PEI及其共聚物的胶囊化siRNA在肿瘤基因治疗中的研究进展

ＰＥＩ及其共聚物的胶囊化ｓｉＲＮＡ在肿瘤基因治疗中的研究进展

史秋生段友容杜联芳

【摘要】ｓｉＲＮＡ诱导的基肉沉默为肿瘤的基因治疗提供了新的有效手段．但外源性ｓｉＲＮＡ在体内的安全高效递送一直是亟待解决的炎键问题。聚乙烯哑胺（ＰＥｉ）及其共聚物能够包裹ｓｉＲＮＡ形成胶囊化的纳米粒，在体外多种肿瘤细胞实验、体内多种肿瘤模型经瘤内、腹腔或静脉途径应用中，对肿瘤细胞和移植瘤模型的生长都有良好的抑制效果。纳米粒中ｓｉＲＮＡ的稳定性和生物活性与ＰＥ！的结构、分子量、Ｎ／Ｐ比值以及构成共聚物的成份等密切相关。

【关键词ｌ外源性小干扰ＲＮＡ；中图分类号：Ｑ７５２；Ｑ７８

聚乙烯亚胺；

共聚物；

胶囊化；

肿瘤

文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－－４１８１（２０１１）Ｏｌ一００４３－０７

ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｉＲＮＡｗｉｔｈＰＥＩａｎｄｉｔｓｓｈｅｎｇ＊，ＤＵＡＮＹｏｕ－ｒｏｎｇ，ＤＵ

ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓｆｏｒ

ｃａｎｃｅｒ

ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ

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ｔｈｅＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ，ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏｔｏｎｇ

Ｕｎｗｅ＝ａ弦Ｓｂ们２０００８０，Ｃｈｉｎａ

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ｉｍａｇｉｎｇ。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ

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Ｕｌｔｒａｓｏｎｏｇｒａｐｈｙ，

【Ａｂｓｒａｃｔ】ＴｈｅｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ｐｒｏｖｉｄｅｓ

ａ

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ｔｈｅｒａｐｙｏｆｎｅｏｐｌａｓｍ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｓａｆｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓｓｉＲＮＡｉｓｓｔｉｌｌｔｈｅｋｅｙｉｓｓｕｅｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌ

ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｏｌｙｅｔｈｙｅｎｉｍｉｎｅｓ（ＰＥＩ）ａｎｄｉｔｓｅｏｐｏｌｙｍｅ玛ｃ蛐ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｓｉＲＮＡｉｎｔｏｃｏｍｐｌｅｘｉｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆ

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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ＳｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ；Ｐｏｌｙｅｔｈｙｅｎｉｍｉｎｅｓ；Ｃｏｐｏｌｙｍｅｍ；

０引言

ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，

穿过血管内皮细胞层的自然障碍进入组织间隙后，又必须克服由多糖和纤维蛋白构成的致密的细胞外基质网对生物分子的阻碍。ｓｉＲＮＡ带负电荷，因此不易穿过细胞膜进入细胞浆。面对这些障碍，ｓｉＲＮＡ的递送，尤其是载体递送已经成为ＲＮＡｉ的挑战性课题之一１２，６－７１。

病毒作为载体．单次给药可达到长效的基因沉默效果。但它具有潜在的免疫原性，病毒的基因序列引起的插入诱变或触发的异常基因表达所带来

随着对内源性ＲＮＡ干涉（ＲＮＡ小于扰ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ

ＲＮＡｉ）分子机制的认识加深，人们对引入的外源性

ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ

ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）作为一种崭新的高效药物用于治疗一些难治性疾病进行了深入研究。对某些疾病如老年性黄斑变性的局部给药应用研究已进入Ⅱ～Ⅲ期临床试验阶段１１－５１；不过对于大多数疾病而青，临床则需要经全身给药。ｓｉＲＮＡ在到达靶部位之前．必须克服一系列生理障碍，如ｓｉＲＮＡ必须避免被肾脏滤过、被乔噬细胞摄取、与血清蛋白结合凝集、被内源性核糖核酸分解酶（ｒｉｂｏｎｕｅｌｅａｓｅ，ＲＮａｓｅ）降解。在

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１８Ｉ．２０１１．０１．０１０

基金项月：冈家自然科学基金资助项一（３０７７２３６９，Ｈ１２０５）；上海市级跃院适宜技术联合开发推广应用项ｒｊ（ＳＨＤＣ１２０１０２２１）

作者单位：２０００８０上海交通大学附属第一人民医院翘声科分子影像研究窜（史秋’仁、十ｌ：联芳）；２０００３２上海交通大学肿增研究所药物递送研究窜（段友窖）

通ｆ１．ｉ作者：杜联芳．Ｅｍａｉｌ：ｄｕ—Ｉｆ＠ｉ６３．ｃｏｍ

的不可治性基因诱变风险令人担忧【２１。非病毒载体

的材料种类较多．脂质体转染效率高，免疫原性和细胞毒性相对较低，但是磷脂双分子层结构中的液性隔间（ａｑｕｅｏｕｓｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）．使其所形成的纳米粒稳定性有待提高ｍ８ｌ。细胞穿透肽（ｃｅｌｌ

ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇｐｅｒｍｅａｎｔ

ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＣＰＰｓ）或膜渗透肽（ｍｅｍｂｒａｎｅ

ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＭＰＰｓ）的阳离子氨基酸与质膜的阴离子相互作用。以非受体结合的方式能够被细胞摄取．为ｓｉＲＮＡ递送提供了新的途径；但是ｓｉＲＮＡ与ＣＰＰｓ以共轭方式携带．由于电荷密度低．形成的纳米粒

万方数据

垦堕生塑匿兰王矍墨查２Ｑ！！生兰旦箜丝鲞笙！塑丛』！ｉ！些！垦篮：坠！坐型！！！！！！垡：丝：坠：！

也不够稳定，基因沉默效率低［９－ｔｌｌ。壳聚糖、聚乳酸一乙醇酸共聚物（ｐｏｌｙ（１ａｃｔｉｃ．ＣＯ．ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ），ＰＬＧＡ）是生物可降解聚合物；但是作为载体，ｓｉＲＮＡ的包裹率和基因沉默效率低【１２－１５１。聚乙烯亚胺（ｐｏｌｙｅｔｈｙｅｎｉｍｉｎｅｓ，ＰＥＩ）由于其特殊的单元结构模式，是递送基因的“金标准”材料，基因沉默效果十分明显，但是明显的细胞毒性限制了临床应用陋ｍ。迄今为止，仍无安全高效的基因载体。

