拟南芥中通过开花时间决定基因SOC1和其上游负调节基因

拟南芥中通过开花时间决定基因SOC1和其上游负调节基因

FLC介导低温响应和开花之间的相互关系

在适当的时间开花是植物成功繁殖的重要因素，因此，开花由复杂的遗传网络所调控这一事实就显得不足为奇。这个遗传网络由内源信号和环境因素所协调调控。拟南芥决定开花时间的基因SOC1编码MADS box转录因子，而且是关键的开花激活子之一，他和多个开花诱导途径相互作用，即与光周期途径，春化途径，自组织途径，以及赤霉素依赖途径相互作用。为了阐明SOC1基因的下游靶基因，作者采用了微阵列分析，分析显示soc1-2敲出突变增加了低温响应基因CBF和CBF下游基因COR的表达，而SOC1过表达降低了低温响应基因CBF和CBF下游基因COR的表达，这表明SOC1负调节低温响应基因的表达。相反的，低温诱导基因CBFs的过表达增加FLC的表达从而导致低温开花延迟。FLC是SOC1上游的一个负调节子。作者的实验证明在低温响应和开花决定调节基因之间存在反馈环;当春寒在瞬间到来时这个反馈环通过增加FLC的表达来延迟开花时间，而当早春的时候通过SOC1抑制低温响应基因的表达抑制低温响应从而使得开花诱导的发生。

前言

开花是植物从营养生长到生殖生长的过度，在植物的生长周期中是最大的改变。为了使繁殖成功率达到最大。植物通过进化形成了错综复杂的机制响应环境因子（如光和温度）和反应植物发育阶段和年龄的内源信号来确定开花时间。同时开花时间由各种非生物胁迫所调节，例如，营养缺陷，热和冷。对拟南芥大量的遗传学和生理学分析研究表明开花诱导至少由四个主要遗传途径所调节，即光周期途径、春化途径、自主途径和GA途径。这四个途径通常调节所谓的开花途径中的FT, SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1 (SOC1), 和LEAFY (LFY)，确切的开花时间由这些基因表达水平所决定的。两个中心上游调节子负调节这些基因：CONSTANS (CO)是编码锌指蛋白的基因，FLOWERING LOCUS C (FLC)，是编码MADS盒转录因子的基因。CO调节光周期途径，是一个正的调节子。而FLC调节春化途径/自主途径，是一个负调节子。

除了四个主要途径，开花和其他的机制相互协调。例如:开花时间由环境温

度所调节，低温推迟植物开花，而高温加速植物开花。在拟南芥中，通过FCA, FVE, 和 SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP)基因感受环境低温，在开花期fca, fve, 和

svp突变对环境低温表现出不敏感。FCA和FVE是自主调节途径中的两个基因，其功能是抑制FLC的表达，SVP是一个开花抑制子，和FLC形成开花抑制复合物。 所谓的热感受途径最终调节FT的表达。类似的，通过增加FT的表达环境高温加速开花。但是，FLC抑制这种作用，且由FLC同系物FLOWERING LOCUSM(FLM)所调节。

间歇的低温处理，在一天中短期的低温处理，也延迟植物的开花，由FVE所介导，fve突变，显示出通过增加FLC的表达延迟植物开花，没有低温处理的情况下表现出COR过表达。另外，他显示出低温耐受而且开花时间没有被间歇低温所延迟。表明FVE是开花时间和低温响应间的遗传连接。

低温诱导许多编码植物耐受低温的基因的表达。如COR基因在它们的启动子中有一个C-repeat/dehydration response elements (CRT/DRE)。在拟南芥中CBF是低温响应途径中的关键调节因子，据报道CBF1, CBF2,和CBF3基因的过表达导致植物开花延迟和矮化的现象，同时和植物的低温耐受有关，例如增加Pro 和sugar的含量以及COR基因的转录激活。ICE1正调节CBFs基因。ICE1编码MYC类basic helix-loop-helix转录因子。但是他们被HOS1所负调节。HOS1编码RING指蛋白，很可能作为E3泛素连接酶。

