荧光分析法在生物领域应用

荧光分析法在生物领域的应用与进展

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摘要：本文综述了荧光分析法在生物领域的研究进展，其中包括检测细胞活性，测定生物样品，研究生物群落动态，研究蛋白质、核酸等生物大分子与药物小分子的相互作用等，并展望了荧光分析法在生物领域的应用前景。 关键词：荧光分析法 研究进展 应用 发展前景

0.引言

分子受光子激发后，由第一电子激发单重态回到基态的任一振动能级伴随的光辐射称为分子荧光。利用某些物质被紫外光照射后所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。它有如下特点：灵敏度高，选择性优于吸收光谱法，试样量小，操作简便，发光检测的灵敏度高，发光参数多。正是因为这些优点，荧光分析法在生物领域内获得了广泛的应用。

1.荧光分析法的发展状况

1.1近十年发展状况

近10年来，由于微量分析的需要迅速增加，灵敏度高选择性强的荧光分析法日益受到重视。有关文献数量猛增，内容也从一般仪器及分析方法介绍发展到高精度、高灵敏度、自动化、多用途的新仪器新技术研究。荧光分析对象从以无机样品为主发展到以有机及生化样品为主,并从成分分析向化学结构、化学形式、微观分析、空间分布等状态分析发展，应用遍及各个领域。荧光分析法的应用范围与发射光谱法、火焰光度法、质谱法等相仿，成为一种重要的仪器分析方法。

1.2荧光分析法在药物分析中被广泛应用

荧光分析法以其灵敏度高、选择性好、操作简便等优点受到分析工作者的青睐，将荧光分析法应用于药物分析，已在药物有效成分分析鉴定、药物代谢动力学研究、临床药物与药效分析等方面取得长足发展，并广泛应用于生化分析、生物医学等领域的痕量分析。

常规荧光分析法最早被应用与分析抗疟疾药物奎宁，随着荧光分析法的发展，其应用范围日益扩大，被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析。由于自身具有发射荧光特性的物质相对较少，并且受到拉曼峰和散射光等背景的干扰，常规荧光分析法在药物分析中的应用受到限制。为使荧光

分析法的应用更加广泛，发展了各类荧光分析方法，如对不发荧光的物质可通过某类化学反应使其转变为适合测定的荧光物质，近年来，还发展了各种新型荧光分析技术，如激光诱导荧光法，同步荧光法等，这些技术的应用加速了各种新型荧光分析仪器的研制，使荧光分析不断朝着高效、痕量、微观和自动化方向发展。

2.荧光分析法的基本原理

2.1.荧光产生的机理

2.1.1分子的激发态—单重激发态和三重激发态

电子激发态的多重度：M=2s+1 （S为电子自旋量子数的代数和）

基态单重态：M=2s+1=1

激发单重态：M=2s+1=1

激发三重态：M=2s+1=3[1]

2.1.2分子的去活化过程

处于激发态的分子是不稳定的， 它可能通过辐射跃迁或非辐射跃迁等去活化过程返回基态，其中以速率最快、激发态寿命最短的途径占优势。

2.2激发光谱和发射光谱

任何荧光分子都具有两种特征的光谱，既激发光谱和发射光谱。荧光的激发光谱和发射光谱是荧光物质的基本特征，他们是荧光定性和定量分析的基本参数和依据。

荧光光谱的特征：a.斯托克斯（Stokes）位移，b. 镜像规则，c.发射光谱的形状与激发波长无关

3.荧光分析法的注意事项

3.1荧光的减退

荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化作用，会使荧光逐渐减退。

3.2试剂的浓度

有些试剂能吸收紫外线，有颜色的试剂还有吸收荧光的作用，因此分析时所加试剂的量不可太多。

3.3 pH的影响

大多数荧光反应都受溶液酸碱度的影响，故荧光分析需在适合的酸碱度溶液中进行。最适当的酸碱度必须由实验来确定。所用酸的种类也影响荧光的强度，例如，奎宁在硫酸溶液中的荧光较在盐酸中的要强些。

4.荧光分析法在生物领域的应用

4.1荧光分析法检测细胞活性

应用二乙酸荧光素(FDA)-溴化乙锭(EB)双染色同步荧光分光光度法测定细胞活性变化,灵敏度和特异性与普通荧光分光光度法相比较有所提高。方法：FDA-EB对已知比例的死、活细胞双染色,选择△入=40nm进行同步荧光扫描,与普通荧光分光光度法测定值进行比较。结果：该方法与通常的荧光法相比,灵敏度有较大提高,并能确定溶液中死、活细胞比例关系。结论：FDA-EB双染色同步荧光分光光度法可用于细胞活性变化的定性定量分析。[2] [3] [4]

4.2荧光分析法测定生物样品

通过电化学氧化肾上腺素，使其生成羟基吲哚类荧光物质(λem=490nm)，实现了药物中肾上腺素含量的电化学氧化-荧光检测。研究结果表明,荧光强度与肾上腺素浓度分别在2.00×10-7—1.00×10-6mol/L和1.00×10-6—4.00×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为6.70×10-8mol/L。该方法用于药物制剂中肾上腺素含量的测定，相对标准偏差小于1.88%(n=7)，加标回收率为88.4%—116.6%。[5] [6] [7] [8]