近年来的实验研究表明：不同分子量的ＰＥＩ及其共聚物递送ｓｉＲＮＡ对肿瘤有较好的抑制效果，而且无明显细胞毒性１１８－２１ｌ，从而推动了ｓｉＲＮＡ作为药物治疗肿瘤的研究进程。本文就ＰＥＩ及其共聚物的胶囊化ｓｉＲＮＡ在肿瘤基因治疗方面的研究进展作一综述。

ｌ

ＰＥＩ的质子海绵假说

ＰＥＩ是合成的直链（１ｉｎｅａｒ，Ｌ－ＰＥＩ）或支链

（ｂｒａｎｃｈｅｄ，Ｂ—ＰＥＩ）聚胺多聚体，分子量大小不等，每隔３个位置，有一个可质子化的胺基和一个高密度的阳离子区，使得该聚合体在离子构成上呈“海绵”样结构１２２１。通过静电相互作用，ＰＥｌ分子将带负电荷的核苷酸浓缩成（或胶囊化包裹成）聚合物络合物或包埋式聚合电解质络合物１１９－２０１，络合物通过静电的内向通量，引起内涵体的稳定性减弱，使得内涵ｓｐｏｎｇｅ

ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的生物生理特性ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的表征原子力显微镜检查法（ａｔｏｍｉｃ

ｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，

ｋｕ的支链ＰＥＩ（Ｂ—ＰＥＩ）、二硫键交联的ｋｕ的直链ＰＥＩ（ｓｓＰＥＩ）、分子量为５ｋｕ

２５

ｋｕ形成的络合

ｋｕ的ｋｕ的Ｌ－ＰＥＩ、分子量为２５ｋｕ的

万方数据

Ｂ．ＰＥＩ

３种ＰＥＩ胶囊化的ｓｉＲＮＡ的表征，当Ｎ／Ｐ比

值分别为ｌ、３、６、８时，Ｂ．ＰＥＩ２５

ｋｕ形成的纳米粒大

小分别为６８、２９９、５９、８０ｎｍ；而前２者在任何Ｎ／Ｐ

比值时，粒子大小都分别在１９５、１５５ｎｍ以上。Ｎ，Ｐ

比值不同，纳米粒表面电荷也不相同：Ｎ／Ｐ为ｌ时，３种粒子均带负电荷，随着Ｎ／Ｐ比值的增高，Ｂ—ＰＥＩ

２５

ｋｕ表面呈正电荷，其他２种的负电荷逐渐减少。

ＰＥＩ

Ｆ２５．ＬＭＷ是Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ经过凝胶渗透层

析法纯化的部分，分子量４一ｌＯｋｕ。Ｗｅｒｔｈ等【２６报道，Ｎ／Ｐ比值为３３或６６时，形成的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ呈完整的球形。当保存于１５０ｍｍｏｌ／Ｌ的氯化钠溶液时，粒径大小为１００～１５０ｎｍ，平均为１１７．２ｎｍ；当保存在５％葡萄糖溶液时，粒径大小为８０—１４０ｎｍ，平均为

８８．７

ｎｍ；低压冻干复苏后，粒径大小为５０—２００

ｎｍ，

平均９０ｎｍ。Ｈｏｂｅｌ等川报道，Ｎ／Ｐ比值为３０时，

ＰＥＩ

Ｆ２５．ＬＭＷ包裹的ｓｉＲＮＡ纳米粒大小为（４８．９±

平均最小为２５—７５ｎｍ，最大６０～１３０ｎｍ。由此可见，ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的表征与ＰＥＩ的结构和分子量关系密切。

ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的稳定性

Ｕｒｂａｎ—Ｋｌｅｉｎ等【１９Ｉ用商品化的低分子量Ｌ－ＰＥＩ

（ＪｅｔＰＥＩ）包裹３２Ｐ末端标记的ｓｉＲＮＡ，然后和ｌ％胎ｃａｌｆ

ｓｅｒｕｍ，ＦＣＳ）一起孵育。不同时间点

ｍｉｎ）几乎被血清中的ｍｉｎ时仍见了Ｂ．ＰＥＩ

８００ｋｕ、Ｂ．ＰＥＩ２５ｋｕ、ＰＥＩＦ２５．ＬＭＷ、Ｂ．ＰＥＩ

ｋｕ、Ｂ．ＰＥｌ０．８ｋｕ、ＪｅｔＰＥｌ对胶囊化ｓｉＲＮＡ的影响。

ｈ，凝胶电ｒａｉｎ内几８００

ｋｕ、Ｂ－ＰＥＩ２５ｋｕ、ＰＥＩＦ２５．ＬＭＷ、

ｍｉｎ以上，但Ｂ．ＰＥＩ８００ｋｕ

０．８

ｋｕ几乎不表达ｓｉＲＮＡ生物活性。作者

Ｆ２５一ＬＭＷ包裹的ｓｉＲＮＡ可ｈ后，生

作用与细胞表面结合并被细胞吞饮后形成内涵体，缓冲细胞内的低ｐＨ。其中的ＰＥＩ增强了水和质子体渗透性释放内容物释放到胞浆［ｓｌ。在胞浆内环境下，络合物中的核酸又从ＰＥｌ分子中游离出来，这个过程就是所谓的质子海绵假说（ｐｒｏｔｏｎ细胞内并发挥生物功能。

２２．１

９．７）ｎｍ者占８１．１７％、（９９．２±１２．１）ｎｍ者占１８．８３％；２．２

牛血清（ｆｅｔａｌ

进行琼脂糖凝胶电泳和免疫印迹定量定性检测．裸ｓｉＲＮＡ在最短的时间（１５ＲＮａｓｅ完全降解，而ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ在２４０代表ｓｉＲＮＡ分子全长的放射性条带，提示ＰＥＩ能有效保护ｓｉＲＮＡ分子的结构完整性。Ｗｅｒｔｈ等【珥研究ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）。通过这一过程，核酸从细胞外被递送到