尽管开花途径中SOC1基因的调节已经有了相当深入的研究，但是SOC1下游的基因的研究仍旧不太清楚。为了说明编码MADSbox转录因子的开花基因SOC1下游靶基因，作者采用了利用过表达和突变的微阵列实验。这里，作者报道说开花激活基因SOC1在低温响应过程中通过直接对CBF基因的抑制起着负调节的作用。相反的，CBFs的过表达增加了FLC表达水平。总之，作者的实验结果表明SOC1和FLC是低温响应和开花时间调节间相互交谈的关键因子。SOC1,cold response genes,和FLC构成的反馈环可以阻止植物在秋天和早春的低温条件下开花提前，从而成为一个进化优势。 结果

SOC1负调节低温诱导基因

为了检测由SOC1基因调节的全部基因，作者采用了用Affymetrix

ATH1GeneChip技术进行微阵列分析作为一个初步的筛选。作者从在长日照条件下处理7天后的过表达等位基因 soc1-101D，一个无效等位基因soc1-2，和野生型(Col)植株中提取RNA。样品采用7天大的苗是因为所有的基因包括早期开花基因soc1-101D在这个时期的营养期，这由APETALA1表达的缺失所决定的。有趣的是：SOC1负调节的20个基因中的六个是众所周知的低温诱导基因。 为了确定是否SOC1的功能缺失和功能突变影响低温诱导基因的表达，作者用RNA凝胶印迹法在soc1-2 和 soc1-101D中进行了一系列基因的表达分析。如图所示：在22度的长日照条件下，四个低温诱导基因COR15a, COR15b, KIN1,和KIN2,在soc1-2中表现出表达的增加，在soc1-101D中表现出表达的降低。因为低温响应基因受昼夜节律所控制，因此作者检测了COR15a的昼夜节律表达作为一个代表性的低温诱导基因。它在黎明后的12H有一个表达峰且在夜晚表达量降到最小。在这个昼夜循环中与野生型相比soc1-2表现出更高的表达量，而soc1101D显示出更低的表达量，尽管在12h峰处观察到最大的不同。这个结果告诉我们SOC1负调节低温诱导基因的表达不被昼夜节律所影响，尽管振幅改变了。下面，作者想知道是否SOC1影响低温诱导基因的诱导动力学。作者黎明后立即用4度低温处理，因为在自然界中黎明的温度是一天中最低的，如图1C所示：与野生型相比，soc1-2对COR15a的诱导表现的更强壮，soc1-101D对COR15a的诱导显得更弱一些，这个结果强烈的表明SOC1减弱植物响应低温时COR的表达。

SOC1直接抑制CBF基因的表达

大多数COR基因在它们的启动子区都有低温和脱水响应DNA调节元件称作CRT/DRE，COR基因的表达由CBF基因家族调节CRT/DRE元件介导。为了确定是否SOC1对COR基因的负调节是通过CBF所介导的，作者比较了野生型, soc1-2,和soc1-101D中CBF1, CBF2,和CBF3基因的表达情况。soc1-2中CBFs的表达量增加了而在soc1-101D中CBFs的表达量降低了。作者同时对三种基因型的植株的CBF3一天中节律调控表达进行了比对。CBF3的表达在黎明后的8H时间出表现出表达高峰，它在COR15a表达高峰前4个小时时出现。与COR15a类似的是，在日循环中CBF3在soc1-2中的表达量增加了，而在soc1-101D中的表达量降低了。另外，植物在响应低温处理时在soc1-2中的CBF3 基因的表达比野生型的

高，而在soc1-101D中CBF3 基因的表达比野生型的低，尤其是低温处理两小时后。因此，在soc1-2植株中各种COR基因表达量的增加可能是增强CBFs表达的结果。

在低温响应途径中，ICE1和HOS1分别是CBF家族上游的正调节基因和负调节基因。为了确定是否SOC1基因调节ICE1和HOS1的转录水平，通过RNA琼脂糖电泳分析检测了ICE1和HOS1的表达情况。与野生型植株相比在soc1-2 或soc1-101D植株中ICE1和 HOS1的表达并没有发生改变。另外，ZAT12，CBF1和CBF2上游的一个负调节子也被低温处理所诱导，但是也不受soc1-101D 或 soc1-2基因所影响。因此，这些结果表明SOC1通过抑制CBF基因的表达抑制低温响应途径。

