肿瘤细胞膜模型筛选抗肿瘤多肽新方法的建立

肿瘤细胞膜模型筛选抗肿瘤多肽新方法的建立

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肿瘤细胞膜模型筛选抗肿瘤多肽新方法的建立

温浙盛，戎铁华

基础研究

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中山大学肿瘤防治中心胸外科，广东广州$!##"#

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:0$(1;,)03:0$(1<)(13=>??@?3ABCB4,.($通讯作者：戎铁华

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要】背景与目的：部分多肽类药物具有靶向选择性抗肿瘤作用，目前针对多肽

抗肿瘤的研究都是基于某一或数个肽链的信息，受到现有多肽信息的限制。本研究旨

在通过肿瘤细胞膜模型的建立，应用核糖体表达法进行抗肿瘤多肽筛选。方法：选择已知可在肿瘤细胞膜上穿孔的阳性对照多肽M9).=!和M9).&*9’9+N优化人工合成的肿瘤脂质体细胞膜模型。组建可直接用于体外多肽表达的O2P库J应用核糖体表达法进行特异性抗肿瘤多肽筛选J应用M44法检测筛选的多肽在体外抗肿瘤效果。结果：应用核糖体体外表达法和脂质体HQARQSJ?T>I肿瘤细胞膜模型成功地从设计的肽库中筛选出一些肽J体外实验证实部分多肽能抑制非小细胞肺癌细胞株H2%U67@"#I生长，而对正常人体纤维细胞%%O6=>SV无影响。结论：合适的肿瘤细胞膜模型和核糖体表达法J可从肽库中筛选特异性抗肿瘤多肽J为开发作用机制完全不同的抗肿瘤新药奠定基础。

关键词：肿瘤细胞膜模型；核糖体表达法；抗肿瘤多肽筛选中图分类号：0>?6?"W!

文献标识码：P

文章编号：!###<@">NH=##@I!=<!""#<#"

化学药物治疗H化疗I是肿瘤综合治疗的主要措施之一J然而多数临床研究均未取得实质性进展J其原因在于耐药性和毒副反应的存在K!L。部分多肽类药物具有抗肿瘤作用J其抗肿瘤机制完全不同于传统抗肿瘤药物J是一种靶向选择性的抗肿瘤新药K=L。目前针对抗肿瘤多肽的研

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温浙盛，等Q肿瘤细胞膜模型筛选抗肿瘤多肽新方法的建立

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究取得了令人注目的成绩，但几乎都是基于某一或数个肽链的信息，受到现有多肽信息的限制#$%。为了建立一种简便、可靠的寻找抗肿瘤多肽的方法&我们设计利用核糖体多肽表达法结合肿瘤细胞膜模型进行抗肿瘤多肽筛选&应用’((法检测筛选的多肽在体外抗肿瘤效果。

螺旋结构的长度&而长度越长越不利于"C螺旋结构的形成#I%，因此我们设计肽库链长为HM个氨基酸。

肽库寡核苷酸序列为（WWZ）HM&其中W为完全随机（(和?）。碱基，Z代表碱基

!

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材料与方法

实验材料

实验所需的磷脂酰胆碱)*+,-*+./01234+,3056，

789&磷脂酰乙醇胺)*+,-*+./01236/+.5,3.:056，7;9&

磷脂酰丝氨酸)*+,-*+./0123-6<056，磷脂酰甘油7=9，)*+,-*+./0123>3246<,3，7?9和胆固醇)>3246<,39购自@A.5/07,3.<B0*01-。?8CD04+78D、E56C=/6*D(C78D试剂盒、链亲和素化磁力珠和分离器购自D,4+6。(F体外一步法转录和翻译系统购自@:G0,5&?CHI微离心柱采自@:6<-+.:*+.<:.40.G0,/64+&实验所需引物和JK@寡核苷酸购自(.L.D.，其它所需实验材料和实验设备实验室都已具备。!"#

