银杏酮酯联合芹菜素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响_史婷婷

50mg/kgand100mg/kgflavonoidsfromCuscutachinensisandNimodipinegroup（12mg/kg）．Cerebralischemia-reperfusioninjurymodel

ofmiddlecerebralarteryocclusionwasinducedbythreadocclusionmethodofinternalcarotid．NeurologicalfunctuiondeficitswereevaluatedbyLongatestscale．UsingTUNELtodetectapoptosis．TheproteinexpressionofBcl-2andBaxweremeasuredbyimmunohistochemistry，the

ratiosofBcl-2andBaxwerecalculated．Theexpressionsofcaspase-3proteinweredeterminedbyWesternblotting．Ｒesults：Comparedwith

modelgroup，neurologicaldeficiencyscoreswerelowerandthedegreeofapoptosiswaslessenedinthegroupofflavonoidsfromCuscuta

andmostsignificantlyin100mg/kggroup．TheexpressionofBcl-2wasincreasedandBaxwasdecreased．Theexpressionofchinensis，

Caspase-3proteinwasdecreased．Conclusion：FlavonoidsfromCuscutachinensiscouldprotectcerebralischemiareperfusioninjurybyde-creasingtheproteinexpressionofBaxandCaspase-3andincreasingtheproteinexpressionofBcl-2toinhibitcellapoptosis．

KeywordsflavonoidsfromCuscutachinensis（菟丝子黄酮）；cerebralischemia-reperfusion；Bcl-2；Bax；Caspase-3

银杏酮酯联合芹菜素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

史婷婷，庄让笑，周红萍，王福根，方红英，邵益丹，蔡兆斌＊＊（浙江中医药大学附属杭州市西溪医院，杭州310023）

*

GBE50）联合芹菜素（apigenin）预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的目的：探讨银杏酮酯（ginkgobilobaextract50，

Dawley（SD）大鼠50只随机分为正常组、选用Sprague-模型组、银杏酮酯组、保护作用。方法：建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，

MB）、芹菜素组、银杏酮酯联合芹菜素组，均按照100mg/kg灌胃。检测血浆丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶（CK-肌钙蛋白T（cT-nT）、肌酸激酶（CK）和心脏组织超氧化物歧化酶（SOD）和白介素-6（IL-6）变化。同时，取心脏组织HE染色，观察心肌组织的病CK-MB、cTnT、CK、IL-6水平和升高SOD水理变化。结果：与模型组相比，银杏酮酯组100mg/kg、芹菜素组100mg/kg能降低MDA、

CK-MB、cTnT、CK、IL-6芹菜素组100mg/kg相比，银杏酮酯联合芹菜素组100mg/kg能显著降低MDA、平；与银杏酮酯组100mg/kg、

水平和升高SOD水平；与模型组相比，银杏酮酯组100mg/kg、芹菜素组100mg/kg能减轻心肌组织损伤的病理学变化；与银杏酮酯

组100mg/kg、芹菜素组100mg/kg相比，银杏酮酯联合芹菜素组100mg/kg能显著减轻心肌组织损伤的病理学变化。结论：与银杏酮酯100mg/kg、芹菜素100mg/kg相比，银杏酮酯联合芹菜素100mg/kg对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，这可能与提高心脏组织中SOD水平和降低心脏组织中IL-6水平有关。

关键词银杏酮酯；芹菜素；心肌损伤；缺血再灌注损伤DOI:10.13412/ki.zyyl.2014.05.026

在保护心肌缺血再灌注损伤的研究中，心肌缺血预适应（IPC）的心肌保护作用尤其引人注目，IPC能显著减轻长时间心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血预适应的机制与内源性心脏保

［1］

护物质的释放以及膜受体信号转导通路有关。但实行缺血预适应涉及医学伦理学和临床上较难操作等诸多原因，难以在临床推广使用。所以许多学者在积极探索应用药物以刺激缺以达到血预适应相关的内源性物质和相关细胞信号转导通路，