据报道，SOC1是MADS box转录因子，它和LFY启动子中的CArG box的可变区相结合。启动子分析显示三个CBF基因在远端区和近端区有两个CArG boxes的可变区。因次作者想知道是否SOC1直接与CBF基因的启动子结合。LFY启动子的两个区域用做为染色质免疫沉淀实验的正对照和负对照。ProLFY-1，LFY启动子的远端区域，与soc1-2相比soc1-101D植株中高度富含ProLFY-1，而LFY启动子的近端区域ProLFY-4在 soc1-101D植株中没有富含。有趣的是，ChIP分析显示在CBF启动子中所有的CArG-box区被SOC1过表达所富集。这个结果表明SOC1通过直接抑制CBFs的转录负调节低温响应。

CBF基因激活FLC的表达

已报道CBF基因的过表达造成植物开花延迟，但是并没有阐明原因。因为FLC是拟南芥中开花途径中的中心抑制子，作者检测到CBF 基因的过表达增加了FLC的表达。的确，FLC的表达在35S-CBF1, 35S-CBF2, 和5S-CBF3植株中增加了接近两倍。作者同时检测了SVP的表达，编码另一个MADS box转录因子的开花抑制子。因为SVP介导环境低温延迟植物开花且和FLC相互作用形成开花抑制复合体。与FLC相反的，CBF过表达不影响SVP的表达。FLM，是包含在FLC进化树中的基因，在温暖的温度条件下抑制开花合调节花期。FLM的表达不被CBF基因过表达所影响，这与SVP相似。

为了解释是否在35S-CBF1, 35S-CBF2,和35S -CBF3植株中开花的延迟是FLC

表达增加所导致的，这些品系已被春化来抑制FLC的表达。在40天的春化处理后，FLC表达强烈的被抑制。与这个相关的是，35S-CBF1,35S-CBF2,和 35S-CBF3开花延迟的现象也被抑制。这表明CBF过表达植株开花延迟的现象是由FLC表达增加所造成的。

间歇低温处理通过激活FLC基因延迟植物的开花

据报道间歇低温处理通过上调FLC基因延迟植物的开花。作者进一步分析了间歇低温处理对开花的调节。，每天从黎明开始6H的4度低温处理。首先，作者检测了间歇低温处理对COR15a 和 CBF3基因日节律的影响。在没有低温的情况下，COR15a基因在；黎明后12H的时间达到表达高峰，在黄昏的时候极大的减少，但是在间歇低温处理的情况下，COR15a在黎明后6h的时间点有更高的表达高峰。随后在黎明后的12h时间点其表达量极大的减少。CBF3的表达在低温处理情况下其表达量也有所增加。表达峰在黎明后的6h时间点，然后在8H时间点极大的降低。我们的结果表明间歇的低温处理造成COR和 CBF基因的表达量在早晨大量增加。

接下来，我们解释需要多少天的间歇低温处理来延迟开花。结果表明10天的低温处理轻微的延迟了开花时间，20天时间的低温处理进一步延迟了开花时间，表明开花时间的延迟与低温处理的天数是成比例的。与这个符合一致的是，FLC的表达的增加量与低温处理的天数也是成比例的。相反的，SVP的表达在间歇的低温处理条件下没有发生改变。这与SVP的表达在35S-CBF株系中的表达没有受到影响是一致的。

如果间歇低温处理使开花时间的延迟是由FLC表达量的增加，那么?c的开花时间不会因间歇低温处理而延迟。的确，?c株系在间歇低温处理或是不在间歇低温处理的情况下显示一样的开花时间，有趣的是，svp对间歇低温同样没有响应。尽管SVP的表达不受低温处理影响。这可能是因为SVP与FLC一起形成了开花抑制复合物。soc1-101D突变之中CBFs的表达受到强烈抑制，也显示出对间歇低温处理的不敏感。总之，结果表明间歇低温处理通过FLC的活性延迟开花。FLC的活性由CBFs基因所诱导。

