(一)立项依据与研究内容(4000-8000字)：

（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：

1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）

肝癌是高度恶性的肿瘤之一，患者死亡率高，我国每年死于肝癌的患者占全世界肝癌死亡人数的一半左右。广西是全国肝癌高发区之一，其肝癌死亡率是全国同类肿瘤发病死亡平均值的2倍左右。耐药性是肝癌难以治愈和患者死亡率高的关键原因之一。因此，肝癌耐药性的研究对我区乃至我国肝癌的治疗具有重要意义。

迄今为止，对肝癌等癌症耐药性的研究主要集中在癌细胞自身，其耐药机制主要包括：癌细胞对药物的降解、癌细胞特殊膜蛋白对药物的排除、药物作用靶点质和量的改变、DNA的自我修复，以及癌细胞分泌物对组织液中耐药蛋白的保护等[1-4]。最近的研究还表明，癌症产生耐药性的一个重要原因很可能是存在于肿瘤微环境中的健康细胞尤其淋巴细胞给癌细胞提供了相应的条件，使它能抵抗药物并存活下来[5, 6]。研究人员发现，那些对独立培养的癌细胞有效的药物却对与健康细胞共同培养的癌细胞无明显效果，这说明癌细胞会利用周围环境中的健康细胞来抵抗药物。他们还发现，相邻健康细胞分泌的一种叫做肝细胞生长因子的蛋白与黑色素瘤(一种恶性肿瘤)的耐药性相关，该蛋白目前正被作为药物作用靶点用于黑色素瘤治疗药物的开发研究。

环境变化会引起DNA上5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethyl- cytosine，5hmC）

位点的改变，从而引起细胞功能的异常。癌症发生使相邻细胞的生活环境发生明显的改变，这种改变也可能使相邻细胞DNA上5hmC位点发生改变，并进而影响这些修饰位点所在基因的活性和细胞的某些功能[7, 8]。DNA羟甲基化是最近三年来表观遗传学领域研究的新热点，是一种复制后表观遗传修饰，是Tet（Ten-eleven-translocation，10-11易位)蛋白催化5-甲基胞嘧啶（5-methyl- cytosine，5mC）形成5hmC的结果[9, 10]。5hmC的研究由于2009年Tet蛋白这一催化功能的发现而倍受关注[7-11]。5hmC被称为DNA的第6种碱基，它不仅参与DNA去甲基化过程，还具有激活和维持基因表达的作用，在原始生殖细胞、受精卵和干细胞重编程及干细胞多能性的维持等方面也起着重要的作用[7-9, 11-14]。在基因组水平上，5hmC在不同细胞具有不同的稳定表达图谱，在癌组织中5hmC则大量丢失[8, 15]。因此，5hmC在DNA上的分布可提供基因表达调控方面的功能信息，检测5hmC水平和分布，可望成为有价值的癌症诊断和预测手段。

虽然国内外DNA羟甲基化的研究已经倍受关注并取得了一定的进展，但这些研究还主要集中在人和哺乳动物的干细胞、原始生殖细胞、受精卵、神经组织、胚胎组织及癌细胞等病理组织细胞，肝癌等癌症耐药机制方面的研究则多从癌细胞本身的角度进行[8, 9, 12]，本课题组之前也从蛋白、基因和mRNA的角度对肝癌等癌症进行了大量研究[16-27]，但从肝内淋巴细胞分泌蛋白及其基因羟甲基化角度对肝癌耐药机制的研究还未见报道。因此，本立项拟以此作为研究的科学问题，通过研究肝内淋巴细胞分泌的肝细胞癌（最主要的肝癌类型）耐药相关蛋白、该蛋白基因5hmC位点的变化及后者对前者表达的影响和进一步对肝细胞癌耐药性的影响来探讨肝细胞癌的耐药机制。由于肝内淋巴细胞提高癌细胞耐药性的能力既可能是肝内淋巴细胞固有的，也可能是癌细胞诱导获得的，或二者兼而有之，

又由于基因的表达或沉默与基因上5hmC的存在与否及存在位置有着密切的相关性，因此我们推测，肝内淋巴细胞提高癌细胞耐药性可能是通过耐药相关蛋白（目标蛋白）基因正常羟甲基化来调控基因活性、从而分泌目标蛋白来完成的，也可能是通过癌细胞或其分泌物诱导引起肝内淋巴细胞内目标蛋白基因5hmC位点改变、从而引起目标蛋白基因表达和目标蛋白分泌异常来实现的，或二者协同完成的（图1）。我们将在本立项中以此推测作为科学假设，并通过一系列实验对之进行验证。

