MTT

MTT：

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉

语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，简称：四唑盐。商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

原理：

MTT产品为淡黄色粉末，易被水溶解和透过细胞膜而进入细胞内，被活细胞线粒体脱氢酶还原形成不溶于水的蓝紫色甲臢结晶并沉积于细胞中，死细胞和红细胞无这种能力。结晶物形成的量与细胞数量和代谢活性成比例，因此吸光度A值大小可以反映细胞数量和活性。 在细胞MTT法测定过程中，细胞还原MTT所形成的甲臢培养物不溶于细胞液，需加入有机溶剂使细胞裂解，甲臢颗粒溶解便于比色。

应用：

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

评价：

优点：特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

方法：

①制备靶细胞（适宜浓度）。②加入待测的细胞因子或化学药物，37 ℃、5%CO2环境培养适宜时间。③加入MTT溶液，继续孵育数小时。④加入溶解剂溶解甲臢颗粒一定时间。⑤酶标仪上读OD值。 改进：

采用原法，用酸化异丙醇作为甲臢颗粒溶解剂，遇到了颗粒不易溶解、培养液中酚红、小牛血清干扰致使OD值变异大，方法的敏感性降低。解决方法有：①先去除培养基（离心除上清），再加溶解剂。有丢失细胞的危险。②直接加入

适当溶解剂。不丢失细胞，但OD值仍易受酚红、血清或剩余MTT的影响。

条件摸索：

①细胞浓度 ②药物作用时间

药物作用时间太短，药物不能完全作用于细胞；作用时间太长，细胞的自然死亡和药物同时影响了A值。常见1-2天，也有更长的。 ③MTT加入量

当细胞较少时，吸收值（A）受MTT体积变化的影响不大，认为是细胞相对MTT达饱和的原因；但当细胞很多时，即MTT相对细胞达饱和时，A值随 MTT体积增加而增加。常见10或20μl（5mg/ml） ④MTT作用时间

常见4 h，也有6 h，或过夜 ⑤溶解剂的选择

传统方法采用0.04 mol/l的酸化异丙醇作为溶解液，极易引起培养液中小牛血清产生沉淀，干扰测定结果。甲臢溶解呈色后很不稳定，一小时内完全褪色，结果必须在30 min内测完，不利于大批量的检测。

优化溶剂：①20%十二烷基磺酸钠（SDS）—50%二甲基甲酰胺（DMF），具有较高溶解能力，不引起蛋白沉淀，血清浓度达25%也不干扰测定结果，酚红和残留的MTT均不影响结果。但溶解时间约4 h，利用超声波震荡可加快反应过程。甲臢产物吸收谱广（550-600 nm），但配制较为复杂。②二甲基亚砜（DMSO），较好的解决了蛋白沉淀问题、不需要特殊配制、直接采用原液（DMSO）溶解迅速、溶液澄清、提高了该法的敏感性。可迅速溶解甲臢颗粒，溶解力强，但能与孔中残存MTT反应，产生的颜色随时间延长而不断加深，使结果的本底A值升高，且受MTT残余量或加样量变化的影响。仅在4-12 h内有较好的稳定性。③10%酸化的SDS作为溶解缓冲液，呈色稳定，数月后比色，结果仍无显著差异，但溶解力不如DMSO。

当用MTT法测定代谢活性低得细胞时，为获得可测得的A值，需加入大量的细胞。为此，有人将一种电子偶联剂甲苯醌引入MTT比色法中。结果显示，将甲苯醌与MTT一起加入细胞中，在细胞数相同的情况下，甲苯醌可大大提高

细胞还原MTT形成甲臢的量，从而提高检测的灵敏度。 ⑥检测波长的选择 不同溶剂最大吸收波长不同

附：

1）MTT配制方法

通常使用的MTT浓度为5 mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5 g，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22 μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌。MTT一般最好现用现配，过滤后4 ℃避光保存两周内有效，或配制成5 mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

①MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套。 ②配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。

③PBS（pH=7.4）配方：NaCl 8 g ＋KCl 0.2 g ＋Na2HPO4 1.44 g ＋KH2PO4 0.24 g调pH 7.4，定容1L。 2）举例

①李杰等选抗癌药物的方法：选择一定的人癌细胞系，培养于含10%-15%小牛血清的RPMI-1640完全培养液中。当细胞处于对数生长期时，常规消化传代、计数，调整细胞浓度为（1.0-2.0）×104 /ml，接种于96孔平板中，每孔加瘤细胞悬液180 μl，孵育24 h，吸去培养液，加入配制好不同剂量供试药物20 μl，空白对照孔加入等容积培养液，放入37 ℃、5%CO2 培养箱中，培养 48 h，沿孔边缘轻轻吸去上清100 μl，加入MTT储液10-15 μl （5 mg / ml）。MTT 储液需用0. 02 M 含0. 5%葡萄糖的磷酸盐缓冲液配制，（MTT用PBS，即磷酸缓冲液配制）调pH为7.2，过滤除菌, 4 ℃避光保存（称取250 mg MTT，放入小烧杯中，加50 ml培养液或平衡盐溶液，在电磁力搅拌机上搅拌30 min，用0.22 μm的微孔滤膜除菌，4 ℃保存备用，两周内有效）。37 ℃孵育4 h, 每孔加入DMSO 150-200 μl，轻轻振荡5-10 min，用酶联免疫检测仪（ DG-3022 型,华东电子管厂产品）或全自动酶标仪测定其OD 值, 测定波长为570 nm，参考波长为 630 nm。若采用10%酸化SDS，则需加入 100 μl, 过夜测定。

②芳蓉等实验发现，MTT法较佳条件是每孔细胞数0.21×104-14.0×104之

间，37 ℃，5%CO2饱和湿度培养1-2天，加入MTT（5 μg/ml）10 μl或20 μl后继续培养4 h，清除培养基对检测的干扰，然后每孔加100 g/l SDS100 μl，微量振荡器震荡5 min，室温0.5 h，在450-550 nm处测定吸光度，有较好效果。

③郑永唐等认为MTT最佳条件为：①每孔加入MTT 20 μl（5 mg/ml）②37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育4 h③每孔加100 μl 20%SDS-50%DMF ④微型混合器震荡15 min左右，37 ℃孵育4 h或过夜（18-20 h）⑤酶标仪读数，测定波长595 nm，参考波长655 nm。酶标OD值为OD595-OD655，以消除非特异性光吸收效应。

④尤迎春等选用了人肝癌SMMC-7721细跑株对MTT比色分析法用于体外抗肝癌化疗药敏感试验中的几个变量进行了研究讨论。结果显示：MTT甲臢产 物最大吸收波长为570 nm；MTT的用量以每孔20 μl （5 mg/ml）为最宜；MTT孵育6小时所得光吸收度（A）值最高；甲臢产量与细跑密度有好的线性关系； 四种化疗药（阿霉紊、卡铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素）的作用时间以72-96小时为最好，且药物对细胞株的抑制率随药物浓度的增加而增加。 3）网页上实验步骤 药物MTT法实验步骤 贴壁细胞：

1：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度1000- 10000 孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。

2：5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反应真实情况

3：5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

4：每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

5：终止培养，小心吸去孔内培养液。

6：每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7：同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

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