口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK-21细胞中的表达

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDV P1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口

第21卷5期 中 国 病 毒 学 21（5）：454-457

收稿日期：2006-02-20，修回日期：2006-06-16

* 基金项目：国家863高技术研究发展计划（2003AA241110）

作者简介：龚真莉(1981-)，女，汉，甘肃皋兰人，硕士，主要从事动物微生物学和病毒分子生物学研究。

** 通讯作者：刘湘涛(1962-)，男，汉，湖南衡阳人，研究员，主要从事动物病毒学研究。

Corresponding author. Tel: (0931)8342710, E-mail：hnxiangtao@

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDV P1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口

龚真莉, 等. 口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK–21细胞中的表达 455 血清型，是研究分子流行病学、毒株演化关系的主

要基因。多年来，在FMD分子流行病学调查、疫

源的追踪、毒株分型、基因工程苗的研制、诊断方

法的建立等方面，P1基因均得到众多研究人员的

关注[7,8]。2A蛋白为FMDV的非结构蛋白之一，为

P1+2A间裂解提供识别序列，在病毒蛋白合成过程

中，2A蛋白能促进核糖体对肽链（P1+2A）-tRNA

酯键的水解活性，从翻译的复合物中释放已合成的

聚蛋白P1-2A[1]。本研究旨在利用pQE-Tri/P1+2A

真核表达重组质粒，在哺乳动物细胞BHK-21中高

效表达口蹄疫病毒结构蛋白和部分非结构蛋白，获

得高效、有反应活性的口蹄疫蛋白P1+2A，为研制

诊断试剂及口蹄疫基因工程疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞)及FMDV各类抗

血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口

蹄疫参考实验室（以下称本室）提供。表达载体

pQE-Trisystem、M15菌株及中量质粒提取试剂盒

（DNA Midi Kit）购自QIAGEN公司；JM109菌株

由本实验室保存；重组质粒pQE-Tri/P1+2A由作者

构建[9]。转染试剂Lipofectamine 2000及Opti-MEM I

Medium 购自Invitrogen公司。

1.2 高纯度重组质粒的获得及细胞转染

用中量质粒提取试剂盒提取阳性的重组菌质

粒。提取的重组质粒浓度（OD260）应在0.1~1.0之

间，纯度（OD260/OD280）应在1.5~2.0之间。在进行

转染前，于分入细胞前每培养皿中放入1-2个严格灭

菌的飞片，将细胞培养皿置于37℃ 5%CO2温箱中培

养至贴于瓶底的细胞达到90%～95%左右满度，即

可进行转染。DNA与转染试剂的配比应达到

DNA(µg): Lipofectamine 2000=1:2～1:3。具体转染

步骤参考转染试剂推荐方法进行。转染后将培养皿

放入37℃ 5%CO2培养箱中培养18h～48h，用以检测

目的基因的表达用。 1.3 目的蛋白在细胞中表达的检测 1.3.1 间接免疫荧光抗体检测：分别用镊子小心取出30h和48h的转染细胞飞片，同时取空白对照细胞飞片进行荧光染色。所用血清为FMDV阳性兔血清，血清按1: 800 PBS稀释；二抗为 FITC（山羊抗兔IgG荧光二抗，1:40 PBS稀释）。 1.3.2 SDS-PAGE及Western-blotting检测：将转染后30h和48h的阳性细胞及对照细胞的上清吸出并收集，并将培养皿底部的细胞刮下收集。进行SDS-PAGE及Western-blotting检测。在Western- blotting检测时阳性血清为1:500倍稀释的豚鼠FMDV阳性血清，二抗为1:1000倍稀释的兔抗豚鼠IgG(二抗，没有标记)。 1.3.3 双抗体夹心ELISA检测：分别取转染30h和48h的阳性细胞、阳性细胞上清、空白对照细胞样品及FMDV阳性抗原对照样品用于ELISA检测；酶标板用口蹄疫兔阳性血清包埋，一抗为口蹄疫豚鼠阳性抗血清，二抗为 HRP-兔抗豚鼠IgG。反应完成后在酶标仪(492nm紫外波长)下读取OD(optical density)值。 2 结果 2. 1 间接免疫荧光抗体检测结果 在转染后30h及48h分别取细胞飞片，在荧光显微镜下观察，发现转染重组质粒的细胞均有大量、明亮的荧光产生。细胞的原有形状没有发生变化，仍为典型长梭形，且荧光均出现在细胞质内，说明P1+2A蛋白在BHK-21细胞中成功表达。同时发现，转染后30h的荧光细胞在镜下相对数量较48h的多，但荧光的亮度没有多大区别，这也可能是细胞生长密度不同所导致的，但此结果可以证明转染后目的蛋白在30h左右就可达到蛋白的最高表达量。空白对照细胞没有荧光细胞产生（图1）。

