猪链球菌的分离鉴定

目 录

中文摘要??????????????????????????1 英文摘要??????????????????????????2 前言 ???????????????????????????3 1.材料与方法????????????????????????4 1.1 实验材料????????????????????????4 1.1.1 病料?????????????????????????4 1.1.2 仪器?????????????????????????4 1.1.3 试剂及药品??????????????????????5 1.1.4 培养基的制备?????????????????????5 1.1.5 试验动物???????????????????????6 1.2 试验方法????????????????????????6 1.2.1 细菌涂片、染色、镜检?????????????????6 1.2.2 细菌分离培养?????????????????????6 1.2.3 生化试验???????????????????????6 1.2.4 血清学鉴定??????????????????????7 1.2.5 动物致病性试验????????????????????7 1.2.6 药敏试验???????????????????????8 2 结果与分析????????????????????????8 2.1 染色结果????????????????????????8 2.2 分离培养结果??????????????????????9 2.3 生化试验结果??????????????????????9 2.4 血清学试验结果?????????????????????10 2.5 动物致病性试验结果???????????????????10 2.6 药敏试验结果??????????????????????10 2.7 防治??????????????????????????10 3.结论与讨论????????????????????????11 3.1 关于猪链球菌致病机理??????????????????11 3.2 关于猪链球菌病诊断???????????????????12 3.3 关于猪链球菌病防制???????????????????13 3.4 结 论?????????????????????????14 参考文献??????????????????????????15 致谢????????????????????????????16

摘 要

猪链球菌病是猪链球菌（Streptococcosis suis）引起的猪的一种重要的疾病，猪只不分品种和年龄阶段均容易感染，并且能够感染给人，可导致人和猪的死亡。猪链球菌主要感染3-12周龄的仔猪。近些年来，在美国、英国、荷兰、日本、加拿大、丹麦等许多国家均有猪链球菌病发生的报道，并在世界范围内造成了巨大的经济损失。在我国南方几省也曾经一度广泛流行，给我国也带来了很大的经济损失。目前已经鉴定出了35种血清型的猪链球菌，其中以2型最重要、最为常见。2004年4月，沈阳市某种猪繁育场大范围的发生仔猪的关节炎和败血症。本次试验以无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份作为病料，并对这16份病料进行了病原菌分离试验、血清学鉴定、药敏试验、致病力试验。试验结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，而且引起关节炎症状的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素等高度敏感，而对土霉素、链霉素等具有较强的耐药性。

关键词：猪；链球菌；分离鉴定

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Absract

Streptococcosis suis disease is an important disease of pigs ,witch is caused by Streptococcosis suis.All breeds and ages are susceptible. It can infect people and may lead to the death of people or pigs. Streptococcosis suis infect piglets of the ages witch is from 3 weeks to 12 weeks usually.In the recent years ,the disease has been reported occuring in many countries such as American,England,Japan,Holand,Canada and Danmark ect. And it caused a lot of economic losses in all over the world.In some provinces in south of China the disease spread widely and caused a lot of losses too.By now 35 kinds of serum types have been appraised and the 2 serum type is most important and most common.In Shenyang the arthritis and blood pionsioning occurred in piglets widely in some hogger in May 4th,2004.As the pathological material of disease we took eight shares each of the liquid of arthrotis from the piglets sickening arthritis and liver,lungs,spleen,mesentery lymth nodes shares,and on these sixteen shares the separation experiment,the appraisal to serology ,the agile experiment of medicine and the capacity of causing disease were carried on. The result makes it known :it is the 2 serum type causing to the disease and it is lower capacity of causing to the arthritis than that of the blood poisioning; Streptococcosis suis is highly sentitive to Cephalosporin and Penicillin, but the medicine enduring of witch is greater to some such as Terramycin and Streptomycin.

Keywords: Pig；Streptococcus；Separation and Identification

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前言

猪链球菌（Streptococcosis suis）在1956年～1963年间Demoor，首次通过生化和血清学方法，对猪的败血性感染的新的a溶血性链球菌进行了鉴定，它属于兰氏R、S、RS和T群在英国Elliott(1966)建议Demoor的S群与纯化的PM链球菌相似，两者都归属于兰氏D群，他命名该链球菌相似，两者都归属于兰氏D群，他命名为猪链球菌荚膜2型，1型与仔猪脑膜炎有关，而2型菌株可感染任何日龄的猪，与1型和2型抗血清均有反应的菌株为荚膜1/2，1983年～1995年描述了35个菌株，共分成32个新的荚型，荚膜2型菌株，在所在国家发病猪中都是主导菌株，某些不常见的荚膜型的菌株，可以引起严重感染，如9型与断奶仔猪的败血症脑膜炎，肺炎暴发有关。