脂质体膜模型制备及固定

不同成分和比例磷脂)78、7?、7;、7=、8+,39HM:>&加入NO4.*CG0,/05327;&溶于H:3有机溶剂氯仿中。利用氮气喷射蒸发形成薄膜&再加入缓冲液)(P=9!QI:3&超声处理至清亮透明。再通过滤膜)MQ!!:R03/6<9HM次以上过滤形成双层脂质体&借助于-/<6*/.A0105CG0,/05共价键固定于链亲和素化磁力珠上&完成膜模型制备及固定。依据文献#N%选择脂质体)78S7?S8+,3&!MT!T!9作为正常人体细胞膜模型&不同比例磷脂：78S7;S7=S8+,3)!MT!T!T!9、78S7;S7=)!MT!T!9和7;S7=)$TF9作为候选肿瘤细胞膜模型。!"$

检验筛选对照多肽的设立

（LKUL?V@?’@LLBB?LKU选择肽链’.-/H!

图![0>\<6!

多肽JK@库的组建8,5-/<\4/0,5,R*6*/01630G<.<2

(F](F*<,:,/,<Q=J]<0G,-,:6CG05105>-0/6Q[3.>]R3.>/.>-6^\6546QB05X6<]4,5/.0505>!"<6*6./61???=Q

@--6:G361R36_0G36305X6<-‘0/+[B@?/.>.51.$a-/6:C3,,*-‘+04+.<6X5,‘5/,-/.G030b6:DK@.>.05-/DK.-6./$a651/+<,\>+<6-/<04/0,5.5130>./0,5&/+6-6.--6:G361305X6<--6<A6.-.-*.46<Q(+6JK@30G<.<2654,105>/+6*,32*6*/016,R05/6<6-/05>0-4\/‘0/+WG.V./$a651,R/+6*,32*6*/016<6>0,5&.5130>./61/,/+6.--6:G361-*.46<Q(+630>./0,5:0_/\<6‘.--\G-6^\65/32.:*30R061G2?8C<04+78D‘0/+*<0:6<-[30G.51D-*.46<Q78D*<,1\4/-‘6<6*\<0R061.514\/‘0/+K16V./Ia651&/+6530>./61/,/+6<6^\0<61\*-/<6.:636:65/-)(F*<,:,/,<&

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10-*3.2Q

!")核糖体表达*+,-#!.*+,-/0+1+23和肽库筛

选流程

用于多肽和蛋白质表达的技术主要有核糖体表

（(@@&(?@&(@?）达法&其原理是将重组基因终止码

移去&体外翻译的多肽不会从核糖体上脱离，从而与核糖体及:DK@形成)76*/016-CD0G,-,:6C:DK@&

基因型和表型连接复合体。目前的生物学技术7D’）

要检测功能性多肽的信息或序列还存在很多困难，而利用分子克隆技术检测其基因信息就变得非常容易。因而核糖体表达法的优点体现在可以通过检测其基因型来捕捉到功能表型的信息，通过D(C78D技术得到分离后多肽基因的序列从而可以获得功能多肽的序列。!"4

检测核糖体表达法筛选穿孔多肽的可行性设立对照反应&利用核糖体表达法分别表达

和’.-/,*.<.5W)KUL?V@?’@LLBB9作为阳性B’）

对照多肽&检测穿孔多肽可筛选的可行性。肽链’.-/H!是仅能在肿瘤细胞膜上穿孔而对正常人体细胞膜无穿孔能力的肽&肽链’.-/,*.<.5W可以既在肿瘤细胞膜又可在正常人体细胞膜上穿孔的肽#N%。!"%

用于多肽表达&’(的设计和组建

利用基因重组和78D技术&组建寡核苷酸’.-/H!&’.-/,*.<.5W和用于特异多肽筛选的多肽

（图!）。为了增加表达多肽的活动度&我们设JK@库

计在多肽的非活动端连接上B05X6<；由于肿瘤细胞膜双层厚度约MQ$!:相当于!Y个氨基酸形成"C

万方数据

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表达的$%&’#!和$%&’()%*%+,$%&’#!和$%&’()%*%+,。