２３２Ｐ末端标记的ｓｉＲＮＡ与ＦＣＳ一起孵育２泳和放射自显影照片显示：裸ｓｉＲＮＡ在１５乎全部降解．代表ｓｉＲＮＡ分子全长的放射性条带不再显示；而Ｂ－ＰＥＩＡＦＭ）能显示裸ｓｉＲＮＡ的双链条状结构，加入ＰＥＩ后双链条状结构消失，形成的络合物ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ呈球形和类球形纳米粒，表面光滑【悖一。Ｂｒｅｕｎｉｇ等Ｉ列用琼脂糖凝胶电泳的方法证实：不同的ＰＥＩ和ｓｉＲＮＡ所形成的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ在表征上存在差异。在研究了分子量为２５分子量为２．６的直链ＰＥＩ（Ｌ－ＰＥＩ）后发现：Ｂ．ＰＥＩ

ＪｅｔＰＥＩ包裹的ｓｉＲＮＡ中，有７０％ｓｉＲＮＡ都能够显示完整分子的时间长达１２０和Ｂ．ＰＥｌ

分析认为ＰＥＩ的分子量越大，胶囊化程度越充分，当到一定程度时，呈过度胶囊化状态，阻碍了ｓｉＲＮＡ

的释放；而分子量太小。拥有的正电荷数目有限．很

难和带负电荷的核酸相互作用，不足以形成对ｓｉＲＮＡ的有效保护。ＰＥＩ以在一２０℃低温下保存数月而无需特殊的佐剂。复苏后与人卵巢癌细胞ＳＫＯＶ．３共同孵育４８物更均匀，氮磷比值（Ｎ／Ｐ）为１２时，粒子的表面电荷呈阳性。Ｇｒａｙｓｏｎ等［２５１报道了分子量为０．８Ｂ．ＰＥＩ、分子量为２２

物活性几乎保持９０％以上。Ｇｒａｙｓｏｎ等【笛Ｉ报道，不同Ｎ／Ｐ比值、ｓｉＲＮＡ浓度与ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ络合物的稳定性有关，只有Ｎ／Ｐ比值在６。８以上、ｓｉＲＮＡ浓度在

２００

ｎｍｏｌ／Ｉ。时，Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ形成的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ纳米粒才能够保持稳定。

２．３

ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的细胞摄取

Ｕｒｂａｎ．Ｋｌｅｉｎ等【１９ｌ将荧光标记的ＪｅｔＰＥＩ包裹原

癌基因ＨＥＲ．２（ｎｅｕ／ｃ．ｅｒｂＢ．２）的ｓｉＲＮＡ，然后和ＳＫＯＶ．３细胞一起孵育。共聚焦激光显微镜方法观

察到，３０ｍｉｎ后整个细胞浆内有许多大的荧光点，持续９０—１２０

ｍｉｎ。２

ｈ后荧光明显减弱。这些荧光点代表ｓｉＲＮＡ／ＰＥｌ的胞饮囊泡。将稳定表达荧光素酶

的ＳＫＯＶ．３细胞与浓度分别为０．１、ｌ、１０ｐｍｏｌ／Ｌ的

ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ一起孵育．结果显示：浓度越高者细胞的荧光素酶表达水平越低，这种剂量依赖性的ｓｉＲＮＭＰＥＩ基因表达下调早在２４ｈ就能观察到，４８ｈ后达到高峰、持续数天。Ｂｒｅｕｎｉｇ等例用Ｂ—ＰＥＩ２５ｋｕ、ｓｓＰＥｌ和Ｌ－ＰＥＩ５ｋｕ３种结构的ＰＥｌ分别包裹针对增强绿色荧光蛋白的ｓｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ用绿色转染指

示剂ｓｉＧＬＯ作为荧光标记，ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ与中国仓鼠卵巢细胞哑株ＣＨＯ．Ｋｌ共同孵育５ｈ后，共聚焦激

光显微镜方法观察到：位于胞浆内或内涵体内的、呈斑点状离散分布的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ荧光．以及位于胞浆内、呈均匀分布的、从ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ中释放出来的、具有生物活性的ｓｉＲＮＡ荧光染色。３种ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ与ＣＨＯ．ＫＩ孵育４ｈ后。流式细胞仪观察到：随着Ｎ，Ｐ比值和聚合物浓度的增加，细胞摄取ｓｉＲＮⅣＰＥＩ增加。Ｎ／Ｐ相同时，３种ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ复合物中，随着ＰＥｌ分支的增加，细胞摄取能力逐渐增加，由高到低依次为Ｂ．ＰＥＩ

２５ｋｕ、ｓｓＰＥＩ、Ｌ－ＰＥＩ５ｋｕ。

２．４

ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的细胞毒性Ｇｒａｙｓｏｎ等闭研究了Ｂ—ＰＥｌ

０．８ｋｕ、Ｌ－ＰＥＩ２２ｋｕ、

Ｂ．ＰＥＩ２５ｋｕ

３种ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ对人宫颈癌细胞亚株

ＨＲ５一ＣＬＩｌ的毒性，３种ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ的半抑制浓度ＩＣ如分别为５０、３７、１９¨ｇ／ｍＬ，说明Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ的毒

性最大。Ｕｒｂａｎ．Ｋｌｅｉｎ等【１９ｌｉ丘过４８ｈ的细胞增殖实验证明：所用剂量的ＪｅｔＰＥＩ及胶囊化纳米粒对ＳＫＯＶ。３

细胞未产生生长抑制．无毒副作用。Ｂｉｅｂｅｒ等１２７研究

表明：低分子量ＰＥＩ体内外的毒性极低，具有高度的生物相容性和高转染率，是一种有效的载体。Ｍｏｇｈｉｍｉ等例报道．ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ的细胞毒性与ＰＥＩ的结构和分子量有关．分子量越低。细胞毒性越低。

３

ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的生物学表达Ｕｒｂａｎ．Ｋｌｅｉｎ等１１９１用ＪｅｔＰＥｌ包裹针对ＨＥＲ．２基

万方数据

因的ｓｉＲＮＡ，在血清存在的情况下，与ＳＫＯＶ．３细胞一起孵育。２４ｈ后ＨＥＲ．２的ｍＲＮＡ水平降低５０％。持续超过７２ｈ。Ｂｒｅｕｎｉｇ等１２４研究表明：Ｂ．ＰＥＩ２５ｋｕ、