［2］

缺血预适应相似或者更好的疗效。黄酮具有多种药理作用，其中包括：抗氧化作用、消炎作用、抗癌和抗基因诱变作用，因

本实验采用黄酮类药物银杏酮酯联合芹菜素预处理对大鼠此，

心肌缺血再灌注的影响及其与单独用药的比较，从而寻找防治

尤其是对其有心肌缺血再灌注损伤的安全有效合理用药方案，效成分进行药效学及作用机制的研究。

采用同银杏酮酯的的方法将芹菜素、银杏酮酯联合芹菜素均稀释成100mg/kg的混悬液备用。1．2

动物

雄性SD大鼠50只，体重：230±20g，由浙江省医学

20080033。科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK浙-实验期间给予固体饲料，自由饮水。实验前禁食不禁水。1．3

试剂

丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒

肌钙蛋白T试剂盒购自Boeh-购自南京建成生物工程研究所，

rigerMannheim公司，白介素-6（IL-6）检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，羧甲基纤维素钠盐（国药集团化学试剂有限公司）。1．4

仪器

PowerLab生物信号采集分析系统（澳大利亚埃德

仪器国际贸易有限公司）；ＲM2145切片机（德国Lico公司）；

＊＊

摘要

自陕西慧科植物开发有限公司（98%），高效液相图谱。

1

1．1

材料与方法

试验药物银杏酮酯购自上海杏灵科技药业股份有限公

司，批号：111002，其溶液配制方法：加银杏酮酯于研钵，加入

1%羧甲基纤维素钠溶液（1%CMC），边加边研磨，直到分散均

最后稀释成浓度分别为100mg/kg的混悬液备用。芹菜素购匀，

*

课题资助：杭州市科技发展计划项目（20130633B09），浙江省中医药科技计划项目（2012ZA109）通讯作者

1．5．3

SOD和IL-6检测取大鼠心脏组织加适量生理盐水

制成组织匀浆。采用化学比色法测定SOD，采用酶联免疫法测操作过程中严格按照试剂盒说明书。定IL-6，

SZX-ILLB200解剖显微镜（日本Olympus公司）；InnovalU570型

超低温冰箱（AmericanNewBrunswickScientificCompany）。1．5

方法大鼠以25%乌拉坦腹腔注射麻醉后，气管插管，连接、开启人工呼吸机；颈动脉插管，连接换能器生物机能实

连续监测标准Ⅱ导联心电图和血压；开胸，剪开心包膜，验系统，

在左冠状动脉下穿线，打结为缺血，松开为再灌。造模前15

天连续灌胃给药，正常组与模型组每天以1%羧甲基纤维素钠溶液100mg/kg灌胃，银杏酮酯组、芹菜素组和银杏酮酯联合芹菜素组分别以GBE50混悬液、芹菜素混悬液和GBE50联合芹持续2周，末次给药30菜素混悬液每天按照100mg/kg灌胃，min后进行手术。1．5．11．5．2

心肌组织病理学分析

织病理性损伤改变。

包埋切片后HE染色观察其组

［3］

2

2．1

结果

心肌组织病理学改变取各组大鼠心肌组织常规甲醛固

定、石蜡包埋、切片、脱水和HE染色，光镜下观察。正常组，心肌纤维完整，排列整齐，结构清楚呈束状，细胞核形态正常，膜完

心肌间质未见炎性细胞浸润。模型组，心整无水肿无变性坏死，

肌纤维着色不均匀排列紊乱，心肌纤维部分断裂，心肌细胞呈坏死区域呈红染状态界线不清，细胞核浓缩、破现大片状坏死，裂、溶解和消失现象，间质水肿，可见大量炎性细胞浸润。银杏酮酯联合芹菜素组，心肌纤维相对完整，排列比较整齐，着色相