4.3荧光分析法研究生物群落动态

目前常用于分析色素浓度的分光光度法灵敏度较低，当样品中色素含量很低时，难以检出[9]。也有研究曾经采用了同步荧光法测定了海洋浮游植物的叶绿素[10]，但至今还未见用于湖泊底泥中色素分析的报道。Yuk等人应用高效液相色谱(HPLC)法分析了Baikal湖湖泊沉积物中的色素L，该方法检测限很低，灵敏度极高。但此法样品前处理过程较为复杂，且成本较高。而荧光分析法灵敏度较高，所需样品量少，更为简便、快速和经济。虽然蓝藻一般在夏季形成水华，但是认识藻类在底泥中初春的动态规律有助于了解水华形成的机理。以太湖梅梁湾地区的底泥为材料，利用荧光分析法测定藻蓝素含量，并用同步荧光分析法同时测定湖泊底泥中的叶绿素a、叶绿素b含量，目的是利用不同色素的定量分析来表征底泥中不同类群藻类的比例，为探讨不同季节底泥中水华蓝藻存在状态与春季蓝藻复苏以及随后水华发生的时空关系提供技术支持。

4.4药物小分子与生物大分子的相互作用

4.4.1蛋白质与药物小分子的相互作用

研究小分子与生物大分子之间的相互作用，特别是具有生物活性的药物小分子与生物大分子的相互作用，有助于了解药物在体内的运输和分布情况，对阐明药物的作用机制、药代动力学及药物的毒副作用有重要意义。

Yuri Vll’ichev等研究了赭曲霉素与人血清白蛋白的相互作用，以及相互作用的结合位点数、赭曲霉素和其他酸性化合物与蛋白质的竞争性结合。潘祖亭等应用荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究了双嘧达莫[11]、盐酸多西环素[12]、甲苯咪唑[13]等药物与牛血清白蛋白的结合反应，并根据 Foster理论模型计算出给体与受体间的结合距离和一些物理化学、热力学参数，为研究药物与蛋白质结合作用提供了借鉴。

4.4.2核酸与药物小分子的相互作用

DNA和核糖核酸（RNA）是重要的遗传物质，也是某些药物作用的靶分子，研究DNA和RNA与小分子荧光探针及药物的相互作用有重要意义[14]。

应用荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究药物与DNA 相互作用的主要依据是，药物与 DNA作用后吸收光谱和荧光光谱发生了变化。但与蛋白质不同的是，DNA的吸收波长在260nm，而其荧光很弱，直接利用荧光光谱法研究药物与DNA的相互作用受到一定的限制。因此，在用荧光光谱法研究药物与DNA的作用时，一般要利用与之相互作用的药物的自身荧光，或者利用荧光探针试剂与DNA作用后产生的荧光。

核酸是当代新药发展的首选目标。李志良等[15]将荧光法用于抗癌药物的初步筛选。唐宏武等[16]根据吖啶橙可穿过完整的细胞膜并能用于细胞内DNA和RNA染色的特点，提出一种新的抗癌药物的筛选方法。袁小英等[17]用荧光法研究了环丙沙星与小牛胸腺DNA的结合反应，并利用所测的结合常数研究了铜(II）对环丙沙星和DNA相互作用的影响及其可能的机理。

5.荧光分析法的发展前景

随着科学的发展，生物分析已成为现代分析化学发展的最重要的前沿领域之一。为了适应这种形势的要求，众多分析化学工作者正在不断努力开发着新的方法和技术。纳米尺度上的生物分析化学就是其中的一个重要代表。纳米生物分析材料和器件及其在生物分析中的应用是当今国际分析科学领域的研究前沿及发展方向之一，是各国关注重视的研究热点。在生物医学及生命科学中应用最多的是分子光谱分析方法。其中由于荧光光谱的灵敏度高选择性好，因此对分子荧光方面的研究更是十分活跃。此外，随着药学学科的发展，人们对药

物分析的要求越来越高，因此必须运用和发展更适当的分析方法来满足药物分析的要求。今后的发展方向是：探索并提出常规药物荧光分析新方法，与计算机技术紧密结合，研制出自动化程度高、获得和处理信息速度快的荧光分析仪器，发现和合成选择性优良的药物荧光试剂，与其他现代化分析仪器和方法联合使用，以更准确、更灵敏、更专一和更低检测限获得药物及药物与生物大分子相互作用的有关信息。

荧光探针作为研究生物大分子（如：核酸、蛋白质）的有力工具，在 20 世纪 90 年代取得了长足的进展，新的靶扩增技术（PCR）已日臻完善，发光标记探针也已经与放射性同位素标记具有同等重要的地位，而且已应用于 DNA 杂交研究、疾病诊断和食品微生物检测等方面。荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色，DNA电泳，核酸分子杂交，定量 PCR 技术以及 DNA 测序上都有着广泛的应用前景。

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