猪链球菌病是猪的一种重要疾病，养猪业发达国家如美、英、荷及爱尔兰等常有本病发生。我国于1958年就有猪链球菌病的报道，1976年我国南方几省曾一度广泛流行，给我国养猪业带来了很大危害。猪链球菌截止到目

[1]

前已发现的荚膜型已超过30多种,其中以2型最重要、最为常见。我国于1995年首例鉴定证实2型猪链球菌在我国的存在 [2]。猪链球菌可致2～6周龄仔猪败血症、脑膜炎、关节炎及支气管肺炎等{3～7}。本病在猪群暴发流行时,与猪经常接触的牛犬和禽类不见发病.在猪中仔猪,架子猪和怀孕母猪的发病率高。人工感染家兔最敏感,次为仓鼠,小鼠,鸽和鸡。

病原 链球菌系链球菌科(Streptococcaceae)链球菌属(Streptcoccus)的细菌,种类繁多,在自然界中分布很广,是一种呈球状细菌,沿一个方向进行分裂繁殖,因而呈菌数不等和长短不一的链状排列。不形成芽胞,有的在病料中或含血清的培养基内能形成荚膜,为革兰氏阳性菌,一般为兼性厌氧菌[5]

。该菌在粪便、灰尘和死尸中存活很长时间,但对去污剂和普通消毒剂敏感[6]。此菌抵抗力不强, 对干燥、湿热敏感,60℃30min即可被杀死。

按Lancefield血清学分群方法,链球菌分为20个菌群,与其有关的血清群是A、B、C、D、E(P.U.V)、Q、G、L、N、M、P、R(D)、S(D)14个菌群,

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目前,A、B、C、D、E、L等6个是引起发病的主要菌群。

根据链球菌菌体荚膜抗原特性的不同,D群又分成35个血清型,即1～34型和1/2型,其中以2型流行最广,对猪的致死性亦最强,其次是1型,其他有致病性的3～5,7～9和11,1/2型等[3]。国外多由D群的某些血清型特别是2型引起猪的败血型和脑炎型链球菌病,而在国内以C群的兽疫链球菌为主,D群较少,E群则引起慢性链球菌的关节炎和淋巴结炎(脓肿)。一般的猪场都

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有2～3个致病菌混合感染,1头猪可以同时感染2～3个菌群。

诊断 根据临床症状，年龄和肉眼病理变化及镜检即可确诊。特征性临床症状有磨牙、跛行、排干粪、空嚼，淋巴结肿大，皮肤、耳、四肢末稍有出血斑。肉眼可见急性死猪全身皮肤淤血，呈暗紫色，肺充血，肺广泛散在

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小叶性肺炎，心包积液，心内膜出血，关节内有胶样的液体或纤维素性、脓性分泌物，淋巴结脓肿出血，心二尖瓣有菜花状增生物。结合涂片、染色、镜检，分离培养，生化试验，动物接种等细菌学检查即可确诊链球菌病。

防制 首先严格检疫不从疫区购入病猪和带菌猪,对病猪隔离,病死猪无

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害化处理,深埋。加强饲养管理，注意环境卫生和经常性可能污染的环境、用具消毒。为根除本病在猪群中发生最好淘汰病猪。

其次可用预防接种防治此病目前国产的疫苗主要有猪链球菌多价灭活苗、氢氧化铝甲醛苗、弱毒冻干苗,按瓶签说明使用,免疫期6个月,可达到预期效果。

再者对患病猪群要作到及时发现,尽早治疗,可通过药敏试验，确定高效药物，连续用药,加强巩固疗效是治疗本病的关键。

2004年4月，沈阳市某种猪繁育场仔猪，多为2～6周龄仔猪。出现体温时高时低,精神食欲时好时坏,一肢或多肢关节肿大,跛行或不能站应,消瘦,衰弱或突然恶化而死亡等症状。病死猪和放血致死猪均呈衰竭状，后肢皮下有淡灰色胶冻样渗出物，腹股沟、掖下淋巴结肿大，多数关节部肌肉组织化脓，脓肿局限于单块肌肉中，切开后内容物有的就较干燥，有的呈半流体状，均呈淡黄色，脓肿周围有包膜，与周围健康组织界限明确，无粘连；脓肿内容物均呈半流体或豆腐渣样。肝脾包膜稍厚无明显坏死灶，肠系膜淋巴结肿大，质度坚实，表面及切面呈黄白色。小肠及结肠的浆膜有个别小出血点，小肠粘膜有轻微渗出性。肺脏心叶和间叶出现融合，小叶性肺炎，关节和皮下脓肿。疑为猪链球菌病，为作进一步诊断，无菌采取关节炎病猪的关节液及败血症病猪的肝、脾、肺及肠系膜淋巴结，经实验室分离鉴定，证实为2型猪链球菌。现将分离鉴定结果报告如下。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1 病料