分别与正常人体细胞膜模型-./0.10/2(34!56!6!7-./0.80和设计的肿瘤细胞膜模型-.80.94:6;7，

-./0.80.90/2(3，.9，!56!6!7，!56!6!6!7接触4检测核糖体表达法筛选穿孔多肽的可行性和优化人工合成的肿瘤脂质体细胞膜模型。!"#

体外多肽筛选

先后分组建的肽库经体外翻译成.<$复合体，别与生物素标记的=+’>?@3%A和正常人体细胞膜模

型接触4经预筛选步骤去掉筛选前因BC=库组建的过程中发生移码突变含终止码和能与正常人体细胞膜模型结合的那部分肽链4保留预筛选后的.<$复合体与优化的肿瘤膜模型结合4利用蛋白质洗提技术提取牢固结合伸入膜内层的.<$复合体。利用逆转录-<D?./<7技术将E<C=转录扩增成BC=4再进行第二个循环筛选4如此数个循环筛选出特异结

（图#）合的.<$。

含卡那霉素平板上4!#M!"2后挑选单克隆并进行测序4分析BC=序列。!")

合成肽链检测筛选多肽体外抗肿瘤效果分析BC=序列编码多肽4选择合成出现频率高4具有能形成!?螺旋结构的多肽。选择非小细胞

肺癌细胞株-C/N?KO"57和正常人体成纤维（//B?（日本筑波大学医学院赠送）细胞株体外培养#;9G）

贴壁后，加入合成肽-浓度介于!PLM!55"E(30Q7培养OR2，加入$DD溶液继续培养O2，再加入酸化异丙醇，充分振荡后过夜，测L;5+E处的吸光度-!7值4按公式计算细胞增殖抑制率S细胞增殖抑制率T-对照组!值U用药组!值70对照组!值V!55WX。检测合成多肽体外对C/N?KO"5与//B?#;9G细胞株的抑制作用4同时选择长春瑞滨-H>+(*I3Y>+I，CHZ7作阳性对照。

*

*"!

结果

核糖体表达法筛选穿孔多肽的琼脂糖凝胶电我们设计的正常人体细胞膜模型-./0.10

泳结果

/2(34!56!6!7和肿瘤细胞膜模型-.80.94:6;74经核糖体表达法能成功地筛选到相对应的穿孔多肽4排除阳性结果是来自E<C=的非特异性结合和BC=模板消化不完全。应用细胞膜模型./0.80.90/2(3-!56!6!6!7和./0.80.9-!56!6!7筛选$%&’#!4只得到非常微弱的电泳条带4而用来筛选

（图:）。说明$%&’()%*%+,却可以得到非常强的条带

图#

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体外多肽筛选

细胞膜模型./0.80.90/2(3-!56!6!6!7和./0

.80.9-!56!6!7并不能很好地反映肿瘤细胞膜磷脂特性4不能作为肿瘤细胞膜模型筛选出可以在肿瘤细胞膜上穿孔的多肽。

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J(E)3IdI&cI*I*IE(eIaYb>+’I+&>eIc%&2>+A4%+aE<C=c%&>&(3%’Ia‘*(E’2IY(_+aJ(E)3IdI&c>’2I3_’>(+&(3_’>(+PD2II3_’IaE<C=c%&)_*>‘>Ia4*IeI*&I’*%+&J*>YIa4%+a%E)3>‘>Ia’(BC=Yb(+I?&’I)<D?./<c>’2)*>EI*&D;Z%+a<&)%JI*P<D?./<)*(a_J’&cI*I%+%3bfIaYb%A%*(&IAI3I3IJ’*()2(*I&>&4)_*>‘>Ia‘*(E’2IAI3%+aa>*IJ’3b_&Ia‘(*+Id’*(_+a