据此，本立项拟以与癌细胞共同培养的肝内淋巴细胞为研究对象，通过细胞培养、双向电泳、羟甲基化DNA免疫共沉淀（Hydroxymethylated DNA immunoprecipitation，hMeDIP）、逆转录PCR（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、DNA印迹（Southern blot）、DNA测序、串联质谱等技术，分离、纯化、鉴定肝内淋巴细胞分泌的肝细胞癌耐药相关蛋白，分析其mRNA表达、其基因5hmC位点变化及二者与耐药蛋白表达的关系，在蛋白、mRNA、基因等层次，从肝内淋巴细胞分泌蛋白及该类蛋白基因羟甲基化等角度探讨肝细胞癌耐药机制，为肝细胞癌的药物治疗提供理论依据和作用靶点。

图1 基于相邻淋巴细胞5hmC的肝细胞癌可能耐药途径

Figure 1. The supposed escape routes of liver cancer cells based on 5hmC in the

neighbouring lymphocytes

参考文献

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2. 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此

部分为重点阐述内容）

（1）研究目标

通过研究与肝癌细胞共同培养的肝内淋巴细胞分泌蛋白及其mRNA表达和基因羟甲基化变化，确立肝细胞癌耐药相关蛋白、该类蛋白基因5hmC位点及后者变化与前者分泌的相关性，从肝内淋巴细胞分泌蛋白及该类蛋白基因羟甲基化等角度阐明肝细胞癌耐药机制，为肝细胞癌的药物治疗提供理论依据和可能的作用靶点。

（2）研究内容

①通过细胞培养、高效液相色谱、串联质谱等方法，从培养液中分离肝内淋巴细胞分泌的肝细胞癌耐药相关蛋白（目标蛋白），分析、鉴定其种类、序列组成及产生方式（固有、诱导获得或二者兼而有之），鉴定可作为肝细胞癌治疗靶点的关键蛋白。

②通过RT-PCR、DNA测序等方法，分析、鉴定目标蛋白mRNA的序列组成及产生方式。

③通过细胞培养、双向电泳、DNA印迹等方法，分析目标蛋白基因的羟甲基化变化，判断目标蛋白的分泌与其基因羟甲基化的相关性，鉴定可作为肝细胞癌治疗靶点的关键5hmC位点。

最后，综合以上实验结果，在蛋白质、mRNA、基因等层次上，从肝内淋巴细胞分泌蛋白及该类蛋白基因羟甲基化等角度探讨肝细胞癌耐药机制，为肝细胞癌的药物治疗提供理论依据和作用靶点。

（3）拟解决的关键科学问题

“从培养液中分离肝内淋巴细胞分泌的肝癌细胞耐药相关蛋白”是拟解决的关键科学问题，其解决是本立项中3个实验环节中另2个的前提条件。其解决方法为：通过双向电泳比较培养液/组织液中存在的蛋白质，找出实验组培养液中存在的特异蛋白。通过高效液相色谱技术分离、纯化特异蛋白。通过在单独培养的肝癌细胞培养基中分别加入这些特异蛋白和治癌药物（选取3种药物作平行实验），分析评价这些特异蛋白对肝癌细胞耐药性的影响，鉴定出提高肝癌细胞耐药性的特异蛋白（不加特异蛋白作对照）。

3. 拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、

实验手段、关键技术等说明）

（1）拟采取的研究方法

①细胞体外培养：用于对肝内淋巴细胞和肝癌细胞进行单独或混合等培养，或用于耐药蛋白的筛选。

②双向电泳：用于比较培养液/组织液中存在的蛋白质差异和不同细胞DNA的羟甲基化图谱差异，筛选实验组的特异蛋白和鉴定实验组的变异5hmC位点；及用于DNA印迹，分析耐药性相关蛋白基因的羟甲基化情况。