无菌采取患关节炎病猪的关节液8份，编号为1～8号，无菌采取患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结8份，编号为9～16号。 1.1.2 仪器

电热恒温培养箱 型号 HG303-3K 南京电器三厂制造 电热鼓风干燥箱 型号 HG101-1 南京电器三厂制造

电热手提高压蒸汽消毒器YXQ.SG41.280上海医用核子仪器厂 显微镜双筒 型号 JENA

Anke TDL80-2B 离心机 上海浦江科学仪器厂 1.1.3 试剂及药品

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40％KOH；肌酐（Creatine）蛋白胨琼脂；氯化钠胆盐；葡萄糖；KH2PO4 ；0.2％酚红；0.2％溴麝香草酚蓝；纯乙醇；浓盐酸；１０％硫代硫酸钠；１０％醋酸铅

微量糖发酵管（上海化学试剂二厂）分别为：蔗糖；山梨醇；棉实糖；葡萄糖；甘露糖；蕈糖；乳糖；菊糖；水杨苷；马尿酸钠

药敏纸片（上海伊华医学科技有限公司生产）分别为：

头孢菌素；庆大霉素；洁霉素；青霉素；卡那霉素；链霉素；土霉素；复方新诺明；万古霉素；红霉素；利福平；氯霉素；恩诺沙星；痢特灵

猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原（中国兽药鉴察所） 1.1.4 培养基的制备

兔鲜血平板：将灭菌的营养琼脂加热融化，冷至45～50℃时，加入无菌鲜血达5%（即每100毫升营养琼脂中加入鲜血5～6毫升）倾注于平皿，待凝固后，置37℃培养1～2日，有污染者废弃，无菌者保存于冰箱备用。

牛血清肉汤：向灭菌的营养肉汤中加入牛血清，每100毫升加20毫升牛血清，分装试管，置37℃培养1～2日，有污染者废弃，无菌者保存于冰箱备用。

麦康凯培养基：取成品50克加入1000毫升冷蒸馏水，混合放置20分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸至全部溶解，高压灭菌（115℃）15分钟后冷却至50℃左右，倾入无菌平皿内，凝固后冷藏备用。

营养琼脂： 取成品41克加入1000毫升冷蒸馏水混合放置20分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸，至全部溶解，分装入适当容器中高压灭菌（121℃）15分钟，凝固后冷藏备用。

Christenrsen氏培养基：1升含蛋白胨1克，葡萄糖1克，氯化钠5克，KH2PO4 2克0.2％酚红溶液6ml，琼脂20克，调整pH至6.9。在121℃高压灭菌15分钟，使冷到55℃时加入十分之一的20％尿素液（经滤过法除菌的）使尿素含量为2％（即每1000ml中有20克），做成短斜面。

邓亨氏蛋白胨溶液：蛋白胨水溶液（蛋白胨1克，氯化钠0.5克，水100ml,pH7.6）按0.5％～1％的比例加入葡萄糖（或其他各种糖），每100ml加入1.2ml的0.2%溴麝香草酚蓝（或用1.6％溴甲酚紫酒精溶液0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先加有一枚倒立的小发酵管），10磅高压灭菌10分钟。

甲基红试验培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5克，完全溶解于1000ml水中后，分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。

欧立希氏吲哚试剂： 对位二甲基苯甲醛1克，纯乙醇95ml，浓盐酸25ml,

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先以乙醇溶液试剂后加盐酸，要避光保存。 1.1.5 试验动物

健康小白鼠（30～35g）10只，购自沈阳医科大学实验动物中心。

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1.2 试验方法

1.2.1 染色镜检

将所采病料分别涂片，用革兰氏染色镜检抹片的制备及染色：先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量菌落在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。让其然干燥。固定用火焰固定法。将干燥好的抹片使涂面向上，以其背面在洒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手为度）进行固定。染色用革兰氏染色法。