ｓｓＰＥＩ和Ｌ—ＰＥＩ

５ｋｕ

３种结构的ＰＥｌ分别包裹针对

增强绿色荧光蛋白的ｓｉＲＮＡ，然后和ＣＨＯ．Ｋ１细胞一起孵育，ｓｉＲＮＡ的基因沉默效率分别为２５％、４５％；而Ｌ－ＰＥＩ

５

ｋｕ复合物的基因沉默效果极低。结

果还提示：ＰＥｌ分子中引入的二硫键结构有助于ｓｉＲＮＡ从ＰＥＩ胶囊中释放与生物学表达。裸鼠皮下建立的ＳＫＯＶ．３细胞肿瘤模利实验中发现：３０

ｍｉｎ

后，３２Ｐ标记的ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ在肿瘤组织的信号最强．持续３ｈ以上（凝胶电泳显示）。每４８—７２ｈ经腹腔注射ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ，ｌ周后肿瘤明显缩小，肿瘤内

ＨＥＲ．２的ｍＲＮＡ水平减低５０％以上。Ａｉｇｎｅｄ剪搬道，

ＰＥＩ包裹ＰＴＮ基因的ｓｉＲＮＡ，可明显降低ＦＩＮ表达，减缓人脑星形胶质母细胞瘤Ｕ８７的增殖。经裸鼠皮下或腹腔注射，明显抑制了Ｕ８７生长。

Ｗｅｒｔｈ等１２６Ｉ将稳定表达荧光素酶的ＳＫＯＶ．３细胞与ＰＥＩＦ２５．ＬＭＷ胶囊化的ｓｉＲＮＡ一起孵育４８ｈ，

细胞的荧光素酶表达下降８０％，而对照组则没有改

变。相比之下，Ｌ－ＰＥＩ

２２

ｋｕ胶囊化的ｓｉＲＮＡ效果则

明显依赖于ＦＣＳ浓度：２％ＦＣＳ条件下。细胞的荧光素酶表达下降高达８０％，５％、１０％的ＦＣＳ条件下，荧光素表达下降不明显。裸鼠皮下瘤模型中．经腹腔内给予ＰＥＩＦ２５．ＬＭＷ胶囊化的ｓｉＲＮＡ，肿瘤生长抑制明显。新鲜和冻存复苏的ＰＥＩＦ２５．ＬＭＷ胶囊化包裹针对人血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ

ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ

ｇｒｏｗｔｈ

ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）的ｓｉＲＮＡ，与人前列腺癌细胞

ＰＣ．３一起孵育，贴壁生长的细胞数量明显减少；酶联免疫吸附实验（ｅｎｚｙｍｅ．１ｉｎｋｅｄ

ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ

ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）检测显示。细胞分泌的ＶＥＧＦ下降５０％以上，提示新鲜和冻存复苏的ＰＥＩＦ２５一ＬＭＷ胶囊化ｓｉＲＮＡ都有良好的肿瘤抑制效果。

４

ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ对ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ纳米粒的

影响

ｓｉＲＮＡ双链的结构完整性高度影响所诱导的基因沉默效果ｍ１。根据修饰部位的结构改变程度，ｓｉＲＮＡ的生物功能不受影响Ⅲｊ或降低１０％一５０％１３２Ｉ。

Ｈａｒｂｏｒｔｈ等ｆ∞认为，化学修饰ｓｉＲＮＡ正义链的３’端

对ＲＮＡｉ的影响最小。

聚乙二醇化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）是聚乙二醇（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃ０１．ＰＥＧ）通过共价键修饰生物分子的过程例。ＰＥＧ本身是一种无毒性无免疫原性的聚合物，ＰＥＧ化可以改变生物分子的构象、表面电荷、疏水性等

垦匪尘塑堕堂兰矍盘查２Ｑ！！至！旦笙丝鲞笙！塑！！！』！也！型垦竖：坠！竺型！！！！：！堂：兰：塑！：！

物理特性。Ｌｅｅ等Ｉ站ｌ用分子量为５ｋｕ的甲氧ＰＥＧ（ｍｅｔｈｏｘｙ．ＰＥＧ删－ＳＨ，ｍＰＥＧ．ＳＨ）修饰人ＶＥＧＦ的

ｓｉＲＮＡ（序列为正义链５’．ＧＧＡＧＵＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＡＵＣｄＴｄＴ．３’。反义链５’．ＧＡＵＣＵＣＡＵＣＡＧＧＧＵＡＣＵＣＣｄＴｄＴ－３’）。形成ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ，即ｓｉＲＮＡ．ＰＥＧ；然后将ＲＮａｓｅＯＮＥＴＭ分别与裸ｓｉＲＮＡ和ｓｉＲＮＡ．ＰＥＧ一起孵育。凝胶电泳显示：１５ｍｉｎ后裸ｓｉＲＮＡ完全降解，而ｓｉＲＮＡ—ＰＥＧ则仍有４０％以上保持结构完整。Ｋｉｍ等【蚓用５０％ＦＣＳ分别与裸ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ—ＰＥＧ一起孵育。凝胶电泳显示：８ｈ后裸ｓｉＲＮＡ几乎完全降解。而ｓｉＲＮＡ—ＰＥＧ中的ｓｉＲＮＡ在１６ｈ时结构的完整性仍未受到明显影响。若用Ｂ．ＰＥＩ

２５ｋｕ

胶囊化该ｓｉＲＮＡ．ＰＥＧ形成ｓｉＲＮＡ—ＰＥＧ，ＰＥｌ，则４８ｈ后ｓｉＲＮＡ．ＰＥＧ／ＰＥＩ中的ｓｉＲＮＡ仍未检测到降解。将ＰＣ．３分别与ｓｉＲＮＡ／ＰＥｌ和ｓｉＲＮＡ．ＰＥＧ／ＰＥＩ一起孵育１６ｈ，在没有血清时，ＥＬＩＳＡ测得ＰＣ．３细胞分泌ＶＥＧＦ的蛋白量分别为２１．２ｐ∥ｍＬ和１４．６