心肌肌束间隙相对增宽，心肌纤维呈轻微的波浪样改对均匀，

变，间质轻度水肿，极少部分细胞核有浓缩、溶解现象，少量炎性

细胞浸润，结果如图1所示。

CK-MB、MDA、cTnT检测实验结束后，收集血清CK、

大鼠血液静置后离心，分离血清。采用BECKMAN-LＲ20型全自动生化分析仪测定血清CK和CK-MB；采用化学比色法测定MDA，采用酶联免疫法测定cTnT，操作过程中严格按照试剂盒说明书。

图1各组大鼠缺血再灌注损伤心脏组织的苏木精-伊红染色法染色（200×）

2．2银杏酮酯联合芹菜素对大鼠缺血再灌注损伤血清CK、

10）

表2银杏酮酯联合芹菜素100mg/kg对大鼠缺血再灌注损伤心脏

CK-MB、MDA和cTnT的影响：与正常组相比，模型组大鼠CK、CK-MB、MDA和cTnT的水平明显升高；与模型组相比，银杏酮CK-MB、MDA和cTnT的水平显著降低，酯联合芹菜素组CK、但仍然高于正常组；与银杏酮酯组100mg/kg和芹菜素组100mg/kg相比，CK-MB、MDA和银杏酮酯联合芹菜素组100mg/kgCK、cTnT的水平降低，结果见表1。

表1

银杏酮酯联合芹菜素100mg/kg对大鼠缺血再灌注损伤血清

剂量（mg/kg）

100100100100100

肌酸激酶

肌酸激酶同工酶

肌钙蛋白

丙二醛

±s，n=组织匀浆中超氧化物歧化酶含量和、白介素-6浓度的影响（x珋

剂量（mg/kg）

100100100100100

超氧化物歧化酶（nmol/L）

18．12±1．06＊＊10．96±1．1414．41±2．47*13．47±2．78*15．77±1．58*

白介素-6（pg/g）

201．1±12．7＊＊366．5±26．5288．4±25．8*280．3±24．3*264．5±34．9*

组别

正常对照模型对照银杏酮酯芹菜素

银杏酮酯+芹菜素

±s，n=10）肌酸激酶同工酶、丙二醛和肌钙蛋白T的影响（x珋肌酸激酶、

组别正常对照模型对照银杏酮酯芹菜素银杏酮酯+芹菜素

（iu/L）（iu/L）T（μg/L）（μmol/L）

189±52．2＊＊29．1±12．5＊＊0．05±0．02＊＊7．34±0．64＊＊3454±43．12943±96．5*2935±36．8*2783±31．5*

356．5±31．5251．4±42．8*250．3±25．3*245．5±35．9*

0．28±0．050．21±0．03*0．20±0．07*0．13±0．06*

14．27±1．0912．45±0．96*11．67±1．14*9．43±1．45*

3讨论

冠心病发病率呈逐年上升，当前在各类心血管疾病中位居

首位，在人口死亡原因中位居第二位。根据世界卫生组织的研究报告：冠心病即将成为2020年世界上的发病率和死亡率均位

［4］

居第一的疾病，即将成为全球医疗健康事业的首要负担。溶栓、冠状动脉旁路移植术和经皮冠状动脉介入治疗等再灌注疗

与模型组比较*P＜0．05，＊＊P＜0．01（下同）

2．3银杏酮酯联合芹菜素组对大鼠缺血再灌注损伤心脏组织

与正常组相比，模型组大鼠心脏组

IL-6的影响匀浆中SOD、

IL-6浓度明显升高；与模型组相织匀浆中SOD含量明显降低，

比，银杏酮酯联合芹菜素组大鼠心脏组织匀浆中SOD含量明显IL-6浓度明显降低，升高，但是仍低于正常组水平，但是仍高于正常组浓度，与银杏酮酯组100mg/kg和芹菜素组100mg/kg相SOD含量明显升高和IL-比，银杏酮酯联合芹菜素组100mg/kg，6浓度明显降低，具有统计学意义，见表2。

