TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程(1) - 图文

HEREDITAS (Beijing) 2013年4月, 35(4): 533―544 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn

实验指南 DOI: 10.3724/SP.J.1005.2013.00533

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的 实验方法与流程

沈延, 黄鹏, 张博

北京大学生命科学学院, 细胞增殖与分化教育部重点实验室, 北京 100871

摘要: 类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)是最近发展起来的一

类新型的人工核酸内切酶, 它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列, 造成DNA双链断裂, 从而诱导该靶序列产生indel突变, 目前已成功地应用于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。文章介绍TALEN靶点的选择与确认, 采用“单元组装法”构建人工TALEN的原理与步骤, 以及通过显微注射TALEN mRNA诱导并筛选斑马鱼突变体的实验流程与经验。这些方法理论上也适用于对其他物种进行基因打靶。

关键词: 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN); 斑马鱼; 基因组定点突变; 基因打靶; 反向遗传学技术

A protocol for TALEN construction and gene targeting in zebrafish

SHEN Yan, HUANG Peng, ZHANG Bo

Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education, College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China

Abstract: TALEN (Transcription activator-like effector nuclease) is a newly developed family of artificially engineered sequence-specific endonucleases, which consists of a highly specific and repetitive DNA-binding domain derived from TALE (Transcription activator-like effector) and fused with the non-specific endonuclease domain of FokⅠ. TALENs have been reported to be able to induce site specific genome modification in quite a few species and in vitro cultured cells. Here, we introduced the principles for target site selection and confirmation and described a brief experimental protocol for the easy construction of customized TALENs using unit assembly (UA) method and also for generation of and screening for TALEN-mediated targeted zebrafish mutants through microinjection of TALEN mRNAs into zebrafish embryos. Theoreti-cally, the principles and methods we described here are also applicable to gene targeting in other species.

Keywords: transcription activator-like effector nuclease (TALEN); zebrafish; site specific genome modification;

gene targeting; reverse genetics approach

收稿日期: 2012?12?30; 修回日期: 2013?02?05

基金项目:国家重大科学研究计划项目(编号：2012CB945101和2011CBA01000)和国家自然科学基金项目(编号：31110103904)资助

作者简介:沈延, 博士, 研究方向：斑马鱼遗传与发育机制。Tel：010-62753077; E-mail: yshen@pku.edu.cn

通讯作者:张博, 博士, 教授, 研究方向：斑马鱼遗传与发育机制。E-mail: bzhang@pku.edu.cn

致 谢:感谢祖尧为改进检测技术做出的贡献。

网络出版时间: 2013-3-5 15:03:12

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20130305.1503.002.html

534 HEREDITAS (Beijing) 2013 第35卷

进入21世纪以来, 斑马鱼(Danio rerio)由于胚胎透明、发育快、后代数量大等种种优势逐渐成为遗传发育研究领域中一种重要的模式生物[1~4]。然而, 由于斑马鱼的胚胎干细胞(ES)技术不够成熟, 因此还无法像小鼠那样通过ES途径进行基因打靶。最近十几年来, 人们始终在不遗余力地尝试通过各种途径在斑马鱼中制备/筛选突变体, 并且已陆续建立了多种方法, 例如, ENU (N-ethyl-N-nitrosourea) 化学诱变、TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)、反转录病毒插入诱变、基因诱捕(Gene trap)和ZFN (Zinc finger nuclease) 介导的定点突变等[5,6]。但是这些方法都有各自的局限性, 还没有一种能够实现对斑马鱼的任意基因进行靶向修饰。直到2009年, 有两组科研人员同时揭示了来自植物病原菌——黄单胞杆菌(Xanthomonas spp.)中TALE (Transcription activator-like effector)家族的蛋白结构单元与DNA靶序列之间存在一一对应的特异性识别并结合的秘密[7,8], 基因组定点突变技术才打开了新的局面。迄今仅短短3年的时间, 人们已经利用TALE蛋白这种特殊的DNA结合结构域跟FokⅠ核酸酶结构域融合构成人工TALE核酸酶(TALE nu-clease, 简称TALEN), 建立了理论上能够对任意物种进行基因打靶的新技术, 并且成功地在体外培养的人类细胞、线虫、斑马鱼、大鼠、果蝇等17个物种中实现了基因组定点突变(详见本期另文发表的综述“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术”[9])。由于斑马鱼的反向遗传学技术相对于果蝇、线虫等经典模式动物而言更亟待完善, 因此, TALEN技术的建立对于斑马鱼研究领域更有着不同寻常的意义

