由此可见 , 目前对 MSC 仍有许多未知领域 , 但我们相信随着 MSC 研究的深入 , 应用 MSC 进行的疾病治疗广泛应用于临床将会成为现实.(摘自 陕西医学杂志2004年12月第33卷第12期)

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