法通过恢复血供能有效地挽救缺血心肌组织、减少心肌梗死面积和降低住院病死率，是当前治疗心肌缺血和梗死的最有效措施之一。但是大量的相关研究表明，经历一定时间缺血后心肌组织再恢复血供时可能出现心肌缺血性损伤进一步加重的现象，这种现象被称为缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/Ｒ）损伤。本课题通过药物预处理方法，调动机体内源性保护机制来防治心肌缺血再灌注损伤一直是我们临床研究的重要课题。到目前为止，多种动物（犬、兔和大鼠等）的在体心脏或离体心

肌细胞的实验都证实了一些药物预处理均具有保护心脏缺血再灌注损伤的作用。

银杏酮酯（GBE50）是我国自主研发的一种新型银杏叶提取物制剂，其主要成分为银杏黄酮和银杏内酯，有效成分为：黄含量≥44%；黄酮苷7种，如槲皮素（querce-酮类化合物35种，

tin）、异鼠李素（isorhannetin）、山柰素（kaempferol）等；黄酮酯17种，B（2b）、C（2c）、银杏总内酯≥6%，包括银杏内酯A（2a）、

［5］D（2d）、白果内酯。前期实验证实，银杏酮酯预处理具有抗心肌缺血再灌注损伤，保护心功能的作用，其作用机制可能与抗

合用药可能是抗心脏缺血再灌注损伤的最佳方案之一，本课题

将进一步研究其联合用药的副作用的情况，为临床寻求最佳诊疗方案提供理论基础。

参考文献

1

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包怡敏，刘爱华，张志雄，等．银杏酮酯（GBE50）与丹参预处理对

抗炎症反应和调节心肌内分泌因子稳态等有氧化应激、

5，7-5，7-3-关。芹菜素又称芹黄素，化学名4＇，三羟基黄酮（4＇，trihydroxyflavone），属于黄酮类化合物。黄酮类化合物广泛存在

［9］

于食用蔬菜，水果和中药植物中，是天然抗氧化剂。大量的芹菜素具有扩张血管、调节血压、调节血脂、保护血管内皮细胞和改善血管舒缩功能等心血管药理作用。基础研究已证实

但银杏酮酯联合芹菜素是否比单独用药具有显著性的疗效，根据文献，国内外还没有开展此研究，因此，我们团队本着安全、有效、合理和减少副作用的理念，开展本次的实验。

SOD是心肌内重要的抗氧化酶，作用是清除氧自由基，MDA是氧自由基脂质过氧化的最终产物，反应了心肌损伤的程［11］

IL-6作为促炎性细胞因子大量释放后诱度。再灌注过程中，

导细胞因子的级联反应，上调黏附因子与炎症趋化因子，加速

中性粒细胞与单核细胞浸润心肌细胞，从而引起大量氧自由基释放，导致心肌收缩力减弱和细胞凋亡等不可逆的心肌损［12］

伤。本实验结果显示模型组心脏组织SOD明显减少，血浆MDA、CK、cTnT、CK-MB显著升高，病理损伤严重，表明大鼠心脏缺血再灌注后机体清除氧自由基的能力明显下降，导致心脏严重损害。用银杏酮酯、芹菜素、银杏酮酯联合芹菜素提前15天灌胃治疗后与模型组相比，心脏组织的SOD含量升高，血浆

CK、cTnT和CK-MB降低，中MDA、病理损伤减轻提示银杏酮酯、芹菜素、银杏酮酯联合芹菜素对大鼠心脏缺血再灌注损伤

具有保护作用，同等剂量条件下，联合用药组疗效最佳。综上所述，与银杏酮酯100mg/kg和芹菜素100mg/kg相比，银杏酮酯联合芹菜素100mg/kg在同等剂量条件下对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有显著效果，因此推断含黄酮类的化合物联

［10］

［6］［7］［8］

2及其下游效应物的作用中国中西医结合心肌缺血再灌注中环氧化酶-2010；30（10）∶1056～1060杂志，910

张羽冠，宋宏宇，李蓥，等．蒺藜皂苷预适应对大鼠心肌缺血/再灌注GrandeS，GalliC，etal．Wildartichokepreventstheage-ＲossoniG，