春化超过了低温胁迫对开花延迟的影响

春化，即暴露在长时间的低温处理，与间歇低温处理相比有开花作用有相反的作用。为了理解此两者之间不同之处的分子基础，作者检测了在Col:FRI SF2植株中春化处理和间歇低温处理对COR15a 和 CBFs表达的作用，Col:FRI SF2植株显示了FLC基因的高表达以及春化极大的加速开花。间歇低温处理造成CBF3 和 COR15a基因极大的增加和FLC表达水平轻微的增加。相反的，春化40天的处理后立即获得组织，FLC的表达在Col:FRISF2植株中受到极大的抑制，尽管植物显示出对CBF1和CBF3极大的诱导且对COR15a有更强烈的诱导。总的来说，作者的结果表明春化处理抑制了低温胁迫对开花抑制的作用。同时春化和低温胁迫通过不同的机制影响FLC的表达和开花。

SOC1突变对低温耐受的影响

因为soc1-2增加对CBFs和 COR基因表达的诱导而soc1-101D减少对CBFs和 COR基因表达的诱导，因此确定是否这些突变体在低温耐受过程中显示出不同是有意义的。为了解决这一问题，植物在-5度暴露了6个小时然后转移到室温来检测成活率。与期望的一致soc1-2突变子植株的存活率比野生型高许多，然而在低温处理下很少的soc1-101D突变子植株存活。作者的结果表明SOC1不仅调节植物开花同时与低温耐受有关。 COR基因的表达由其他一些开花基因所调控

在fve突变中和在soc1-2中COR15a的表达增加，作者检测了是否其他迟开花基因突变中COR15a的表达显示类似的增加。COR15a转录的增加水平在gi中观测到，一个长日照途径突变，和在fpa突变中，一个自主途径突变。相反的，co和ft，两个长日照途径，和fca 和 ?d一样，两个自主途径途径突变，与野生型相比COR15a的表达没有显示出任何不同。有趣的是，ld突变持续显示出COR15a 表达的降低，结果表明延迟开花本省不是COR15a异位表达所造成的。同时也表明在迟开花突变子中COR15a表达的增加不仅仅是由于SOC1表达水平的降低，因为在这个研究中所用到的迟开花突变子已经减少了SOC1的转录水平。例如，在迟开花突变分析中，fca突变SOC1的表达最低，没有显示任何的的不同，然而gi和fpa，有相对更高的SOC1表达，显示出COR15a表达的增加。这些发现表明

低温诱导基因的抑制通过SOC1依赖和SOC1非依赖途径发生。

为了证明两个非依赖途径的假设，我们比较了soc1-2单突变以及soc1-2 fve-3和soc1-2 gi-2双突变中COR15a的表达水平。在这个试验中，soc1-2, fve-3, 和gi-2突变是无效的。如期望的，双突变子中COR15a的表达比soc1-2突变中COR15a的表达更高。我们也比较了soc1-101D和soc1-101D fve-3，soc1-101D gi-2双突变间COR15a的表达水平。双突变中类似的显示出COR15a表达水平的减少，与soc1-101D单突变一样，表明由GI 和 FVE突变造成的SOC1过表达克服了去抑制作用。

与soc1-2类似的是，gi和fve突变显示了CBF1表达的增加，尽管fve的增加相对的减少。因此，GI 和FVE也有可能抑制低温响应途径通过抑制CBF基因。总之，作者的结果表明SOC1依赖和SOC1非依赖的途径在低温响应低温信号的情况下调节开花。 讨论

在这个研究中，作者鉴别了SOC1基因的下游基因，它是开花途径中的关键因子。通过微阵列分析，意外的发现由SOC1负调节的许多基因被鉴别是低温诱导基因。相反的，低温响应基因的过表达通过对FLC基因的激活来延迟植物开花，在低温胁迫的下也有类似的情况。这个发现表明在低温响应和开花途径间存在反馈环。这是另外一个开花时间精细调节的机制。作者建议把这个机制命名为间歇低温响应途径。

