生物化学实验技术复习要点整理 - 图文

前言

1. 本课程主要讲述了哪些实验技术，其中被称为生化实验室中三大实验技术的是？

答：层析技术、电泳技术、离心技术、分光光度技术、免疫化学技术。其中层析技术、电泳技术、离心技术是生物学的三大实验技术。 第一章 生物化学基本操作与要求

1.洗涤液的种类配置与应用 答：（1）铬酸洗液（称取5g重铬酸钾粉末置于250mL烧杯中，加水5mL，尽量使其溶解，慢慢加入浓硫酸100mL，边加边搅拌。冷却后贮存备用，若颜色变绿，表示洗液已失效。）用于洗涤玻璃器皿。（2）浓盐酸，洗去水垢或某些无机盐沉淀。（3）30%硝酸，洗涤CO2测定仪器及微量滴管（4）45%尿素，洗涤蛋白制剂、血样（5）有机溶剂，洗涤油脂、脂溶性染料（6）去污粉，一般污染物 2. 化学试剂的分级

答：

3. 什么是准确度、精密度？

答：准确度表示实验分析测量值与真实值相接近的程度。误差。精密度是指在相同条件下多次测量结果互相吻合的程度，表现了测定结果的再现性。偏差。 4. 如何提高实验的准确度、精密度？

答：准确度：减少系统误差1.仪器校正2.空白试验3.对照实验；精密度：减少偶然误差1.平均取样2.多次取样。

第二章 层析技术 1. 层析技术及其原理

答：层析技术是一种基于被分离物质的物理、化学、生物学特性的不同，使它们在某种机制中移动速度不同而进行分离和分析的方法。 2. 名词：固定相、流动相、分配系数

答：固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等）也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。 分配系数：是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量的比值， Kd=固定相中的总量/流动相中的总量。 3. 层析法的分类

答：按流动相的形式分：气相色谱法1.气固色谱法2.气液色谱法，液相色谱法1.液固色谱法2.液液色谱法；按固定相的形式分：1.柱层析法2.纸层析法3.薄层层析法。 4. 几种主要凝胶的中英文名称、型号、及型号数字代表的含义

答：葡萄糖凝胶（dextran型号Sephadex G-10~200数字代表凝胶的吸水率）

聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide主要型号有Bio-Gel P-2~300,数字代表它们的排阻极限的10-3）琼脂糖凝胶（agarose Sepharose,Bio-Gel A）

5. 凝胶层析及其基本原理、操作过程和主要应用

答：是利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。原理：由于被分离物质的分子大小不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。应用：1）脱盐及去除小分子杂质2）蛋白质的分离、生物大分子的纯化3）分子量测定4）去热源物质5）溶液的浓缩

6. 离子交换层析的原理、离子交换剂的类型

答：原理：依据各种带电离子或生物大分子与带相反电荷离子交换剂的结合力不同而进

行分离纯化的。阴离子交换剂：吸附阴离子，如DEAE； 阳离子交换剂：吸附阳离子，如CM。 7. 离子交换色谱的操作和应用

答：1.离子交换剂的选择2.离子交换剂的处理和保存3.层析柱的选择4.平衡缓冲液的选择5.洗脱、洗脱速度控制6.样品的浓缩、脱盐7.再生和保存。 应用：1.水处理2.分离纯化小分子物质3.分离纯化生物大分子物质。 8. 何谓亲和层析

答：是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。 9. 各种层析原理和载体的综合比较 （见ppt表） 答：

第三章 电泳技术

1. 电泳（技术）的概念

答：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。

2. 电泳的分类

答：按分离的原理：1.区带电泳2.自由界面电泳3.等速电泳4.等电聚焦电泳；

按支持介质的不同：1.纸电泳2.醋酸纤维薄膜电泳（1、2为区带电泳）3.琼脂凝胶电泳4.聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳（PAGE）5.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)； 按支持介质形状不同：1.薄层电泳2.板电泳3.柱电泳；

按用途不同：1.分析电泳2.制备电泳3.定量免疫电泳4.连续制备电泳； 按所用电压不同：1.低压电泳2.高压电泳。

3. 什么是迁移率？影响迁移率、电泳分离的主要因素

答：是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，m=v/E。

迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比，与粒子的形状有关；

电泳分离的影响因素：1.带电颗粒的性质（所带净电荷的数量大小及形状）2.溶液的pH值（离等电点远，快）3.溶液的离子强度（离子强度小泳动快）4.电场强度5.电渗作用（方向一致，快）6.支持介质的筛孔。

4. 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？

答：1.化学聚合：加速剂TEMED使催化剂过硫酸铵形成自由基，这些自由基的产生可

引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应形成;

2.光聚合：催化剂核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化成自由基，引发聚合反应。TEMED存在可加速聚合。