③高效液相色谱法：用于分离、纯化特异蛋白。

④串联质谱法：分析、鉴定耐药性相关蛋白，获得目标蛋白的全部或部分氨基酸序列。

⑤RT-PCR：评价耐药性相关蛋白mRNA的表达情况和获得其cDNA。 ⑥DNA测序：获得目标蛋白的cDNA序列组成。

⑦Blast检索：分析已获得蛋白和cDNA序列的特征，鉴定其代表的目标蛋白和基因种类。

⑧hMeDIP：富集羟甲基化DNA片段。

⑨DNA印迹：分析目标蛋白基因羟甲基化变化。

（2）技术路线

注①：是耐药相关蛋白产生方式（固有、诱导获得或二者兼而有之）的参照。

（3）实验手段

第一部分：肝内淋巴细胞分泌的肝细胞癌耐药相关蛋白的分离、鉴定

①将肝内淋巴细胞和肝癌细胞混合培养，肝癌细胞单独培养作阴性对照，肝癌组织作阳性对照，肝内淋巴细胞单独培养作目标蛋白产生方式的参照。

②通过双向电泳比较培养液/组织液中存在的蛋白质，找出实验组培养液中存在的特异蛋白。

③通过高效液相色谱技术分离、纯化特异蛋白。

④通过在单独培养的肝癌细胞培养基中分别加入这些特异蛋白和治癌药物（选取3种药物作平行实验），分析评价这些特异蛋白对肝癌细胞耐药性的影响，鉴定出提高肝癌细胞耐药性的特异蛋白（不加特异蛋白作对照）。

⑤通过串联质谱法分析、鉴定提高肝癌细胞耐药性的特异蛋白，获得蛋白的全部或部分氨基酸序列。

第二部分：目标蛋白mRNA的分析、鉴定

根据目标蛋白的氨基酸序列设计引物，通过RT-PCR和DNA测序等方法，获得目标蛋白的cDNA序列组成，在专业数据库进行Blast检索，分析其代表的基因和目标蛋白种类。

第三部分：目标蛋白基因羟甲基化分析

①将肝内淋巴细胞和肝癌细胞混合培养，单独培养的肝内淋巴细胞作阴性对照，肝癌组织的肝内淋巴细胞作阳性对照，肝内淋巴细胞单独培养作目标蛋白产生方式的参照。

②通过DNA印迹获得目的蛋白基因羟甲基化图谱：将实验组和对照组肝内淋巴细胞来源的基因组DNA用限制酶酶切结合hMeDIP方法获得羟甲基化DNA片段，在各片段3'-末端进行荧光（Cy5）标记。再通过RT-PCR技术获得目标蛋

白基因的cDNA，并以之制作荧光探针（Cy3标记）；然后通过二维电泳获得目标蛋白基因的羟甲基化模式，鉴定肝癌发生中肝内淋巴细胞内目标蛋白基因上的关键5hmC位点，判断目标蛋白基因表达与其羟甲基化的相关性。

最后，综合以上实验结果，从肝内淋巴细胞分泌蛋白及该类蛋白基因羟甲基化等角度探讨肝细胞癌耐药机制。

（4）关键技术

双向电泳、高效液相色谱技术是本立项的关键技术，用于解决本立项关键科学问题 “从培养液中分离肝内淋巴细胞分泌的肝癌细胞耐药相关蛋白”。即：通过双向电泳比较培养液/组织液中存在的蛋白质，找出实验组培养液中存在的特异蛋白；通过高效液相色谱技术分离、纯化特异蛋白。

（5）可行性分析

①理论上可行：5hmC是一种广泛存在于各种动物组织中的碱基修饰方式，它对基因表达的调控功能及其他多种功能已在哺乳动物和人的神经组织和胚胎干细胞内得到了证实。国际上已有文献证实，相邻健康细胞能分泌特定蛋白提高癌细胞的耐药性，相邻肝内淋巴细胞能提高肝癌细胞耐药性。

②前期工作和科学经历：项目组成员多年来一直在跟踪该领域的研究动态，对相关领域研究进展十分熟悉；项目组成员有多年从事肝癌细胞体外培养和肝癌研究的经历，积累了丰富的经验。本立项是从基因组表观遗传修饰的角度，对之前从肝癌细胞自身角度研究肝癌相关机制的继续和深入。课题组成员已主持或参与了多项与本立项相关的科研课题，发表了多篇相关论文。

③技术、方法上可行：本立项运用的都是成熟的技术和方法或改良的成熟方法，且研究组成员都已掌握，并有多年相关研究经验。

④具有很好的研究基础和完成该项目的各种条件：（a）项目申请者和主要参与人员所依托的右江民族医学院的科学实验中心已具备完成该项目所需的实验设备和条件。如各种PCR仪、DNA测序仪、激光共聚焦显微镜、高效液相色谱仪及其工作站、气相色谱-质谱联用仪、谱荧光成像系统、各种电泳设备等，并且有多名主要参与者是上述实验仪器设备专职实验技术人员；（b）项目依托单位有专门的表观遗传实验室，项目主要参与者李根亮博士是该实验室的负责人。

4. 本项目的特色与创新之处。

本项目的特色：把表观遗传学领域的最新研究成果——5hmC用于肝细胞癌耐药机制研究。

本项目的创新之处：从肝内淋巴细胞分泌蛋白基因羟甲基化的角度探讨肝细胞癌耐药机制（该研究还未见报道）。

5. 年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流

活动、国际合作与交流计划等）

（1）课题研究进度安排

2014.01-2014.12

①进行细胞培养，分离出特异蛋白；

②分析、鉴定耐药相关蛋白。

2015.01-2015.12

①设计出PCR引物；

②获得目标蛋白cDNA并测序。’