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDV P1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口

第21卷5期 中 国 病 毒 学 21（5）：454-457

收稿日期：2006-02-20，修回日期：2006-06-16

* 基金项目：国家863高技术研究发展计划（2003AA241110）

作者简介：龚真莉(1981-)，女，汉，甘肃皋兰人，硕士，主要从事动物微生物学和病毒分子生物学研究。

** 通讯作者：刘湘涛(1962-)，男，汉，湖南衡阳人，研究员，主要从事动物病毒学研究。

Corresponding author. Tel: (0931)8342710, E-mail：hnxiangtao@

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDV P1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDV P1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口

456 中 国 病 毒 学 第21卷

2.2 SDS-PAGE及Western-blotting检测结果

转染细胞经过SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果

在约82kDa处出现了清晰的目的蛋白大小的条带，

与预期大小相符，空白对照细胞没有在该位置出现

条带（图1）。表达产物经SDS-PAGE电泳后转移至

NC膜上进行Western-blotting检测，表达产物能被口

蹄疫阳性血清所识别，出现显色带，说明表达的外

源蛋白具有良好的反应原性（图2）。

图3 Western-blotting 检测

Fig.3 Western-blotting

1, Expression product; M, Protein molecular weight Marker.

2.3 夹心ELISA检测结果

结果显示，转染细胞与空白对照细胞及转染细胞

上清相比，差异显著。与阳性抗原相比差异不显著。

随着倍比稀释度的提高，转染细胞和阳性抗原对照的

OD值同时逐渐降低，但转染细胞上清及阴性对照细

胞的OD值变化不大。转染细胞上清液检测值很低，

说明，口蹄疫蛋白P1+2A在BHK-21细胞中的表达在

细胞质中，没有分泌到培养基上清液中。如表1 图2 表达产物SDS-PAGE分析 Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression product. 1, Cells at 30 hours past transfection; 2, Blank cells comparison; 3, Cells at

48 hours past transfection; M, Protein molecular weight Marker.

表1 夹心ELISA法检测BHK-21细胞中的目的蛋白表达情况

Table1 Expression of target protein in BHK-21 cells tested with sandwich-ELISA

Group

Transfected

cells

Transfected

cells liquid

Blank cells undiluted 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 30h 1.456 1.456 1.180 0.910 0.694 0.513 0.382 48h 1.574 1.528 1.332 1.013 0.889 0.774 0.416 30h 0.313 0.190 0.158 0.145 0.135 0.132 0.133 48h 0.345 0.217 0.176 0.157 0.138 0.131 0.132 30h 0.530 0.634 0.675 0.614 0.462 0.322 0.226 comparison 48h 0.563 0.435 0.315 0.229 0.175 0.147 0.136 Positive antigen 1.866 1.854 1.687 1.326 0.968 0.745 0.698 3 讨论

口蹄疫缺乏有效的治疗方法，发达国家成功

扑灭的经验是扑杀销毁政策，但对目前大多数流行

口蹄疫的发展中国家来说计划免疫和免疫监控仍

是主要手段。传统的灭活疫苗存在着灭活不彻底以

及防护不当而致病毒从生产车间散播的危险[5,6,10]。

随着分子生物学技术的不断发展，以基因操作和抗

原表达为核心内容的基因工程疫苗技术有望解决

这一问题。目前已有外源基因在原核细胞中表达成

功的例子，原核细胞的蛋白表达量高，成本低，制

作工艺简单，但是许多在细菌中合成的外源蛋白的

活性都比较低[11,12]。因此，发展在真核系统中表达外源基因就十分必要，利用真核表达载体表达产物的理化和生物学特性与天然产物相似，细胞培养简单，适合规模化生产。所以近年来越来越多的研究人员开始关注真核表达载体系统，并取得了理想的结果。 本实验利用此表达载体pQE-TriSystem构建了的口蹄疫病毒免疫基因P1+2A的真核表达重组质粒，成功在口蹄疫敏感细胞BHK-21中进行表达，并且蛋白的表达量较高，达到了SDS-PAGE可见水平。哺乳动物细胞表达技术与各种表达系统相比，有其独特的优越性，尤其是用于表达大的真核蛋白，主要优点有：①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因中的内含子，间接加工成成熟的mRNA，这是原核