&I3IJ’>(+P

*"*多肽筛选结果

"个循环筛选后得到的高度特异结合的.<$

复合体，经逆转录技术扩增成BC=，克隆扩增BC=，挑选单克隆进行测序4以期了解特异结合多肽的特性，从中找出共同点-表!7。*"+

合成多肽体外抗肿瘤效果

三组序列中各选择一列有代表性的有!?螺旋形成倾向的氨基酸序列-9I[=:4$G\B]81H<B$@<</Q]N9Q<9]/HK^9I[Z:4$G\B]</Q=1K=NG1]=Q<9KQ=H\B和9I[/!"4$G\B]<\]@1<]</@\1.@H99\@Q\7在体外固相合成4$DD法检测体外抗非小细胞肺癌C/N?KO"5效果及对正常人体成

（表#）纤维细胞//B?#;9G的影响。

!"$克隆扩增的%&’(测定编码多肽的%&’序列

应用DF.FD=/3(+>+AG>’将数个循环筛选后

扩增的BC=产物直接与载体-HIJ’(*7连接4热休克法转染感受态细菌-BKL%74将转染感受态细菌铺在

万方数据

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图#

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对照多肽7%6M+!和7%6MKW%J%4]与脂质体膜模型筛选结果

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*H&KR’S6EA[E(Z#^.\%4REC[E>[CNKSZ!1^!^!\O2H&KR’S6EC[EA[E([CNKSZ!1^!^!^!\%4REC[EA[E(Z!1^!^!\O

7H&%J_’J‘!H7%6M+!6’S’5M’RIQEA[E(‘+H7%6MKW%J%4]6’S’5M’RIQEC[E>[CNKS‘#H7%6M+!6’S’5M’RIQEA[E(TPMNK3MJ’X’J6’MJ%465JPWMPK4‘,H7%6M+!6’S’5M’RIQEA[E(TPMNK3M%RRP4U%&P4K%5PR‘-H7%6M+!6’S’5M’RIQEC[E>[CNKS‘"H7%6MKW%J%4]6’S’5M’RIQEC[E>[CNKS‘.H7%6M+!6’S’5M’RIQEC[EA[E([CNKS‘/H7%6M+!6’S’5M’RIQEC[EA[E(‘0H7%6MKW%J%4]6’S’5M’RIQEC[EA[E([CNKS‘!1H7%6MKW%J%4]6’S’5M’RIQEC[EA[E(‘!!V!+HIS%4_5K4MJKS6O

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"个循环筛选后检测#$个单克隆测序序列

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万方数据

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5T0P和核糖体表达法可以筛选到已知对照穿孔多肽UEV@/!J排除了阳性结果是来自GW)4的非特异性结合和.)4模板消化不完全J确立了核糖体体外表达法和肿瘤细胞脂质体膜模型NKOSK1J5T0P。在肽库设计上采取在编码三连体中第一位和第二位核苷酸不设碱基限制J而在第三位核苷酸限定为X和YJ