革兰氏染色法： （1） 在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2分钟，

水洗。

（2） 加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-3分钟，水洗。 （3） 加95%酒精于抹片上脱色，约30秒至1分钟，水洗。

（4） 加稀释石炭酸复红（或沙黄水溶液）复染10-30秒钟，水洗。 （5） 吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝色，革兰氏阴性菌呈红色。 1.2.2 细菌分离培养

将所采病料，分别接种鲜血琼脂平板，麦康凯平板，营养琼脂平板。37℃需氧培养24h后，挑取可疑菌落接种于改良马丁肉汤，37℃培养24h后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种血清肉汤，纯化后放置4℃，冷藏备用。 1.2.3生化试验

随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3#、8#、13#、15#，分别作以下生化试验。

糖发酵试验：用灭菌接种针将待检菌分别接种于微量糖发酵管中（分别为蔗糖 山梨醇 棉实糖 葡萄糖 甘露糖 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨苷 马尿酸钠），然后将其倒置于烧杯中，在恒温箱中37℃培养，24小后观察。凡发酵管中有变色者表示此菌产酸，凡培养基变色并产气者为此糖产酸产气，凡培养基不变色者表示该菌不发酵此糖。

维培（V-P）二氏试验：

原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetyethyl carbinol）→2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol）,在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。

方法：（O′Mearaa′s试剂法） 40％KOH 5ml、肌酐1小刀尖加入于5ml（即与培养基等量）的培养物中，猛烈摇振混合。37℃培养24～48小时，加数滴试剂，略加摇匀半分钟，待试剂上浮液面，试剂呈红色为阳性反应。

硫化氢产生试验：

方法：用接种针将待试菌穿刺接种于醋酸铅培养基或硫酸亚铁培养基

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中。37℃卵育1～4天，每天检查，沿穿刺线或其周围变为黑色为阳性反应。

甲基红（M.R）试验：

方法：接种细菌于培养液中，在37℃培养2～7天后。于培养物中加入

几滴试剂，变红者为阳性反应，（从葡萄糖产酸，培养液的pH低于4.2）。

吲哚（靛基质）试验：

原理：细菌能分解蛋白质中的色氨酸生成吲哚，后者与对位二甲基氨基

苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。

方法：以接种环接种待检细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白胨溶液

中，在37℃培养24～48小时（可延长4～5天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3ml,摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入试剂2ml。在戊醇或甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。

枸橼酸盐利用试验：

方法：用灭菌的接种针蘸取待检液，在枸橼酸盐培养基的斜面上划线接

种，再穿刺接种。在37℃培养2～3天，观察培养基上是否有细菌生长，并观察颜色变化。如果有细菌生长，并且颜色变为天蓝色，则为阳性反应，说明此菌能利用枸橼酸盐。

硫化氢试验：

原理：细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢（H2S）者，其所产生的H2S

会使培养基中的醋酸铅或FeCl3形成黑色的硫化氢或硫化铁。

方法：在融化的琼脂内加入硫代硫酸钠溶液（先煮沸灭菌），待凉至

60℃，再加入醋酸铅溶液，混合均匀，无菌分装灭菌试管达三指高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。用接种针蘸取纯培养物，沿试管壁作穿刺，孵育于37℃经１～２天后观察，必要可延长５～７天。培养基变为黑者为阳性[6]。

1.2.4血清学鉴定

将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用pH7.2 的0.01mol/L PBS制成1/10000～1/20000细菌悬液[11]。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。 1.2.5动物致病性试验

小白鼠感染实验：用5只20克左右重的小白鼠腹腔接种分离菌血清肉汤培养物0.2毫升，另设5只分别腹腔注射0.2毫升血清肉汤作对照。对注射后的小白鼠隔离饲养，观察其发病及死亡情况，对死亡的小白鼠立即解剖，无菌采取肝脏，脾脏病料，涂片，革兰氏染色，镜检。并在鲜血琼脂平板上

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划线分离培养。 1.2.6药敏试验

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采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板；待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20～24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药[13]。结果评定参照表1。

表 1 各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准

抗菌药物名称

青霉素 土霉素 洁霉素 链霉素 庆大霉素 卡那霉素 头孢菌素 万古霉素 红霉素 利福平 呋喃妥因 氟哌酸 复合磺胺 氯霉素

抑菌圈直径（mm） 耐药 <10 <10 <10 <10 <12 <12 <10 <10 <14 <16 <15 <13 <11 <13

中度敏感 10～12 10～14 10～14 10～14 13～14 13～14 10～15 10～11

14～22 16～20 15～17

13～17 11～16 13～18

高度敏感 >13 >15 >15 >15 >15 >15 >15 >12 >22 >20 >17 >17 >16 >18

2 结果与分析

2.1涂片、染色、镜检结果

关节液、鲜血琼脂、改良马丁肉汤及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在改良马丁肉汤及血清肉汤培养物中多呈长链状。

