大鼠脂肪基质细胞分离培养

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【摘要】 目的 探讨不同大鼠脂肪基质细胞的培养、增殖与纯化方法，初步研究其生物学特性。方法 取大鼠皮下和肠系膜部位的脂肪组织，根据两种组织对胶原酶的敏感性不同，获取基质细胞，观察生长情况，并进行鉴定。结果 不同品系大鼠脂肪含量不同，皮下和肠系膜脂肪基质干细胞产率不同，生物学特性相似，贴壁细胞分两类： 第一类有明显油滴；第二类细胞内无明显油滴。第一类细胞经过传代，逐渐消失，第二类细胞所要获取的脂肪基质细胞，组化鉴定CD49d(+)和CD106(-)，为脂肪基质细胞表型。结论 建立了一种大鼠脂肪基质细胞的培养、增殖与纯化方法，不同部位来源的脂肪组织酶消化时间和细胞产率不同，同时发现所获得细胞分两类，性质有所不同，为脂肪基质细胞的相关研究打下一定的细胞生物学基础。

【关键词】 大鼠 脂肪 肪基质细胞 培养

Isolation，Culture and Identification of Rat Adipose?Derived

Stem Cells In Vitro

CHEN Lian?feng，LIN Xue，FANG Quan

(Department of Cardiology，PUMCH，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing ，China)

【Abstract】 objective To explore the methodology regarding culture，proliferation and purification of adipose?derived stem cells (ADSCs)，and to study their biological characteristics. Methods Fat tissue was obtained from mesentery and subdermal tissues of rats of different lineages. The tissue samples were digested with collagenase to obtain adipose stromal cells. Cells were isolated and purified based on their different reaction to digestion. Immunohistochemistry was used to

characterize and identify the harvested cells. Growth of cells was observed with an inverted contrast phase microscope. Results Despite different productivity，adipose stromal cells from different source tissues and different lineages showed identical biological characteristics. After 2?3 days of culture，floating cells became adherent and grew into clusters. After several passages，these cells separated and changed into spindle?shaped. The adherent cells could be further classified into two types. The first type of larger size contained profuse lipid droplets and highly positive by oil red O staining. The second type was of slimmer?shape，with little intracellular lipid and negative oil red O staining. After passages，remaining floating cells，albeit in a small number，continuesly differentiating into cells of the second type，while cells of first type gradually diminished. Assessed by immunohistochemistry，cells of the second type were CD49d(+) and CD106(-)，which were characteristic phenotype of adipose stromal cells. Conclusion With modified duration of digestion，our method can be used to culture，proliferate，and purify adipose stromal cells，despite difference regarding productivity existing among different tissue sources and diverse lineages.

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【Key words】 Rat; Fat; Adipose stromal cells; Culture

近20年，骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，marrow stromal cells，MSCs) 成为干细胞研究领域的重点，MSCs的一些特性在许多疾病的细胞治疗方面显示出相当大的潜力。与骨髓相似，脂肪组织也是中胚层来源的组织，包括微血管内皮细胞、平滑肌细胞和干细胞等一系列成分。作为干细胞组织来源，脂肪有其特殊优势：与骨髓相比，具有损伤小、获取量大、可以多次取材的优势。

本实验旨在探讨体外分离和培养大鼠脂肪基质细胞 (adipose?derived adult stromal

cells)的方法，观察细胞生长型态增殖情况，以及细胞表型鉴定。并探讨不同部位 (皮下、肠系膜)脂肪基质细胞的产率，并对不同来源脂肪基质细胞的性状加以初步研究。 1 材料和方法

1.1 实验动物

近交系BN (Brown Norway) 棕色大鼠，250 g左右，雌性，1958年由Silvers和Billingham用D.H.King和P.Aptekman培育的棕色突变型动物近交繁殖而来，合格证号为。 SD (Sprague Dawley) 白色大鼠，购自中国科学院遗传与发育生物学研究所，合格证号为SCXK京2002?0006。

1.2 试剂与实验材料

DMEM/F12培养基 (Sigma，USA)、I型胶原酶 (Gibco，USA)，胰酶/EDTA消化液 (Gibco，USA)，胎牛血清购自杭州四季青生物公司，鼠抗大鼠CD49和CD106一抗为Biochem公司，培养板及培养瓶Conning公司产品。

