MicroRNA-126对CD4T细胞DNA甲基化调控及其在系统性红斑狼疮发病

博士学位论文中文摘要

摘要

系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）是一种以Ｔ细胞自身免疫反应性和Ｂ细胞产生大量自身抗体为特征，累及多系统、多器官，严重危害人类健康的慢性自身免疫性疾病。近年来，越来越多的研究表明表观遗传机制异常在ＳＬＥ的发生、发展中起着重要的作用，但其确切的机制尚不十分清楚。

ＤＮＡ甲基化是重要的表观遗传调控机制之一，在胚胎发育、遗传印记、Ｘ染色体失活、染色质重塑等方面起重要作用。ＤＮＡ甲基化是指由ＤＮＡ甲基转移酶介导，以Ｓ．腺苷．Ｌ．甲硫氨酸为甲基供体，在ＤＮＡ脱氧胞嘧啶（ｄｅｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）的第５位碳原子上加入一甲基基团。这一过程多发生在ＣｐＧ二核苷酸，是哺乳动物基因组ＤＮＡ最常见的化学修饰。基因启动子区ＣｐＧ岛的甲基化可以使一些转录因子无法与靶基因结合而抑制基因的转录，而该区域的去甲基化则可以激活基因的转录。ＤＮＡ甲基化抑制剂体外可诱导Ｔ细胞ＤＮＡ低甲基化，将其注射入小鼠体内可以诱发狼疮样自身免疫反应。ＳＬＥ患者Ｔ细胞基因组ＤＮＡ低甲基化，且ＤＮＡ低甲基化程度与ＤＮＡ甲基转移酶ｌ（ＤＮＭＴｌ）的活性及水平密切相关。除基因组ＤＮＡ低甲基化外，ＳＬＥ患者Ｔ细胞与自身免疫相关基因调控序列也呈现低甲基化，这些基因包括ＣＤ１ｌａ（ＩＴＧＡＬ）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）和Ｐｅｒｆｏｒｉｎ删）。过度表达这些基因的Ｔ细胞具有自身反应性，杀伤自身巨噬细胞或辅助Ｂ细胞产生大量的自身抗体。研究结果表明Ｔ细胞ＤＮＡ低甲基化在ＳＬＥ的发生、发展中起十分重要作用。但是，

博士学位论文中文摘要ＳＬＥ患者ＤＮＡ低甲基化的分子机制，目前仍不清楚。

ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）是一类源于内源性染色体上的非编码单链ＲＮＡ，长度为２１＂－－，２５ｎｔ的短序列，能够通过与靶ｍＲＮＡ特异性的碱基互补配对，引起靶ｍＲＮＡ降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。虽然从发现ｍｉＲＮＡｓ到现在只有十余年，ｍｉＲＮＡｓ却成为近年生命科学研究领域的一个焦点。最近的研究显示ｍｉＲＮＡｓ参与表观遗传调控及各种免疫反应，可以作为自身免疫疾病诊断的生物学标记或者治疗靶点。因此，本课题研究组前期利用ｍｉＲＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙ技术比较ｌＯ例ＳＬＥ患者和ｌＯ例健康对照者ＣＤ４＋Ｔ细胞ｍｉＲＮＡ表达谱的差异，发现１１种ｍｉＲＮＡｓ在ＳＬＥ表达异常，其中ｍｉＲ－１２６等六种ｍｉＲＮＡｓ在ＳＬＥ表达异常升高，而ｍｉＲ一１４３—３ｐ／５ｐ等五种ｍｉＲＮＡｓ在ＳＬＥ表达异常降低。进一步用ｓｔｅｍ．１００ｐＲＴ－ＰＣＲ证实ｍｉＲ－１２６在ＳＬＥＣＤ４＋Ｔ细胞表达显著升高，而ｍｉＲ．１４２—３ｐ明显降低，ｍｉＲ－６３８和ｍｉＲ－１４２．５ｐ在ＳＬＥ和正常对照组ＣＤ４＋Ｔ细胞表达无明显差异。我们在Ｍｉｒｂａｓｅ／Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎｓ／ＰｉｃＴａｒ等多个国际权威数据库查找异常表达ｍｉＲＮＡ潜在靶基因，发现ＤＮＭＴｌ是ｍｉＲ－１２６的潜在靶基因。更有趣的是，我们发现ＳＬＥＣＤ４＋Ｔ细胞ｍｉＲ一１２６的表达与ＤＮＭＴｌ的蛋白表达水平成负相关。

因此，我们提出：ｍｉＲ－１２６过度表达一靶向抑制ＤＮＭＴｌ表达＿Ｔ细胞基因调控序列低甲基化一Ｔ细胞自身免疫反应相关基因过度表达一杀伤自身巨噬细胞或辅助Ｂ细胞产生大量自身抗体＿ＳＬＥ。这一假定的发病机制首先通过体外萤光素报告载体验证ＤＮＭＴｌ是否为

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博士学位论文中文摘要ｍｉＲ．１２６的靶基因；ＣＤ４＋Ｔ细胞中过表达ｍｉＲ．１２６对ＤＮＭＴｌ的表达，自身免疫相关基因的表达及其调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响；抑制ｍｉＲ－１２６过表达对ＳＬＥＣＤ４＋Ｔ细胞ＤＮＭＴｌ的表达，自身免疫相关基因的表达及其调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。通过这些研究揭示了ｍｉＲ－１２６异常高表达是导致ＳＬＥＣＤ４＋Ｔ细胞ＤＮＡ低甲基化及自身免疫反应的重要分子机制，为寻找治疗ＳＬＥ有效的新靶标提供了理论依据。