2.2分离培养结果

37℃培养24h后，所采的16份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。在麦康凯琼脂平板上不生长。在营养琼脂上生长不好。该菌在改良马丁肉汤中底部有沉淀，在血清肉汤中

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先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

2.3生化试验结果（见表2、表3）

表2 糖发酵试验结果

菌号 项 目

蔗糖 山梨醇 棉实糖 葡萄糖 甘露糖 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨苷 马尿酸钠

3# + - - + + + + + + - 8# + - - + + + + + + - 13# + - - + + + + + + - 15# + - - + + + + + + -

表3 其它生化试验结果

项目 菌 号

3# 8# 13# 15#

维培（V-P）二氏试验 - - - - 靛基质（吲哚）试验 - - - - 甲基红（M.R）试验 - - - - 枸橼酸盐利用试验 - - - - 硫化氢试验 - - - -

判定标准：“+”表示大多数（90%～100%）菌株为阳性；“-”表示大多数（90%～100%）菌株为阴性。

表2表明分离的3#、8#、13#、15#菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。

2.4 血清学鉴定结果

将3#、8#、13#、15#细菌悬液与1/2及2型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与1型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。

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参考文献

[1] 杨本升，刘玉斌，苟仕金等． 动物微生物学． 吉林科学技术出版社，1995，145～146

[2] 张庚华．猪链球菌感染最新研究进展．国外兽医学—畜禽疾病，1995，16（2）：31

[3] 黄毓茂,黄引贤．2型猪链球菌的血清学鉴定．中国兽医学报，1995，15（1）：63～65

[4] Gottschalk M.J Clin Microbiol，1989，27：2633～2636 [5] Higgins R et al．Can J vet Res，1990，54：170～173 [6] Sanford S E.JAVMA，1982，181：673～676 [7] Wiadsor.Vet Rec，1977，101：378～379

[8] 蔡宝祥.家畜传染病学.北京：中国农业出版社，1998.131～132

[9] 甘肃农业大学主编．兽医微生物学（第二版）．中国农业出版社，1998.138 [10]李健强. 兽医微生物学实验与实习指导．西北农业大学，1996，16

[11]张彦明，贾靖国，刘安典．动物性食品卫生检验技术．西北大学出版社，1996，72

[12] 郑明球．家畜传染病学实验指导．北京， 中国农业出版社，1999，78

[13] 汪诚天，叶祝年，一支方等．兽医实验手册．上海科学技术出版社，1984，85 [14] 姚火春，陈国强，陆承平.猪链球菌1998分离株病原特性鉴定.南京农业大学学报，1999.22（2）：67～70

[15]欧瑜，陆承平。检测猪链球菌2型毒力相关蛋白ELISA法的建立。南京农业大学学报，2001，24（2）：94～97

[16]欧瑜，陆承平。猪链球菌2型国内分离毒株毒力相关蛋白的分析，微生物学报，2002，42（1）：105～109

[17]Williams A E,Blakc more W E.Pathogenesis of meningitis caused by Streprococcus suis type 2 J Infect Dis,1990,162(2)474～481.

[18] 方绍庆 陆承平 猪链球菌2型溶血素的化学修饰 微生物学报43卷 3期2003年6月，43～45

[19] Tom Alexander ,Andre Broes . Type2eradicationnotaneasyoption ,《Pig Progress》September 2001,10～11

[20] 秦正兴，沈建芬，谢建源。猪链球菌病的防治。上海畜牧兽医通讯，１９９９，（６）：３９

[21] 赵永志．猪链球菌病的研究．畜牧兽医杂志．１９９９，１８（７）：27 [22] 仇保荣．猪链球菌病的防治措施．农业科技通讯，１９９４，（７）：２２ [23] 谢琴，何存利，史建斌．猪链球菌病的诊断和防治．宁夏农林科技，１９９９，（３）：24

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致 谢

本论文是在沈国顺副教授的悉心指导下完成的，从选题到资料的收集，实验阶段的指导和论文的写作和修改等个方面给予精心指导。

在实验过程中刘丽霞老师给予了热情的指导和大量的帮助，特此感谢。同时感谢杨墅，周远斌在材料的整理过程中给予了热情的帮助。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/byq6.html