ｐｇ／ｍＬ。

加入１０％ＦＣＳ后，２者ＰＣ．３细胞分泌的ＶＥＧＦ蛋白含量则分别为从２１．３ｐｇ，ｍＬ增加到９１．３ｐｇ／ｍＬ、从

１４．６

ｐｇ／ｍＬ增加到２５．９ｐｇ／ｍＬ，差别有极显著性意义，提示ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ能够明显提高ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ的基因沉默效果。该结果也得到半定量的逆转录ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ）的进一步证实。Ｋｉｍ等１２１ｔ建立了ＰＣ．３的裸鼠移植瘤模型。将ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ和ｓｉＲＮＡ．ＰＥＧ／ＰＥＩ肿瘤局部注射后３ｄ，用ＥＬＩＳＡ和ＲＴ—ＰＣＲ方法分别检测肿瘤细胞分泌的ＶＥＧＦ蛋白质和ｍＲＮＡ水平，结果显示：与对照组相比，后者的基因沉默效果下降７４．８％，ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ和ｓｉＲＮＡ．ＰＥＧ／ＰＥＩ２组的基因沉默效果差别有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。经尾静脉注射后。用ＥＬＩＳＡ方法检测并分别和对照组相比，ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ和ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧ／ＰＥＩ２组的ＶＥＧＦ表达分别下降到原来的（８６．４±３．６）％和（４３．０±１４．６）％。细胞水平和动物肿瘤模型实验都证明：ＰＥＧ化ｓｉＲＮＡ可以增强ＰＥＩ胶囊化ｓｉＲＮＡ的稳定性和生物活性。

ＰＥＩ共聚物胶囊化ｓｉＲＮＡ的研究进展５．１

ＰＥＧ－ＰＥＩ共聚物胶囊化ｓｉＲＮＡ

ＰＥＧ－ＰＥＩ共聚物，即ＰＥＧ化的ＰＥＩ。Ｍａｏ等Ｉ趋报

２５ｋｕ

Ｙ），Ｘ为ＰＥＧ的分２５

ｋｕ胶囊化的ｓｉＲＮＡ形成的纳米粒大小为

（１４４＋１２．２）ａｍ，表面电荷２２．３ｍＶ；而０．５５ｋｕｆ孙

万方数据

２ｋｕ㈣、５ｋｕ…２０

ｋｕｆ，邱Ｇ与ＰＥＩ接枝形成共聚物

后，胶囊化的ｓｉＲＮＡ形成的纳米粒大小分别为（４３４±５５＿５）、（１０２：ｅ４．９６）、（１１８±２４．１）、（１０９±３．８６）ｎｍ，表面电荷分别为负值、１５、１６、２０ｍＶ。研究发现，

０．１２

ｍｌＵ／Ｉｘｇ的ＲＮａｓｅ足以使裸ｓｉＲＮＡ完全降解，

但是ＰＥＧ分别为Ｏ．５５

ｋｕ（３０、２ｋｕｆｌ佛、５

ｋｕ…２０ｋｕｆＩｌ的

ＰＥＧ．ＰＥＩ共聚物与ｓｉＲＮＡ形成胶囊化纳米粒后，和浓度为６．０ｍｌＵ／ｌ山ｇ的ＲＮａｓｅ一起孵育３０ｍｉｎ，纳米粒中结构完整的ｓｉＲＮＡ剩余量分别为几乎Ｏ％、３２％、６８％、９２％，而单纯Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ者，剩余量为

９％。提示ＰＥＧ．ＰＥＩ共聚物可以明显增强胶囊化ｓｉＲＮＡ的稳定性。共聚物胶囊化的ｓｉＲＮＡ和稳定表达Ｂ牛乳糖的成纤维细胞ＨＩＨ３Ｔ３一起孵育，结果显示：共聚物胶囊化的ｓｉＲＮＡ均较单纯的ＰＥＩ胶囊化的ｓｉＲＮＡ基因沉默效果明显提高，提示ＰＥＧ．ＰＥＩ共聚物可以增强胶囊化ｓｉＲＮＡ的生物活性。Ｋａｂａｎｏｖ

等Ｉ似为，胶囊化的ｓｉＲＮＡ之所以得到有效保护和

稳定的粒径，可能的原因是ｓｉＲＮＡ被包埋在聚合阳离子的核心部位，亲水聚合物链朝向周围的水溶性环境，形成了亲水性的外壳。Ｍａｏ等Ｉ∞Ｉ报道的ＰＥＧ－ＰＥＩ共聚物胶囊化ｓｉＲＮＡ的稳定性增加，支持这些核心一壳结构的假说：ｓｉＲＮＡ包裹在阳离子的核心中间，周围环绕着亲水的ＰＥＧ壳。在水溶液中，ＰＥＧ是一种高度水溶性的聚合物，分子片段有高度的灵活性，能够影响水分子层的结构，产生明显的构象变化，造成一定的排他性空间。亲水性聚合物ＰＥＧ的亲水链构成的毛刷状构象（ｂｒｕｓｈｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）形成了分子动态云（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ

ｄｙｎａｍｉｃ

ｃｌｏｕｄ）样的立体障

碍．同时每个ＰＥＩ片段的灵活自由旋转，都能够阻止蛋白在纳米粒表面的吸附。

５．２

ＡＰＰ共聚物胶囊化ｓｉＲＮＡ

最近Ｎｉｍｅｓｈ等Ｉ埔Ｊ报道了丙酸酐酰化的ＰＥＩ

（ａｃｙｌａｔｉｎｇＰＥｌｗｉｔｈｐｍｐｉｏｎｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ）交联二磷酸

化ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃ０１．ｂｉｓ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ”对ｓｉＲＮＡ的影响。通过计算得到伯胺和仲胺３０％丙酸酐酰化的Ｂ—ＰＥＩ