2010；26（6）∶714～718损伤的保护作用．中国药理学通报，

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杨涛，叶媛，许美霞．等．不同时点应用甘松挥发油对大鼠心肌缺血2012；32（23）∶1897～1899再灌注损伤的影响．中国医院药学杂志，

ProtectiveeffectofGinkgobilobaextract50jointapigeninonheartischemiareperfusioninjuryinrats

ShiTingting，ZhuangＲangxiao，ZhouHongping，WangFugen，FangHongying，ShaoYidan，CaiZhaobin

（TheXixiAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310023）

Objective：TostudytheprotectiveeffectofGinkgobilobaextract50jointApigeninonheartischemia/reperfusion（I/Ｒ）injuryinrats．Methods：Themodelwasmadebyligatingtheleftdescedingcoronaryarteryfor45minutesandreperfusingfor2hourinrat．50ratsweredi-videdintocontrolgroup，ischemiagroup，Ginkgobilobaextract50group100mg/kg，Apigeningroup100mg/kg，Ginkgobilobaextract50jointApigeningroup100mg/kg．Ginkgobilobaextract50jointApigeninwereusedontheratsatthebeginningoftwoweeks．PlasmaMDA，CK-MB，cTnT，CKandtissueSOD，IL-6wereobserved．Myocardialinjurydegreewasobservedthoughhitopathologicalbiopsy．Ｒesults：MDA，CK-MB，cTnT，CK，IL-6werelowerandSODwashigherofGinkgobilobaextract50group100mg/kgandApigeningroup100mg/kgthanthoseischemiagroup（P＜0．05）．MDA，CK-MB，cTnT，CK，IL-6weresignificantlylowerandSODwassignificantlyhigherofGinkgobilobaextract50jointandApigeningroup100mg/kgthanGinkgobilobaextract50group100mg/kgandApigeningroup100mg/kg（P＜0．05）．PathologicaldamageofmyocardialcellsinGinkgobilobaextract50group100mg/kgandApigeningroup100mg/kgwerelighterthan

thatofischemiagroup．PathologicaldamageofmyocardialcellsinGinkgobilobaextract50jointApigeningroup100mg/kgwassignificantlylighterthanthoseofGinkgobilobaextract50group100mg/kgandApigeningroup100mg/kg．Conclusion：OurresultsindicatethatGinkgobilobaextract50jointApigenin100mg/kghaveasignificantlyprotectiveeffectonheartischemia/reperfusioninjuryinratsthanGinkgobilobaextract50group100mg/kgandApigeningroup100mg/kgbecauseitcanincreaseSODinhearttissue，decreaseIL-6inhearttissue．Keywords

Ginkgobilobaextract50（银杏酮酯）；apigenin（芹菜素）；heartinjury；ischemia/reperfusioninjury

灵芝多糖对D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝损伤的保护作用

*

112

周婕，周宏星，陈玉胜＊＊

2

（1丹阳市人民医院，丹阳212300；南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，南京211171）

目的：研究灵芝多糖对D-氨基半乳糖（GalN）所致小鼠急性肝损伤的保护作用以及对肝脏抗氧化活力的影响。方

模型组、灵芝多糖50mg/kg剂量组、灵芝多糖100mg/kg剂量组、灵芝多糖200mg/kg剂量组及联法：将60只小鼠随机分为正常组、

苯双脂100mg/kg剂量（阳性对照）组。每日灌胃给药1次，连续7d。试验末期，腹腔注射GalN（800mg/kg）建立小鼠急性肝损伤模

6h后摘眼球取血及肝脏，型，比色法检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL），以及肝脏丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化过氧化脂质（LPO）、