2 方法

脂肪基质细胞原代细胞获得：取250 g左右雌性鼠，约3周龄大鼠，将大鼠断颈处死，无菌条件下取出腹股沟脂肪垫，放在盛有D?Hank?s缓冲液的培养皿中，并用缓冲液冲洗3次清洗掉血渍，认真去除多余的结缔组织，用小剪刀将脂肪组织尽量剪碎，然后浸泡在胶原酶消化液(含有250 U/mL Ⅰ型胶原酶，2% BSA) 中，37℃恒温震荡搅拌20～50 min时间不等。肠系膜脂肪组织消化20 min即可，而皮下脂肪组织要延长消化至50 min，然后用弯头吸管尽量吹散细胞团块，组织消化后容易有明显的小细胞团，有少量小细胞块的细胞更容易贴壁存活，低速离心 (1 000～1 200) r/min 10 min。将沉淀的细胞团块用红细胞裂解液重新悬浮并静置10 min去除红细胞，随后用D?Hank?s缓冲液洗涤残留胶原酶，再低速离心去除上清，最后加入含血清培养基进行培养。

脂肪基质细胞体外培养、扩增及纯化：将从大鼠皮下、肠系膜内不同情况获取的大鼠原代培养的细胞进行种植75 cm2培养瓶中，置于37℃ 5% CO2恒温培养箱内培养。采用含5%血清培养基培养，3 d后待细胞贴壁细胞部分贴牢，换新鲜培养基继续培养，7～10 d左右待细胞几乎铺满整个瓶底时进行消化传代，消化前用D?Hank?s缓冲液洗涤，再用0.25%胰酶/0.03% EDTA消化液消化，此时细胞需要进行必要的纯化，利用消化时间的不同能够达到有效纯化目的，一般最先被消化下来的细胞为去除的杂质细胞成分，一旦这部分细胞完全消化

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需30 s～1 min时间，这部分细胞尽量倾倒去除，不要将皮下组织中可能残存的微量纤维母细胞成分，再重新加入0.25%胰酶/0.03% EDTA消化液消化1～2 min，见梭型细长细胞间有明显回缩时终止消化，在倒置显微镜下观察消化程度及时终止细胞较容易达到纯化，培养瓶中加入少量血清培养基培养终止酶活性，并用弯头吸管将消化回缩的细胞从瓶底上吹下，将细胞悬液收集并低速离心 (1 000～1 200) r/min 10 min。消化离心后即可纯化脂肪基质细胞。以后再进行1∶3消化传代，消化方法同前，也不用再次纯化。得到的脂肪基质细胞置于37℃ 5% CO2恒温培养箱内培养，并观察细胞生长。

细胞型态学观察：使用XDS?1B倒置显微镜下观察细胞生长，并用150IS?CU数码数据采集系统(CCD)对传代贴壁生长在培养瓶中的脂肪基质细胞的生长、纯化情况及增殖进行连续观察，还记录细胞生长特性，包括细胞生长周期、分裂情况等。

细胞组织化学鉴定分析：传代消化的脂肪基质细胞种植于96孔可拆板上进行细胞种植，待细胞贴壁后进行细胞固定，用4%多聚甲醛室温固定细胞15 min，PBS (pH 7.4) 清洗3次，每次5 min，之后用3%过氧化氢祛除内源性过氧化物酶，PBS (pH 7.4) 清洗3次，封闭液37℃孵箱中封闭非特异性抗原表位30 min，再加入稀释的一抗 (鼠抗大鼠CD49及CD106，1∶100)，PBS (pH 7.4) 清洗3次，根据厂家提供的鼠SP试剂盒操作步骤进行以下步骤，AEC显色。

细胞生长曲线恻定：一般细胞6 d左右达到90%融合，从细胞生长曲线上看，细胞生长较好，型态、大小较一致，传代细胞是最好选择低密度种植，有利于细胞保持低分化状态，一般我们选择10 000 cells/cm2种植进行细胞生长曲线的连续恻定。