开花间歇低温响应途径的模型

在拟南芥中的开花间歇低温响应模型在图8中有所展示。当植物在营养生长时期的环境温度是低温时，CBFs在响应低温的情况下进行表达。CBFs表达的增加进而造成FLC基因的激活。从而抑制两个开花途径中的基因FT 和 SOC1，从而延迟植物的开花。另一方面，SOC1基因水平的降低造成低温诱导基因的抑制。去抑制使得植物响应低温更为强烈。如soc1-2突变所示。与这一致的是soc1-2突变先出对低温有更强的耐受力。因此，营养生长期间的低温处理不仅能延迟植物开花而且使得植物能够更加的耐受低温。但是，当开花一开始，通常在晚春的

时候，SOC1基因的表达增加，SOC1基因的表达增加抑制低温诱导基因从而抑制低温响应。这种低温响应的抑制在soc 1-101D植株中可以观察的到。soc 1-101D是过表达的突变子。除了SOC1基因，其他开花时间决定基因，如FPA, FVE, 何GI，与低温响应途径也是有关系的。尽管这个机制有待进一步的分析。 低温响应和开花时间之间的反馈环是有利的进化。当秋天的低温条件盛行。间歇低温响应途径可能延迟植物开花时间。从而提供保护防止植物早熟。另外，一年生植物在早春时开始生长。这个机制可能会延迟植物开花直到百花盛开的春季到来的时候。相反的，如果植物开始开花，植物抑制低温响应，因为CBFs的表达对生殖发育是不符合的。如CBFs过表达植株显示出生长延缓。

低温响应和春化

春化和间歇低温响应途径都是对低温的响应，但是对开花的作用是相反的。然而春化是加速植物开花，，间歇低温响应延迟植物开花。有趣的是，春化和间歇低温响应的目标基因都是FLC，很明确春化通过组蛋白的修饰抑制FLC的表达。这里，作者提供的证据表明FLC基因同样是间歇低温响应途径中的目标基因。首先，间歇低温胁迫增加FLC的转录水平延迟植物的开花。其次，?c无效突变植株在响应低温胁迫的时候没有显示出开花延迟。第三，CBFs过表达通过激活FLC延迟植物开花。最后，春化，抑制FLC基因的表达，与CBFs过表达有互补的作用。值得注意的是Liu et al等人Col:FRISF2植株的背景下没有发现CBF1过表达株系增加FLC的表达。但是，不同之处可能是因为Col: FRISF2株系有FLC高表达的基础水平。

尽管春化对FLC有相反的作用，它对CBFs和COR基因的作用与低温胁迫对CBFs和COR基因的作用是一样的。即，春化造成CBF1, CBF3,和COR15a强烈的诱导。因此，低温胁迫和春化在CBF和COR15a表达水平上不能被区分开。在另一方面，在VIN3基因表达水平上可以区分开，因为VIN3不仅仅由短期的低温诱导还由足以触发春化的长期的低温诱导。春化诱导VIN3基因的表达起始于FLC基因的失活。FLC基因的失活是由FLC染色质组蛋白修饰所造成的。此后，VRN1, VRN2, 和 LHP1通过异染色质形势持久的使FLC染色质结构失活。因此，春化抑制FLC的表达，尽管存在像FRI复合体这样的正调节子。目前，还不知道CBFs

怎样FLC的表达，但是很有可能它们不能分辨由春化造成的FLC异染色质状态。这儿有两个CRT/DRE低温响应元件在FLC启动子中的近侧区，因此，值得去确定是否在体内CBFs和FLC的启动子结合。