第一部分ｍｉＲ－１２６表达异常与自身免疫反应关系的研究

第一节ｍｉＲ－１２６靶基因的预测及验证

目的：预测及验证ｍｉＲ－１２６的靶基因。

方法：运用Ｍｉｒｂａｓｅ／Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎｓ／ＰｉｃＴａｒ等靶基因预测软件查找ｍｉＲ－１２６可能的靶基因，筛选出与ＳＬＥ发病过程密切相关的基因作为候选靶基因，我们选定ＤＮＭＴｌ为靶基因，然后构建萤火虫荧光素酶表达载体，在Ｊｕｒｋａｔ细胞中验证ｍｉＲ－１２６与ＤＮＭＴｌ之间的关系。将包含ＤＮＭＴ１的３＇－ＵＴＲ区克隆至ｐＭＩＲ－ＲＥＰＯＲＴＥＲＬｕｃｉｆｅｒａｓｅｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ）载体编码荧光素酶基因序列，构建ＤＮＭＴｌ野生型（ＤｎｍｔｌＷＴ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）荧光素酶报告基因，同时采用点突变的方法使ＤＮＭＴｌ．３’．ＵＴＲ中ｍｉＲ．１２６的结合位点发生碱基突变，构建突变型（ＤｎｍｔｌＭＵｔ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）荧光素酶报告基因，与ｍｉＲ－１２６表达质粒（ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ４．１．ＣＭＶ－ｍｉＲ－１２６）和阴性对照质粒

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博士学位论文中文摘要（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１ＣＭＶ－ｎｅｇａｔｉｖｅ）用电穿孔法瞬时共转染至Ｊｕｒｋａｔ细胞，转染４８小时后收集细胞，运用双荧光素酶报告基因检测系统，以海肾荧光素酶作为内参照，检测萤火虫荧光素酶的活性。

结果：通过生物信息学预测软件我们发现多种ｍｉＲ－１２６的可能靶基因，我们选定在ＳＬＥ发病过程中发挥重要作用的ＤＮＭＴｌ基因作为靶基因；在Ｊｕｒｋａｔ细胞中共转染ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ４．１一ＣＭＶ－ｍｉＲ－１２６，可以抑制ＤＮＭＴｌ野生型（Ｄｎｍｔｌｗｒ．１ｕｃｉｆｅｒａｓｅ）荧光素酶活性，而当ＤＮＭＴｌ．３’．ＵＴＲ突变修饰后（ＤｎｍｔｌＭＵｔ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ），ｍｉＲ－１２６不能抑制其表达。

结论：ＤＮＭＴｌ为ｍｉＲ－１２６的靶基因，ｍｉＲ－１２６通过作用于ＤＮＭＴｌ．３＇－ＵＴＲ区抑制基因的表达。

关键词：ｍｉＲ－１２６，靶基因预测，生物信息学，ＤＮＭＴｌ，报告基因

第二节ｍｉＲ．１２６过表达诱导自身免疫反应

目的：诱导ｍｉＲ－１２６过表达对正常人ＣＤ４＋Ｔ细胞ＤＮＭＴｌ的表达、甲基化敏感基因的表达、调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。

方法：构建ｍｉＲ－１２６表达质粒（ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ４．１．ＣＭＶ－ｍｉＲ－１２６）和阴性对照质粒（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１ＣＭＶ－ｎｅｇａｔｉｖｅ），电穿孔法瞬时转染正常人ＣＤ４＋Ｔ细胞，采用Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ法检测甲基化敏感基因ＣＤｌｌａ、ＣＤ７０及ＤＮＭＴｌｍＲＮＡ的表达，流式细胞仪检测ＣＤｌｌａ和ＣＤ７０

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博士学位论文中文摘要蛋白表达，亚硫酸氢钠基因组测序法检测ＣＤｌｌａ㈣Ｌ）、ＣＤ７０（刀、碱铲７）调控序列甲基化状态的改变，采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测

ＤＮＭＴｌ蛋白水平，ＥＬＩＳＡ方法检测自身Ｂ细胞ＩｇＧ抗体产量。

结果：转染ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ４．１．ＣＭＶ－ｍｉＲ－１２６的ＣＤ４＋Ｔ细胞ＣＤｌｌａ和ＣＤ７０ｍＲＮＡ水平升高，ＣＤ７０、ＣＤｌｌａ蛋白水平增高，ＤＮＭＴｌ蛋白水平降低，自身Ｂ细胞的ＩｇＧ抗体产量增加，差异均有显著统计学意义（Ｐ＜Ｏ．０５或Ｐ＜０．０１）。但ＤＮＭＴｌｍＲＮＡ水平无显著差异（Ｐ＝０．３７７）。亚硫酸氢钠测序结果显示ＣＤｌｌａ㈣Ｌ）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）启动子调控序列平均甲基化水平均显著降低（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０５）。

结论：ｍｉＲ－１２６过表达可降低正常ＣＤ４＋Ｔ细胞自身免疫相关基

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因甲基化水平，诱导自身免疫反应。

关键词：ｍｉＲ．１２６，ＣＤ４＋Ｔ细胞，基因，甲基化，自身免疫反应第三节下调ｍｉＲ－１２６表达抑制自身免疫反应目的：抑制ｍｉＲ－１２６表达对ＳＬＥＣＤ４＋Ｔ细胞自身免疫反应相关基因的表达及其调控序列甲基化状态以及自身免疫反应的影响。

方法：设计针对ｍｉＲ．１２６的ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及对照组（杂乱无序的寡核苷酸），电穿孔法瞬时转染活动性ＳＬＥ患者的ＣＤ４＋Ｔ细胞，采用Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ法检测ＤＮＭＴｌｍＲＮＡ，自身免疫反应相关基因ＣＤｌｌａ、ＣＤ７０ｍＲＮＡ的表达，流式细胞仪检测ＣＤｌｌａ、ＣＤ７０蛋白

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