2 结果

2.1 原代脂肪基质细胞观察

从两个不同部位来源的脂肪基质干细胞产率明显不同，而且不同品系大鼠脂肪含量也存在不同，但所获得的细胞具有相同的生物学特性，包括2～3 d悬浮后刚贴壁的脂肪基质细胞容易成堆生长，经传代几代后细胞生长分散开，细胞生长呈长梭型，原代贴壁细胞表现为两类： 第一类细胞内有明显油滴，细胞为偏大梭型，油红O染色强阳性，(图1)。随着传代细胞死亡消失，第二类细胞内无明显油滴，油红O染色阴性，此类细胞为细长梭型。同时存在少量悬浮生长的细胞经再次移出培养也能变为贴壁第二类细胞，第一类内有明显油滴的细胞经过传代，逐渐消失，贴壁第二类细胞应为我们所要收获的脂肪基质细胞。

2.2 纯化后脂肪基质细胞细胞型态学观察

接种24 h后，可见少数较大的细胞开始贴壁，呈多角型或类圆型。48 h后大多数细胞贴壁，并开始伸展、分裂、呈梭型或多角型，有粗大突起，慢慢生出触角，伸展为长梭型，贴壁细胞分布均匀，需要一段时间的型态恢复，3～5 d迅速增殖，5～7 d后，细胞逐渐分裂、融合成单层，成簇分布，排列具有方向性，并含有少量圆型或卵圆型细胞混杂生长。传代后细胞成细长梭型，核居中，5～7 d后能长满培养瓶底(图2)。经过4～5代传代，细胞呈更均匀有序排列，细胞排列紧密，类似成纤维细胞样分布，与原代种植细胞相比较，这些细胞已达纯化，细胞趋一致表型。脂肪基质细胞组织化学染色结果CD49 d阳性(图3)，CD106(-)阴性(图1～3见彩插)。

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2.3 细胞生长曲线恻定结果

潜伏适应期在第1至第2天，3 d后进入对数增殖期，对数生长期为3～5 d，6 d左右细胞生长进入近乎增殖平台期(图4)。

3 讨论

实验动物：BN棕色大鼠是于1958年由Silvers和Billingham用D.H.King和P.Aptekman培育的棕色突变型动物近交繁殖而来的，此动物脂肪普遍偏少，不适合作为进行脂肪细胞的动物来源。BN大鼠是有色鼠品系，眼睛、毛色均有颜色。对实验过敏性脑脊髓炎有抗力，对自家免疫性复合性肾小球肾炎也具抗力，平均31月龄大鼠心内膜疾病的发生率为7%，先天性高血压为30%，对戊基巴比妥钠中度敏感，其LD50为90 mg/kg，雌雄大鼠上皮瘤的发生率分别为28%和2%。雌鼠输尿管肿瘤20%，雄鼠6%。雄鼠膀胱癌自发率35%，胰腺腺瘤15%，脑垂体腺瘤14%，淋巴网状组织肉瘤14%，肾上腺皮质腺瘤12%，髓质性甲状腺瘤9%，肾上腺嗜铬细胞瘤8%。雌鼠脑垂体腺瘤26%，输尿管癌22%，肾上腺皮质腺瘤19%，子宫颈肉瘤15%，乳腺纤维腺瘤11%，胰腺腺瘤11%，该品系繁殖力低，雄鼠平均寿命29个月，雌鼠为31个月。而SD大鼠为白色，动物脂肪普遍偏多，适合作为进行脂肪细胞相关研究的动物来源。

干细胞：脂肪细胞分化的研究一直是国内外生物学及医学领域的研究热点之一。脂肪组织来源的干细胞 (adipose tissue?derived stem cells，ADSCs) 是来自脂肪基质成分的成体干细胞，具有和骨髓间充质干细胞相类似的多向分化功能和抗原特性。脂肪干细胞取材方便，可获得的细胞数量较多，这就为脂肪干细胞移植提供了丰富的细胞来源［1-3］。