间歇低温响应途径中大的SOC1-依赖和SOC1-非依赖机制

SOC1不仅仅是影响与开花相关的间歇低温响应途径中的遗传因子。这与以前的研究显示三个其他开花基因，即FPA, FVE, 和GI，在这个途径中的起着作用。在目前开花时间调节模式中，三个基因通过长日照途径或自主途径调节SOC1，因此，SOC1从上游因子FPA, FVE, GI和FLC与低温信号整合。但是，作者的结果表明有更多的复杂途径。首先，其它开花突变体极大的减少了SOC1的表达，如fca和ld，没有表现出低温诱导基因表达的增加。第二，CO和FT没有参与到间歇低温响应途径，尽管GI通过激活CO和 FT调节SOC1基因的表达。第三，双突变soc1 gi 和 soc1 fve显示出叠加的作用增加COR15a的表达。这强烈的表明低温响应途径与其他开花遗传途径是有区别的。同时表明FPA, FVE, 和 GI在间歇低温响应途径中中的作用不依赖SOC1。一个限制条件是在fca，?d, ld, co, 和 ft突变体中SOC1表达水平的降低不能造成COR15a表达的增加，尽管soc1无效突变能造成COR15a表达的增加。在这样的突变体中SOC1仍旧保持低的水平可能足以抑制COR15a基因的表达，因为已经报道在这些突变中有野生型SOC1表达水平的30% to 70%。

FVE 和 GI在不同的开花途径中起作用。fve-1突变子和野生型植株中GI的表达没有什么不同，表明它们不影响其他基因的转录。因此，可能这两个基因通过单独机制影响间歇低温响应途径。但是，在双突变子分析中fve 和 gi都与fpa显示出上位相互作用。因此，三个基因可能参与到同一个间歇低温响应开花途径。，这是SOC1非依赖的。值得注意的通过微阵列技术发现是GI高度响应低温的一个基因。另外，gi突变子显示出对百草枯诱导的氧化胁迫有增加的抵抗作用。因此，GI可能在胁迫响应和开花调节中起着作用。

最近，报道在低的室温条件下(16度)低的红光/远红光的比率通过CBF基因的活性诱导COR15a和COR15b的表达。在这样一个低的环境温度下，phyB和phyD抑制COR基因的表达；因此，phyB 和 phyD突变或者是低的红光/远红光的比率增

加COR基因的表达。尽管这个机制还不是很清楚。这个结果可以解释为什么在16度phyB突变子植株开花比野生型的晚。而在常温条件（22度）下它的开花时间比野生型的早。在16度phyB突变子中CBF活性的增加可能延迟植物开花。但是，在16度phyB没有显示出FLC的增加，这和作者的研究结果不相符合。因此，在COR基因的调节和开花时间的控制之间的相互交谈有另外一层面的复杂性。

开花途径和热响应途径间的相互交谈

间歇低温响应途径中的关键成分是SOC1, CBFs,和FLC。SOC1直接和CBF基因的启动子结合，在这个启动子中CarG盒，使CBF转录抑制。CBFs正调节FLC的表达。然后FLC抑制开花途径的因子从而使得植物开花延迟。在这个报告中作者显示了SOC1作为CBF的转录抑制子。SOC1是LFY表达的转录激活子。但是，据报道SOC1通过直接和SEP3启动子结合同时作为一个转录抑制子。因此，很有可能SOC1即是激活子子也是抑制子，这取决于辅因子的不同。

在这个途径中还有的其它组分是FPA, FVE, 和 GI，副调节CBF基因的表达。在热响应途径中，FT和 SVP是主要的参与者，FCA 和FVE也参与到这个途径中，另外，FLC不参与到这个途径中因为?c无效突变在低温条件下显示出开花的延迟。尽管在这个条件下FLC表达是增加了。因此，这两个途径是独立的。但是，作者的结果表明两个途径是相互关系的，首先，这两个途径有相同的组分，FVE,一个自主途径基因调节FLC的表达。第二，SVP参与到间歇低温响应途径中。尽管SVP的表达即不被间歇低温影响也不被CBFs基因所影响。Svp突变对间歇低温显示出不敏感，不像?c突变子。因为SVP和FLC形成开花抑制复合体，表明SVP-FLC复合体与间歇低温响应途径是相关的。因此，在热响应途径和间歇低温响应途径之间存在相互交谈，尽管他们部分是独立的。总之，作者阐明了一个开花响应低温的精细机制，使得的植物能够适应变化的环境。

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