７５０

ｋｕ，然后和ＰＥＧ二磷酸盐交联（ＰＥＧ

８

ｋｕ．ｂｉｓ—Ｐ）。形成ＰＥＩ的丙酸酐酰化交联共聚物

ＡＰＰ。接触式ＡＦＭ方法显示，ＡＰＰ呈紧密的球形，平均粒径１００ｏｍ；三维图像显示，２ｈ后无明显凝集，粒子均匀分布。水溶液中，动态光散射方法测得粒径大小为ｌ

ＩＯ

ｎｍ。单纯ＡＰＰ的表面电荷为２２．７

ｍＶ，

与ｓｉＲＮＡ结合后表面电荷为１８．５ｍＶ，在１０％血清中表面电荷为一２４．８ｍＶ。针对绿色荧光蛋白基因的

ｓｉＲＮＡ分别与ＡＰＰ、商品化的Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ形成ＡＰＰ－

ｓｉＲＮＡ、Ｌｉｐｏｆｅｅｆｉｎ—ｓｉＲＮＡ复合物后，与人胚胎肾

５．

道了不同分子量的ＰＥＧ和植入密度对Ｂ．ＰＥＩ

胶囊化能力的影响。ＰＥＧ．ＰＥＩ共聚物中，ＰＥＧ占５０％（４０％～６０％），表示为ＰＥＧ）（ｆ子量，Ｙ为ＰＥＧ的植入密度。ＡＦＭ显示：单纯＆

ＰＥＩ

圉昼生塑匿堂王塑盘查２Ｑ！！生呈旦堑丝堂笙！塑！！！』！ｉ！巴型垦！ｇ。曼！型！ｇ垫！！。！Ｑ！：≥！：№：！

ＨＥＫ２９３细胞一起孵育，４８ｈ后倒置荧光显微镜定性分析基因沉默效果，用标准化的绿色荧光强度值定量测定ＨＥＫ２９３细胞所表达的绿色荧光蛋白的相对水平，结果显示ＡＰＰ．ｓｉＲＮＡ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ．ｓｉＲＮＡ的基因沉默分别为８３％、８１％。进一步的流式细胞测定，２者的基因沉默效率分别为８５％和８０％。Ｍ１Ｔｒ比色测定细胞毒性，裸ｓｉＲＮＡ、ＡＰＰ．ｓｉＲＮＡ、

Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ ｓｉＲＮＡ、Ｂ－ＰＥＩ７５０

ｋｕ－ｓｉＲＮＡ与ＨＥＫ２９３共同孵育４８ｈ后，活细胞数分别为９０％、８４％、６０％、５１％。可见ＡＰＰ—ｓｉＲＮＡ的基因沉默效果和商品化的Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ相似，不过细胞毒性明显降低。

ＰＬＧＡ．ＰＥＩ共聚物胶囊化ｓｉＲＮＡ

ＰＬＧＡ是２种不同的单体乙醇酸（ｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ）

和乳酸（１ａｃｔｉｃａｃｉｄ）在催化剂作用下随机开环，通过共聚反应，一系列的单体结构单元以酯腱相互连接成线性、无定形的聚酯产物，它的大小、形态和∈电位可以通过合成方法的参数调整得到控制［３８１。ＰＬＧＡ呈胶态，典型的ＰＬＧＡ粒径大小１０—１

０００

ｎｍ，可以

吸附、化学偶联在其他聚合物的表面，也可以包裹

或吞饮治疗药物。ＰＬＧＡ在体内水性环境中，酯腱被水解，变成最初始的乳酸和乙醇酸单体，而乳酸和乙醇酸是机体在生理状态下新陈代谢的产物０９Ｉ。因此ＰＬＧＡ是生物可降解的聚合物。与脂质体ｌｉｐｏｓｏｍｅ和脂质囊泡相比，ＰＬＧＡ在体液中稳定性高，不易被酶解代谢，能够穿透毛细血管进入组织深层，能够被细胞有效摄取，同时还可以持续数天至数周缓慢释放携带的治疗药物ｆ４０１。因此，将ＰＬＧＡ作为载体递送基因．具有十分明显的优势，但是基

因的包裹、转染和表达效果低。

Ｐａｔｉｌ等Ⅲｌ报道，双链寡核苷酸（ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ。ｏｌｉｇｓ）含２０个碱基对，基因序列为正义链５－ＣＣＡＴＣＣＣＧＡＣＣＴＣＧＣＧＣＴＣＣ．３。反义链３＿－ＧＧＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧ．５，作为ｓｉＲＮＡ模型。用分子量为４０

ｋｕ

的ＰＬＧＡ（５０：５０）胶囊化包裹ｏｌｉｇｓ．最大包裹率为将Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ与ＰＬＧＡ

４０

ｋｕ（５０：５０）通过双乳化溶

媒蒸发技术将ＰＥｌ分子插入ＰＬＧＡ的基质内，制备成ＰＬＧＡ．ＰＥＩ共聚物ＰＩ上Ａ．４０Ｋ．ＰＥＩ，然后胶囊化包裹针对荧光素酶的ｓｉＲＮＡ。结果显示：ｓｉＲＮＡ的胶囊化包裹率为（８６＋４）％，所形成的ＰＩ。ＧＡ．４０Ｋ．ｓｉＲＮＡ．ＰＥＩ纳米粒径为２３０—２７０ａｍ，‘电位一１８—１５

ｍＶ。

和乳腺癌细胞系ＭＤＡ．ＭＢ．４５３的哑系ＭＤＡ．Ｋｂ２细胞一起孵育３０ｍｉｎ，共聚物的细胞摄取率是单纯ＰＬＧＡ的２倍多．２４ｈ内ｓｉＲＮＡ的爆破释放占３０％。

１５

ｄ内ｓｉＲＮＡ缓慢持续释放达到７０％。共聚物纳米

万方数据

粒与鼠乳腺癌细胞ＥＭＴ．６Ｇ／Ｌ和ＭＤＡ．Ｋｂ２细胞一起孵育２４ｈ和７２ｈ。并和对照组相比。癌细胞的荧光索酶表达明显降低，效果持续超过３ｄ。４．５．二甲基噻唑．３．羧基甲氧基苯．４．磺苯基．２Ｈ．四唑盐（ＭＴＳ）方法检测证实，所用剂量范围的共聚物无细胞毒性。Ｋａｔａｓ等１１５Ｉ用自动乳化扩散法制备成ＰＬＧＡ纳米粒，然后表面吸附Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ。因为ＰＬＧＡ分

子末端的羧基团容易与Ｂ．ＰＥＩ的胺基团通过静电相互作用而结合。所形成的ＰＬＧＡ．ＰＥＩ共聚物粒径大小为（９７±２）一（１１７±５）ｎｍ，其表面电荷为（２９．４±０．７）一（３４．７±１．０）ｍＶ；当Ｎ／Ｐ比值为２０时，共聚物能够完全包裹针对ｐＧＬ３荧光素酶的ｓｉＲＮＡ（基因序列正义链５＿－ＣＵＵ

ＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＴＴ．．一，

反义链３＿－ＴＹＧＡＡＵ

ＧＣＧＡＣＵＣＡＵＧＡＡＧＣＵ．５

ｏ

ＰＬＧＡ．ＰＥＩ聚合物包裹的ｓｉＲＮＡ和ＨＥＫ．２９３细胞一起孵育２４ｈ，基因沉默效率高达８７％～９９％，而ｓｉＲＮＡ／ＰＥＩ的基因沉默效率为２９％（Ｎ／Ｐ＝１０），２者差别有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；而且聚合物的基因沉默效果明显优于商品化的制剂Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅ２０００。２者的差别有统计学意义（Ｐ＜０．０５ｏ但是，ＰＬＧＡ．ＰＥＩ聚合物包裹的ｓｉＲＮＡ和ＣＨＯ—ＫＩ一起孵育，只观察到１５％．５４％的基因沉默效果，说明ＰＬＧＡ．ＰＥＩ共聚物包裹的ｓｉＲＮＡ所诱导的基因沉默具有细胞种属的差异。甲基噻唑基四唑（ｍｅｔｈｙｌ

ｔｈｉａｚｏｌｙｌ

ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，Ｍ１Ｔｒ）细胞毒性试验表明：２种

细胞系和ＰＬＧＡ—ＰＥＩ共聚物一起９呼育２４ｈ，活细胞

死亡约１５％～２５％，呈相对的细胞低毒性。Ｍｕｒａｔａ等４１Ｉ

用双乳化干燥法制备分子量为１４．４ｋｕ的ＰＬＧＡ（７５：２５）与Ｂ．ＰＥＩ

２５

ｋｕ共聚物，包裹针对鼠ＶＥＧＦ

的ｓｉＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ的基因序列正义链５’．ＣＧＡ

ＵＧＡ

ＡＧＣＣＣＵＧＧＡＧＵＧＣ

ｄＴｄＴ．３’，反义链５’．ＧＣＡ

ＣＵＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＡＵＣＧ

ｄＴｄＴ－３’。扫描电镜显示

ＰＬＧＡ的粒径大小为３５４５斗ｍ，ＰＬＧＡ对ｓｉＲＮＡ的包裹率为４８．６％。而ＰＬＧＡ．ＰＥＩ共聚物的包裹率为８０．３％。磷酸盐缓冲液释放实验表明：ＰＬＧＡ和ＰＬＧＡ．ＰＥＩ在最初爆破释放２０％一３０％包裹的ｓｉＲＮＡ后．均町缓慢持续释放ｓｉＲＮＡ长达２８ｄ之久；但后者的爆破释放以及后来的持续释放速度呈降低趋势，提示ＰＥ！共聚物可以起到长效释放ｓｉＲＮＡ的作用。扫描电镜还显示了缓慢释放ｓｉＲＮＡ过程中ＰＬＧＡ逐渐从形变到分解的形态学变化过程。与小

鼠腹水肉瘤细胞Ｓ．１８０一起孵育１２ｈ，ＥＬＩＳＡ检测

显示，２种载体作用下细胞分泌的ＶＥＧＦ的抑制率分别为７４．８％±５．５％和６３．２％±８．４％。Ｓ．１８０细胞雌鼠皮下移植瘤模型实验表明。６ｄ以内．对照组的肿

５．３

４３％。为了提高ｓｉＲＮＡ的胶囊化包裹效果，Ｐａｔｉｌ等１１４１

４８

垦匪生丝医堂墨矍壅查！Ｑ！！生！旦箜丝鲞笙！塑！坐！！也趔垦韭：＆地垫！！：！型：丝盟！：！

瘤体积增加明显，２组ｓｉＲＮＡ的肿瘤体积增加明显抑制。直到２２ｄ，就肿瘤体积而言。对照组较２组ｓｉＲＮＡ者明显增加，ＰＬＧＡ－ＰＥＩ组约为ＰＬＧＡ组的协，约为对照组的１１１０。６展望

ＰＥｌ胶囊化包裹ｓｉＲＮＡ的能力依赖于分子量、分支程度、Ｎ／Ｐ值等，分子量高者胶囊化效能更强，但细胞毒性也增加，释放ｓｉＮＲＡ时阻力相应增加。

ＰＥＩ

ＦＭ２５．ＬＭＷ胶囊化ｓｉＲＮＡ的细胞毒性低，可长

期冷冻保存，复苏后能保持ｓｉＲＮＡ的生物活性，使用方便。添加佐剂后形成的共聚物能够增强ｓｉＲＮＡ

的稳定性和生物活性，降低细胞毒性。相信随着研

究的不断深入，更加高效、低毒或无毒型的ＰＥＩ共聚物会成为理想的ｓｉＲＮＡ载体。理想ｓｉＲＮＡ载体应

符合以下条件：①生物相容性和可降解性。②无细胞毒性。③靶向性。④胶囊化的ｓｉＲＮＡ性能稳定。⑤能够释放出有完全生物活性的ｓｉＲＮＡ。

参

考

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４９

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【３６】ＫｉｍＳＨ．ＪｅｏｎｇＪＨ，ＬｅｅＳＨ．ｅｔａ１．ＰＥＧｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＶＥＧＦｓｉＲＮＡｆｏｒ

ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ

１２９．

ｇｅｎｅ

ｆＪＪ．ＪＭｅｄＣｈｅｍ，２００５，４８（１３）：４２４７．４２５３．【３１１ＣｈｉｕＹＬ，ＲａｎａＴＭ．ＲＮＡｉ

ｉｎ

ｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．ＪＣａｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ，２００６，ｌ１６（２）：１２３一

ｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ：ｂａｓｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄ

ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ５４９．５６１．

ＲＮＡ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌ．２００２，１０（３）：ａ１．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅｆｏｒ

【３７１Ｋｓ＿ｂａｎｏｖＶＡ．ＫａｂａｎｏｖＡＶ．Ｉｎｔｅｒｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅａｎｄｂｌｏｃｋ

ｃｏｍｐｌｅｘｅｓｆｏｒ

ｇｅｎｅ

ｉｏｎｏｍｅｒ

ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｐｈｙｓｉｃｏ－ｃｈｅｍｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓ［ｊ］．ＡｄｖＤｒｕｇ

【３２】Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ

３

Ｍ．ＨｏｌｅｎＴ’ＢａｂａｉｅＥ，ｅｔ

ｉｎ

ａ

ｍｕｔａｔｉｏｎｓ

ＤｅｌｉｖＲｅｖ，１９９８，３０（１－３）：４９—６０．

ａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ

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ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｐｏｌｙｌａｃｔｉｃａｃｉｄ／

ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃａｃｉｄ

ｌ（２）：５８９—５９５．

ｏｆｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡｓａｎｄｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎ

【３３】ＨａｒｂｏｒｔｈＪ，ＥｌｂａｓｈｉｒＳＭ．ＶａｎｄｅｎｂｕｒｇｈＫ，ｅｔａ１．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｃｈｅｍｉｃａｌ．

ａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ

ｖａｒｉａｔｉｏｎ

ＲＮＡｓａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｎｍａｍｍａｌｉａｎｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＮｕｃｌｅｉｃ

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ｏｆＰＩ正；Ａ－ｂａｓｅｄｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｉｏｇｙ

【４０】ＬＵＪｉａｎ ｍｉｎｇ，ＷａｎｇＸｉｎ ｗｅｎ．Ｍａｔｉｎ—ＭｕｌｌｅｒＣ．ｅｔａ１．Ｃｕｒｒｅｎｔａｄｖａｎｃｃ％

ｏｆ

ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ

ｏｎ

【３４】ＶｅｒｏｎａｓｅＦＭ，ＭｅｒｅＡ．ｎｅ

ｉｍｐａｃｔ

ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌ

ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ

ｔｈｅｒａｐｉ叫ｊ１．ＢｉｏＤｒｕｇｓ，２００８，２２（Ｓ）：３１５ ３２９．

【３５１ＬｅｅＳＨ．ＫｉｍＳＨ，ＰａｒｋＴＧ．ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉＲＮＡｄｅｌｉｖｅｒｙ

ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｃｏｍｐｌｅｘｍｉｃｅｌｌｅｓ

ＩＪｌ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＭｏｌＤｉａｇｎ．２００９．９（４）：３２５ ３４１．

ｓｙｓｔｅｍｕｓｉｎｇ

ｐｍ删ｆｒｏｍ

【４ｌｌＭｕｒａｔａＮ，ＴａｋａｓｈｉｍａＹ．ＴｏｙｏｓｈｉｍａＫ，ｅｔａ１．Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒｅｆｆｅｃｔｓｏｆ

ａｎｔｉ—ＶＥＧＦｓｉＲＮＡｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄｗｉｔｈＰＬＧＡｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓＪＣｏｎｔｒｏｌ

ｉｎ

ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ—ＰＥＧ

ｍｉｃｅ｛Ｊ１．

ｃｏｎｊｕｇａｔｅａｎｄ

ｃａｔｉｏｎｉｃ

ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ

ｐｅｐｔｉｄｅ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓ

Ｒｅｌｅａｓｅ，２００８，１２６（３）：２４６ ２５４．

（收稿１３期：２０ｌＯ．０９．１２）

Ｃｏｍｍｕｎ。２００ｒ７．３５７（２）：５Ｉｌ－５１６．

（上接第３３页）

较低的温度下在碱性介质中与氯乙酸进行反应将羧甲基引入在壳聚糖的Ｏ位Ｉ乳ＩＯｌ，但在上述反应条

胀．５０％ＮａＯＨ

３０

ｍＬ于一１０℃碱化１２ｈ，氯乙酸／甲

壳素（摩尔比）＝４．５，在５０℃反应４ｈ．脱乙酰化在９０℃下反应１．５ｈ，反应时加入少量硼氢化钠。

通过上述方法可以得到３种水溶性良好的羧甲基壳聚糖，为以后更深一步的研究提供了科研基础和实验依据。

参

考

文

件下仍会有少量Ｎ．位羧甲基壳聚糖产物，特别是为

了获得具有较高取代度的产物或反应时间较长时Ｎ位产物的出现会较明显。笔者根据文献ｆｌｌ】提出的方法：利用甲壳素Ｃ：位上的乙酰基保护Ｎ上的Ｈ不被氯乙酸中的羧甲基所取代，采用先取代再脱乙

献

酰的方法，制取了单纯的Ｃ。位０上取代的ＣＭＣ。实

验发现：强碱条件下，提高氯乙酸的量有利于取代的进行。甲壳素在５０％ＮａＯＨ和１００℃水浴条件下反应Ｉ一２ｈ脱乙酰度能达７５％。为了防止分子主链发生断裂．加入少量硼氢化钠以保护．避免了提高碱

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ＭｕｚｚａｒｅｉｌｉＲＡ．１ｉａｒ／Ｐ．ＰｅｔｒａｍｌｏＭ．Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙａｎｄ

ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ

浓度和温度而造成壳聚糖分子的降解；但加入硼氢

化钠不能过多，否则不利于脱乙酰反应的进行。４结论

Ｎ，Ｏ．ＣＭＣ制备的最佳工艺过程：壳聚糖５ｇ，异丙醇溶胀，１０

ｍｏｌ／Ｌ

ＮａＯＨ溶液６２．５ｍＬ在一ｌＯ℃碱

化１２ｈ．氯乙酸／壳聚糖（ｍｏｌ／ｍ０１）＝６：ｌ，反应温度为６０℃，反应时间为５

ｈ。

ｏｆＮ

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２０００．３０（３）：１０－１１．

（收编日期：２０１０－０９－０２）

Ｎ．ＣＭＣ制备的最佳工艺过程：乙醛酸，壳聚糖

（摩尔比）＝１．２，常温（２０．４０℃）反应２ｈ．调节体系ｐＨ值为８一ｌＯ，分批加入１０％硼氢化钠常温（２０－４０℃）反应２ｈ。

Ｏ．ＣＭＣ制备的最佳Ｔ艺过程：甲壳素异丙醇溶

万方数据

PEI及其共聚物的胶囊化siRNA在肿瘤基因治疗中的研究进展

作者：作者单位：

史秋生， 段友容， 杜联芳， SHI Qiu-sheng， DUAN You-rong， DU Lian-fang

史秋生,杜联芳,SHI Qiu-sheng,DU Lian-fang(上海交通大学附属第一人民医院超声科分子影像研究室,200080)， 段友容,DUAN You-rong(上海交通大学肿瘤研究所药物递送研究室,200032)

国际生物医学工程杂志

INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOMEDICAL ENGINEERING2011,34(1)

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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本文链接：/Periodical_gwyx-swyxgc201101011.aspx

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/c26e.html