Px）活性。结果：100、200mg/kg灵芝多糖及100mg/kg联苯双脂显著降低GalN诱导的急性肝损伤小鼠血清ALT和物酶（GSH-AST活性及TBIL含量，CAT，GSH-Px活性。结论：灵提高血清ALB水平，显著降低肝组织LPO和MDA含量，升高GSH水平和SOD，芝多糖对GalN所致小鼠急性肝损伤具有保护作用，其机制可能与抗氧化作用有关。

关键词灵芝多糖；联苯双脂；肝损伤；抗氧化

摘要

DOI:10.13412/ki.zyyl.2014.05.027现代研究结果表明，灵芝（Ganodermalucidum）含有多种活性成分，灵芝多糖可提高机体免疫力及耐缺氧能力，能消除自

抑制肿瘤生长，抗辐射，抗衰老，提高肝脏、骨髓和血液合由基，

［1，2］

ＲNA及蛋白的能力等。本试验利用D-氨基半乳成DNA，

糖（GalN）所致小鼠化学性肝损伤模型，观察灵芝多糖的抗肝脏氧化应激作用，旨在为灵芝在肝病防治中的应用提供科学依据。

加热15分钟，取出，放入冰浴中冷却15分钟，以相应的试剂为空白，按紫外可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以对照品溶液质量为横坐标，绘制标准曲线。吸光度为纵坐标，

灵芝多糖纯度测定取制备的灵芝多糖滤饼0．1g于烧杯中，分次加入少量双蒸水，超声使溶解，转移至100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。取上述溶液1ml置10ml具塞试管3个平行，中，按标准曲线制备方法测定625nm吸光值，根据标准曲线算得灵芝多糖纯度为96．01%。联苯双酯购于南京市鼓楼医院，由北京协和制药厂生产，批号为H11020980。1．2动物60只清洁级、雄性昆明小鼠（20±2）g，购自南京市青龙山动物中心。生产许可证号：SCXK（苏）2014-0005。

12h光照/12h黑暗，饲养条件为：温度（24±2）℃，常规饲料，

自由饮水进食。适应5d后用于试验。1．3

试剂GalN购自Sigma公司，谷丙转氨酶（alaninetrans-aminase，ALT）、谷草转氨酶（aspertateaminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）、总胆红素（totalbilirubin，TBIL）、丙二

过氧化脂质（lipidperoxidase，醛（malondialdehyde，MDA）、

LPO）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化氢

酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathionperoxi-Px）、SH，GSH）、dase，GSH-还原型谷胱甘肽（glutathione-及蛋白质测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。1．4

UV-759）；旋转蒸紫外可见分光光度计（上海精科，

ＲE-2000B）。发器（上海亚荣，

1．5方法60只供试小鼠随机分为6组，分别为正常组、模型

仪器

100，200mg/kg剂量）组和联苯双酯（100mg/组、灵芝多糖（50，

1

1．1

材料与方法

试验药物

灵芝多糖由南京晓庄学院生化环院微生物学

实验室提取和制备。灵芝（Ganodermalucidum）由江苏省农业

科学院提供，江苏食用菌协会张李阳教授鉴定。取供试品约100g，90～95℃加热粉碎，置1000ml圆底烧瓶中，加水500ml，回流1小时。过滤，滤液备用。残渣加水400ml，加热回流1小时。过滤，弃去滤渣，合并两次滤液，浓缩至200ml，加等量无水静置过夜，抽滤，滤饼干燥至无醇味，得9．45g（得率9．乙醇，45%），备用。《中华人民共和国药典》参照2010年第一部"灵芝"项下"含量测定"方法，测定灵芝多糖的纯度。标准曲线的制备精密称取葡萄糖对照品适量，加双蒸水制成0．1mg/ml对照品标准溶液。分别精密吸取对照品溶液0，0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2ml，置10ml具塞试管中，加双蒸水至2．0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0．1g，加80%的硫酸溶液100ml使溶解，摇匀）6ml，摇匀，置沸水浴中

*基金项目：南京晓庄学院校级重点学科基金项目（XZZDXK201203）

＊＊

通讯作者

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/bzij.html