③参加一次国内会议；发表1篇论文。

2016.01-2016.12

①制备荧光探针；

②酶切DNA并进行荧光标记；

③参加一次国际会议；发表2篇论文；

2017.01-2017.12

①分析鉴定关键5hmC；

②阐明肝癌细胞耐药机制；

③参加一次国际会议；发表2篇论文；

④做结题报告。

（2）预期的研究成果及成果形式

①鉴定出与肝癌细胞耐药性相关的、可能作为肝癌治疗靶点的肝内淋巴细胞分泌蛋白。

②在蛋白质、mRNA、基因等层次上，从肝内淋巴细胞分泌蛋白及该类蛋白基因羟甲基化等角度探讨肝细胞癌耐药机制。

③发表相关论文5篇，其中SCI期刊论文2篇以上；

④培养青年教师2名、硕士研究生2-3名。

（二）研究基础与工作条件

1、工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）

（1）项目申请人长期从事药物分析、抗癌活性药物构效机制及药物开发等研究，近期发表多篇SCI论著并获得市厅级科技进步奖一等奖。近年来组织项目相关人员对肝癌细胞耐药性等进行了初步的研究（图1为肝细胞和肝癌HepG2细胞用药凋亡与否的MTT图）。

（2）项目主要参与人班副植副主任技师，长期从事肝癌相关基础研究，其参与完成的“DNA修复酶基因多态性与p53热点突变的相关性及其在肝癌发病中的地位”研究成果2011年获得广西壮族自治区自然科学奖二等奖，为本项目的开展积累了丰富的工作基础。

（3）项目主要参与人李根亮博士，正在主持1项并曾参与完成过多项表观遗传方面的国家级课题研究，从表观遗传学的角度入手，在生化、分子、细胞、组织和器官水平开展了深入的研究，熟练掌握5hmC最新分析技术，发表了多篇相关SCI论著，为本项目创新性地从肝内淋巴细胞分泌蛋白基因羟甲基化的角度探讨肝细胞癌耐药机制提供了技术支撑。

（4）本课题组主要成员有多年从事肝癌基础研究的，有多年从事肝癌分子药理学基础研究的，有多年从事临床肝胆外科实践的，还有多年从事PCR等生物技术工作的专职实验技术人员，他们已掌握了本立项所需的各项实验技术，并在之前的研究过程中积累了扎实的工作经验。

总之，本立项是从基因组表观遗传修饰的角度，对之前从肝癌细胞自身角度研究肝癌相关机制的继续和深入。课题组成员已主持或参与了多项与本立项相关

的科研课题，发表了多篇相关论文（具体见“申请人和项目组主要参与者简介”部分）。

图1 肝癌HepG2的凋亡。

A，肝癌HepG2凋亡的MTT图；B，未凋亡的肝癌HepG2；C，正常肝细胞

20

倍；D，正常肝细胞凋亡的MTT图。

2、工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门开放实验室等研究基地的计划与落实情况）

已具备本立项完成所需的各种实验条件。

①实验材料和试剂等：肝癌细胞、肝内淋巴细胞及各种抗体、药品、试剂及试剂盒购自生物试剂公司。

②主要仪器和研究平台：我校科学实验中心已具备本课题研究所需的各种仪器设备，如：双向电泳系统（PROTEAN i12 IEF）、实时荧光定量PCR仪（iQ5）、PCR仪（PTC-200）、高效液相色谱仪（UltiMate3000）、气相色谱-质谱联用仪（Agilent 7890A GS/5975C inert M）、RNA/DNA定量分析仪（GeneQuant Pro）、激光共聚焦显微镜（FLuOVIEW FV500）、荧光成像系统（DVC－1500M）、转印仪（BIO-RAD）、各种冷冻离心机、超低温冰柜等。

③RT-PCR引物由生物试剂公司合成，部分样品的测序送测序公司完成。 ④本单位有专门的表观遗传实验室。

3、承担科研项目情况（申请人和项目组主要参与者正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）

①申报人黄世稳，参加国家自然科学基金课题（81160347）“广西茉莉花茎、叶黄酮类化合物抗氧化活性及其构效关系和作用机理研究”，2012/01－2014/12，排名第3，负责抗氧化活性机理研究。该项目研究内容与本课题无交叉。