本研究将已构建好的、包含口蹄疫病毒P1+2A基因的重组表达质粒pQE-Tri/P1+2A经质脂体2000转染哺乳动物细胞BHK-21,转染后一定时间进行检测。通过SDS-PAGE、Western-blotting、荧光抗体染色、ELISA等检测方法表明,FMDV P1+2A基因片段在BHK-21细胞中成功表达,表达的蛋白能被口

龚真莉, 等. 口蹄疫病毒P1+2A基因在BHK–21细胞中的表达 457 表达系统所不具备的。②哺乳动物细胞表达的蛋白

质在翻译后被加工的机会较多，可提高产品正确构

型的几率，加工后的蛋白免疫原性好。③哺乳动物

细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可

重复性。适合于表达人类需用的珍贵而重要药物蛋

白和安全、环保的人类及动物疾病疫苗[12]。口蹄疫

是家畜的一类重要的传染病，是世界各国检疫和防

疫的重点对象，其检测和预防具有十分重要的社

会、经济和政治意义。所以本研究结果具有重大的

现实意义，表达的蛋白适用于以下研究：(1)进行少

量，小动物的免疫实验，初步检测其免疫保护力。

(2)可作为免疫诊断试剂用。(3)进行有构象活性的功

能蛋白的纯化。(4)进行有关蛋白—蛋白和蛋白—

DNA相互作用的分析。

References

[1] Xie Q G(谢庆阁). Foot-and-Mouth Disease (口蹄疫) [M]. Beijin:

Chinese Agricultural Publishing Company，2004.

[2] Yin Z, Liu J H (殷 震，刘景华). Animal Virology (动物病毒学)

[M]. Beijin: Science Press, 1985, 395-415.

[3] Lin R Q, Luo M L, Huang Y M (林瑞庆，罗满林，黄毓茂), et al.

Cloning and expression of foot-and-mouth disease virus type O VP1

gene [J]. J South China Agri Univ (Natural Science Edition) [华南农

业大学学报 (自然科学版)], 2004, 25(1): 92-95.

[4] Brown F. New approaches to vaccination against foot-and-mouth

disease [J]. Vaccine, 1992, 10: 1022~1026.

[5] Beck, E, Strohmaier K. Subtyping of European foot-and-mouth

disease virus strains by nucleotide sequence determination [J]. J Virol, 1987, 61: 1621-1629. [6] King A M Q, Underwood B O, et al. Biochemical identification of viruses causing the 1981 outbreaks of foot-and-mouth disease in the UK [J]. Nature, 1981, 293: 479-480. [7] Leng Q W, Guo H C, Yun T (冷青文，郭慧琛，云 涛), et al. Cloning of P12X3C3D fragment of foot-and-mouth disease virus and construction of baculovirus expression vector[J].Chin J Veter Sci Technol (中国兽医科技), 2004，24(6)：16-20. [8] Jarasvech C, Clayton B, Peter W. M, et al. Antibody response in mice inoculated with DNA expressing foot-and-mouth disease virus capsid proteins [J]. J Virol, 1998: 4454-4457. [9] Gong Z L, Liu X T, Liu L (龚真莉，刘湘涛，刘 磊)，et al. Construction of eukaryon expression vectors for P1+2A genes of foot-and-mouth disease virus [J]. J Gansu Agric Univ(甘肃农业大学学报), 2006, 2(1): 8-11. [10] Bachrach H L. Foot-and-mouth disease virus [J]. Annu Rev Microbiol, 1968, 22: 201-244. [11] Grubman M J, Lewis S A, Morgan D O, et al. Protection of swine against foot-and-mouth disease with viral capsid proteins expressed in heterologous systems [J]. Vaccine, 1993, 11: 825-829. [12] Wu Y X (吴雨霞). Expression of foot-and-mouth disease virus structural protein VP1 gene in prokaryotic and eukaryotic cells [D]. Lanzhou:.Lanzhou Veterinary Research Insistute, Chnises Academy of Agricultural Sciences (中国农业科学院兰州兽医研究所), 2003: 35-36.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/c56j.html