5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳和不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别、分离效应

答：区别：A：整个电泳体系中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的；B：在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液，pH值和孔径

。分离效应A：分子筛效应（某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状）B：1.样品的浓缩效应2.电荷效应3.凝胶的分子筛效应。 6. 简述等电聚焦及其优缺点

答：是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的。

优点：1.分辨率高，可达0.01pH单位2.能抵消扩散作用，使区带越走越窄3.可直接测出蛋白质的等电点，精确度可达0.01pH单位。缺点：1.该法要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀2.不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。 7. 什么是双向电泳？

答：由第一向等电聚焦（IEF）电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结合组成。

第四章 离心技术

1. 离心技术的概念

答：是利用转头旋转产生的离心力，根据物质颗粒沉降系数、质量、密度的差异将其分离的方法。

2. 名词：相对离心力、沉降速度、沉降系数、沉降常数

2

答：相对离心力：F=mωr,F常用重力加速度表示，称为相对离心力。 沉降速度：在离心力作用下，单位时间内物质颗粒运动的距离。

沉降系数：单位离心力下的沉降速度。 沉降常数：颗粒在20℃水中的沉降系数。

3. 离心机和离心转头（转子）的种类

答：离心机的种类：低速、高速、超速离心机，冷冻离心机，台式、地式离心机，制备

性、分析性离心机；

离心转头的种类：1.角度转头FA2.甩平式转头SW3.垂直转头V4.区带转头Z5.连续流动转头CF。

4. 简述离心分离的方法（3种） p99~101

答：1.差速沉降离心：不断改变离心速度，使沉降速度不同的颗粒在不同的速度和时间

下分批分离的方法，一般用于沉降系数相差较大的颗粒，用角度转头。

2.差速区带离心：在一定离心力的作用下存在沉降系数差的不同颗粒各自以一定速度沉降，后在密度梯度不同的介质上形成区带，用于分离有一定沉降系数差的颗粒或密度相似大小不同的样品和核酸、蛋白质等成分。

3.等密度离心：离心管中预先放好梯度介质离心时，样品的不同颗粒一直移动到与他们密度相等的特定梯度位置上，形成不同的区带，用于分离大小相近而密度不同的样品。 5. 如何进行离心区带的收集？

答：1.用注射器和滴管由离心管上部吸出 2.用针刺穿离心管底部滴出

3.用针刺穿离心管区带部分的管壁，把样品区带抽出 4.用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。 第五章 分光光度技术

1. 名词：朗伯-比尔定律、吸收光谱、吸收光谱曲线

答：朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，吸光度与溶液的浓度、液层厚度的乘积成正比A=KCL。

吸收光谱：通常分子处于基态，当他吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。 吸收光谱曲线：若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度或透射程度，以波长λ作横坐标，，“A（吸光度）”或“T（透光度）”为纵坐标，画出连续的“A-λ”或“T-λ”曲线。 5. 图示说明分光光度计的基本结构

答：

6. 分光光度计的光源及适用范围

答：光源要求：1.能提供连续的辐射；2.光强度足够大；3.在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；4.光谱范围宽；5.使用寿命长、价格低。

热辐射光源用于可见光和近红外光区的光源如钨灯和卤钨灯，使用波长范围是320~1100nm，气体放电光源用于紫外光区的如氢灯和氘灯，使用波长范围是195~400nm。 7. 分光光度计分析条件的选择（见讲义）

答1.仪器测量条件的选择；2.显色反应条件的选择3.参比溶液的选择。

8. 为什么要进行显色反应？显色反应需要满足哪些要求？影响显色反应的因素有哪些？ 答：

响显色反应的因素有：显色剂用量,溶液酸度,显色时间,温度,溶剂 9. 分光光度法在核酸与蛋白质的纯度分析中的应用原理

答：可用A260/A280的比值鉴定其纯度

纯DNA比值为1.8，纯RNA比值为1.0。

第六章 免疫化学技术 1.双向免疫扩散法

答：是以琼脂为介质的Ag-Ab沉淀反应。

2.阐述2种免疫电泳的原理（对流免疫电泳、火箭免疫电泳） 答：

3.对流免疫电泳与双向免疫扩散法的异同

答：对流免疫电泳：是在凝胶介质中将电泳法和扩散法相结合的一种免疫化学方法。 双向免疫扩散法：是以琼脂为介质的Ag-Ab沉淀反应。

异：对流免疫电泳是抗原、抗体分子在电场作用下定向运动，双向免疫扩散法是自由扩散。 同：都基于琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应的特性，根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡，可定性定量地检测出样品中抗原或抗体的存在及含量。

4.ELISA及其基本原理 答：酶联免疫吸附法是指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。

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