②课题组参与者班副植，参加国家自然科学基金课题（81160255）“XPC第939密码子点突变调节黄曲霉素B1相关性肝细胞癌发病风险的相关机制研究”，2012/01－2014/12，排名第4，负责分子生物学实验。该项目研究内容与本课题无交叉。

③课题组参与者李根亮，主持国家自然科学金（3260635）“基于5-羟甲基胞嘧啶的中华绒鳖蟹非浓缩核精子发生机制”，2013/01－2016/12，该项目研究内容与本课题无交叉。

④课题组参与者廖长秀，主持国家自然科学金（81060040）“芳香烃受体对肝星状细胞活化的影响及分子机制”，2011/01-2013/12，该项目研究内容与本课题无交叉。

4、完成自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）

无

（三）申请人和项目组主要参与者简介（在读研究生除外）。

1．项目负责人：黄世稳

所在单位及职称

右江民族医学院，基础医学院，教授

受教育经历

1999/10－2001/10，广西师范大学，化学化工学院，有机化学研究生班 1986/08－1987/12，内蒙古大学，化学系，有机化学助教进修班

1979/09－1983/06，广西师范大学，化学系，学士

研究工作经历

2010/12－至今，右江民族医学院，基础医学院，教授

2010/01－12，广西师范大学，药用资源化学与药物分子工程重点实验室，药物分析高级访问学者，导师：蒋治良

2001/12－2010/11，右江民族医学院，基础医学院，副教授

2001/01－12，广西师范大学，化学化工学院，药物分析与药物合成研究学者，导师：苏桂发、王恒山

1988/12－2001/11，右江民族医学院，基础医学部，讲师

1983/07－1988/11，右江民族医学院，基础医学部，助教

主要论著

(1) Liao Xianjiu*，Lu Shunbao，Huang Shiwen*．Preparation of Copper/Carbon Sphere Composites with Excellent Electrocatalytic Activity Toward Glucose．International Journal of

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(2) 黄世稳、李纪顺、梁爱惠、蒋治良*，高灵敏选择性检测凝血酶的适体纳米银共振散射光谱探针，化学学报，第69卷，第2期，183-189页，2011

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(4) Huang Shiwen，Cheng Jinsheng*，Qian Li，Huang Souyi．Facile microwave-assisted synthesis of bis-pyrazol pyrimidine derivatives via an N-alkylation reaction．Research on Chemical Intermediates，Vol.37，Issue 1，P.1-9，2011

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2．主要参与者：班副植

所在单位及职称

右江民族医学院，附属西南医院，副主任技师

受教育经历

1986/09－1991/06，右江民族医学院，医学检验学院，学士

研究工作经历

2010/12－至今，右江民族医学院，附属西南医院，副主任技师

2003/12－2010/11， 右江民族医学院，附属西南医院，主管技师

1994/12－2003/11，右江民族医学院，附属西南医院，技师

1994/08－1995/02，江苏省人民医院，检验科，进修基因检测技术

1991/07－1994/11，右江民族医学院，附属西南医院，助理技师

主要论著

(1) 农世泽，彭契六，班副植，黎荣能．血清AFP、TSGF和IL-6联合检测对原发性肝癌的诊断价值．中国实用医药，第7卷，第10期，112-114页，2012

(2) 黄承乐，黄红华，丁凯宏，班副植，黎荣能．急性病毒性肝炎患者外周血T 细胞亚群的检测和分析．现代生物医学进展，第12卷，第18期，3535-3537页，2012

(3) 龙喜带、姚金光、马韵、黄照权、黄永秩、班副植，DNA修复酶基因多态性与p53热点突变的相关性及其在肝癌发病中的地位，广西壮族自治区人民政府，广西壮族自治区自然科学奖，二等奖，2011

(4) Long Xidai*，Yao Jinguang，Huang Yongzhi，Huang Xiaoying ，Ban Fuzhi，Yao Liming，Fan Ludan．DNA repair gene XRCC7 polymorphisms (rs#7003908 and rs#10109984) and hepatocellular carcinoma related to AFB1 exposure among Guangxi population, China．Hepatol Res，Vol.41，Issue 11，P. 1385-1093，2011

(5) 黄承乐，班副植，丁凯宏．原发性肝癌患者肿瘤坏死因子水平变化的临床意义．现代预防医学，第38 卷，第13 期，2666-2667页，2011

(6) 黄承乐，班副植，丁凯宏．原发性肝癌血清TNF-A、IL-2、I L-6和IL-8 检测的临床意义．中国误诊学杂志，第11卷，第18 期，4375-4376页，2011

(7) 班副植，农世泽，黄承乐，黎荣能．原发性肝癌患者血清同型半胱氨酸

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