ADSCs来源于中胚层，脂肪组织也是中胚层来源，含有丰富的基质成分，包括血管内皮细胞、平滑肌细胞和干细胞等，2001年以来，国内外多位学者相继从多个物种的脂肪组织分离培养出脂肪间充质干细胞。国内刘相名等和陈希哲等也分别从鼠及人的脂肪组织中获得了AMSCs，并向脂肪细胞、骨细胞及神经细胞进行了诱导［4-6］。体外研究证明：ADSCs可以分化为神经元样细胞，表明ADSCs 有跨胚层分化的能力。神经细胞属于外胚层来源，表明从中胚层来源的干细胞能够向外胚层分化。目前已经证实，脂肪干细胞可以向成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞等方向分化［7-9］。2004年Lendeckel等［10］报道了一例利用自体脂肪干细胞诱导分化为成骨细胞治疗颅骨缺损并获得成功的病例，2003年Rangappa等从新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪得到AMSCs，并成功地诱导为可自主跳动的心肌细胞。Rei Ogawa等研究表明，AMSCs 与骨髓干细胞相比，其增殖能力更强。

ADSCs向多种方向分化的研究目前还在起始阶段，已有资料已经预示了这种细胞的广泛应用前景。基于目前人们对ADSCs的认识，其实干细胞来源及类型一致的脂肪基质细胞、脂肪间充质干细胞等都是一类成体干细胞。

脂肪基质细胞有向多种细胞分化的潜能提示脂肪组织中可能存在干细胞。这种多分化的能力可能是由于: ①脂肪组织中有多种分化潜能限定的前体细胞存在; ②其他组织来源的干细胞(例如血管周细胞、周围血中的间充质干细胞) ; ③以上两种细胞的混合物。ADSCs 的这种多方向分化能力可能是有分化潜能限定的前体细胞的存在，例如前成骨细胞、前成肌细胞和前脂肪细胞。切除的脂肪组织经消化后离心型成的细胞层含有前脂肪细胞，能够分化为脂肪细胞，而不是多能干细胞向脂肪细胞分化的结果。然而，实际并非如此，切除的脂肪组织经

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消化获得的基质血管层( stromal vascular fraction，SVF )当中仅有0.2%的细胞经鉴定是前脂肪细胞，如果加工过脂肪吸取物 (processed lipoaspirate，PLA) 中的前脂肪细胞数与SVF中的前脂肪细胞数相似，PLA中的细胞分化为脂肪细胞的比例会很低。但是PLA 中的细胞分化为脂肪细胞的比例却在40%以上，所以只能用PLA中存在的其它细胞(例如干细胞)向脂肪细胞分化来解释。

未来的细胞治疗和组织工程学主要应用自体或异体的多能干细胞作为种子细胞。在过去的20多年里，研究较多的是骨髓间充质干细胞。MSCs有多向分化的潜能，可用于多种疾病的治疗。在以往的体内、体外研究中都取得了不少令人鼓舞的成就。但是MSCs的获得有一定的限制，他需要进行创伤性较大的骨髓穿刺，而且获得的干细胞数量有限。脂肪来源的干细胞有其独到之处，来源 广泛且丰富，具有很好的应用前景。但对于此类细胞表面标志不同的研究者得到的结果有所不同。

研究领域：作为一类存在成体内的干细胞类型，除在干细胞移植治疗应用研究领域有其特殊作用外，在研究脂肪的生成及代谢研究中也能起到重要作用，在代谢综合症及血脂代谢研究中，能够发挥独到作用。

实验中褪题：我们在具体实验操作中发现有两大类明显不同生长类型细胞，含有脂肪油滴的略大细胞随着细胞传代进行逐渐消失，它们一部分可能是终末分化期细胞很快死亡，可能还有一部分细胞将脂质吐出变为脂肪基质细胞，行使相关功能，国内外有报道。另一类细胞就是我们实验中获得的脂肪基质细胞，相关诱导方面研究报道涉及多领域，利用脂肪基质细胞诱导分化涉及很多问题，比如添加诱导剂中成分等。许多问题值得研究者思考和认真对待，不仅如此，我们还发现有少量悬浮生长的细胞，细胞超大，核浆比例更为表现突出，不容易贴壁，可能为更为幼稚的细胞，我们应该利用不同类型细胞进行相关领域不同疾病的研究。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/c514.html