减少在固相合成.)4寡核苷酸库中终止码（X44XY4X4Y）出现机会。再利用基因重组技术J在GW)4水平上在寡核苷酸库两端加上环型结构以增加GW)4的稳定性J同时在肽库非活动端插入F’(Z%B结构增加表达多肽的活动度。完成组建的肽库在筛选前分别与生物素标记N?’A@’(C&E@%[P的4(@’+\&E]和正常人体细胞膜模型结合J去除因.)4库组建的过程中发生移码突变和能与正常人体细胞膜模型结合的那部分多肽J增加筛选抗肿瘤多肽的特异性。经"个循环筛选的特异结合的KWU复合体逆转录扩增成.)4J利用X^K^X4$&A(’(]2’@将扩增后的.)4产物进行克隆。挑选的7-个单克隆测序结果表明<有/!个单克隆含有相同序列W;NYS1PJ_个单克隆含有相同序列WF4‘YJ在这些含相同序列的多肽中很少含有/个或/个以上的半胱氨酸J极性和非极性氨基酸按周期性有序排列有利于!+螺旋结构形成。分别从三组序列中各选择一列有高度!+螺旋结构形成倾向的肽链N1%345J1%3:5和1%3$!"P在体外固相合成J研究在体外抗非小细胞肺癌细胞株)$*+,#"-的效果。结果显示：1%345J1%3:5有抑制)$*+,#"-效果J而1%3$!"则无效J说明经膜模型筛选的抗肿瘤多肽有抗肿瘤作用J但难以避免非特异性多肽在筛选过程中与膜模型结合导致无效多肽产生。三条肽链对正常人体成纤维细胞均无影响J说明利用体外多肽表达系统和合适的膜模型J筛选特异性的抗肿瘤多肽是可行的。从而有望为肿瘤治疗提供特异性高J副反应低的抗肿瘤多肽J建立一种简便、可靠的寻找抗肿瘤多肽方法。随着肿瘤膜模型和体外表达系统的不断完善J解决好多肽不被体内蛋白酶水解，将抗肿瘤多肽应用于临床已不再遥远。

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!讨论

化学药物治疗是恶性肿瘤综合治疗主要措施之一J肿瘤细胞耐药性的产生是多数肿瘤不能得到治愈的根本困难所在。尽管目前已采取一些逆转肿瘤细胞耐药措施如应用K+糖蛋白竞争抑制剂异搏定等J但并未得到确切效果L"MJ原因是肿瘤细胞耐药并非单一机制J有许多因素共同参与。

多肽之所以能抗肿瘤是因为肿瘤细胞膜红血细胞蛋白功能缺失J细胞膜磷脂分布非对称性被破坏，

（K1）磷脂酰乙醇胺NKOP与磷脂酰丝氨酸大量地出现在细胞膜的外层。多肽链中带正电荷的极性氨基酸J与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂NK1P借静电引力作用使多肽聚集于肿瘤细胞膜表面。聚集的多肽呈现!+螺旋结构J非极性的一侧疏水氨基酸借疏水作用伸入细胞膜内层J在肿瘤细胞膜上形成无数小孔导致细胞内容物外流J达到杀死肿瘤细胞的作用L0M。多肽的这种抗肿瘤作用机制已得到多项实验研究证实LQR!-M。

研究表明多肽抗肿瘤有几个方面的药用价值：（!）多肽的作用机制完全不同于传统的抗肿瘤药物，其作用靶点是位于肿瘤细胞膜上带负电荷的磷脂。肿瘤细胞要产生耐受抗肿瘤多肽J需要在细胞膜的合成和磷脂的分布等环节上有一系列突变，因而在（/）目前使用使用过程中不易产生具抗性的突变株；

的化疗药物既能杀灭肿瘤细胞但也能破坏正常的人体细胞，造成很大的副作用。而多肽具备能选择性地抑制肿瘤细胞生长，对人体正常细胞影响非常有限，这样可以通过增加药物浓度提高抗癌效果而不必过

（5）多肽于担心增加药物浓度所带来的副反应L!!M；的抗肿瘤活性很高，其对肿瘤的致死浓度均在对正常细胞毒性却很小。因此，抗肿瘤"GA&SF级，

多肽有望成为新一代的抗肿瘤药物。

如何建立一种简便、可靠的寻找抗肿瘤多肽的方法是将抗肿瘤多肽应用到临床治疗的前提。我们首先通过预实验证实利用肿瘤细胞膜模型NKOSK1J

考文献M

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肿瘤细胞膜模型筛选抗肿瘤多肽新方法的建立

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$!!&邱晓燕，陈奕欣，张鲁榕>人工合成绿蝇防御素及其活性研究

$=&>厦门大学学报 自然科学版，C**!，%*B%D：)"WF)"’>

$编辑及校对：杨允贵&

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