[10,11]。

TALEN技术应用的关键步骤之一是TALEN表达载体的构建。天然TALE蛋白DNA结合结构域的核心部分一般由1.5~33.5个基本重复单元(Repeat unit)串联而成, 其中每个单元包含34个左右的氨基酸残基[12]。每个重复单元中第12位和13位的氨基酸残基称为重复可变双残基(Repeat variable di-residue, 简称RVD), 它决定了该单元识别DNA碱基的特异性。常用的RVD包括NI(Asn Ile)、HD(His Asp)、NG(Asn Gly)和NN(Asn Asn), 分别对应识别碱基A、C、T和G

[7,8]。目前人们已报道了多种方法用于构

建TALE串联重复序列(TALE repeats), 其中“单元

组装法”(Unit Assembly, UA)是本实验室建立的一种简便、可靠的构建TALE串联重复序列的方法。该方法的起始材料只需要分别对应于识别4个碱基的4个TALE基本单元模块, 采用3个常见的限制性内切酶SpeⅠ、NheⅠ和HindⅢ, 通过简单的酶切—连接反应, 即可像搭建积木那样串联组装出任意长度、任意顺序的TALE重复序列[10]。本方法最大的优势在于原理简单、可操作性强, 不需要任何特殊的试剂或仪器, 只要掌握了常规的分子克隆操作技术, 就可以用本方法组装出用户指定的TALE串联重复序列。下面详细介绍本实验室采用单元组装法构建人工TALEN表达载体并在斑马鱼中进行基因组定点突变的具体实验流程与经验。需要指出的是, 用本方法构建的TALEN同样可以用于高效、定点突变其他物种或细胞的基因组[13]。

1 材料

1.1 实验材料

感受态细菌：用于构建TALEN表达载体。 性成熟的斑马鱼：用于突变斑马鱼内源基因。建议选用实验室常用的近交系品种[14]。 1.2 质粒与试剂

1.2.1 构建TALEN所需的质粒与引物

TALE单体质粒系列(TALE基本单元模块载体[10]) (图1)：均为氨苄青霉素(Amp)抗性。共4种, 分别称为pA(NI)、pC(HD)、pG(NN)和pT(NG)。由本实验室在pMD18-T(TaKaRa)载体骨架的基础上构建, 作为组装TALE串联重复序列的起始载体。TALE单体在连入pMD18-T载体时方向可正可反, 并不影响

图1 TALE基本单元模块载体结构示意图

以pC、pG和pT为例, pA的插入方向与此相反。

第4期

沈延等: TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程 535 TALE重复序列的构建。在我们目前所用的4种载体中, pC、pG和pT都是从M13-47到RV-M的方向连入, 而pA则是从RV-M到M13-47的方向插入。这类质粒的代表性序列详见补充材料。

pCS2-0.5TALE-FokⅠ表达载体系列(简称pCS2- FokⅠ表达载体[10])(图2)：均为氨苄青霉素(Amp)抗性。需成对使用(pCS2-PEAS系列和pCS2-PERR系列配对)。由本实验室在pCS2载体的基础上构建。可作为骨架载体, 用于插入组装好的TALE串联重复序列, 以便最终构建出TALEN表达载体。该系列载体除了含有FokⅠ切割结构域的编码序列之外, 还带有CMV启动子/增强子、SP6启动子、来自SV40的核定位序列(NLS)、3×FLAG标签(pCS2-0.5TALE- PEAS系列载体)或HA标签(pCS2-0.5TALE-PERR系列载体)等功能元件。此外, 该载体中还预先组装了TALE重复结构域中3′端的最后0.5个重复单元(识别TALEN靶点中的最后一位碱基), 因此, 该系列载体包括分别识别A、C、T、G等4种末位碱基的4对(共8种)载体(表1)。这类质粒的代表性序列详见补充材料。

构建和检测TALEN载体所需的引物见表2。 1.2.2 构建TALEN以及在斑马鱼中检测TALEN活

性所需的试剂与溶液

NEB限制性内切酶：HindⅢ-HF、KpnⅠ、

NheⅠ-HF、NotⅠ-HF或SacⅡ、SpeⅠ-HF。

试剂盒：DNA连接试剂盒(TaKaRa, D6020)、微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪, CW0524)、质粒小提试剂盒(康为世纪, CW0511)、快速DNA产物纯化试剂盒(康为世纪, CW2301)、SP6 mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion, AM1340)(用于体外转录TALEN mRNA)、T载体试剂盒(pMD?18-T, TaKaRa, D101A)

琼脂糖、DNA marker、1×TAE、氨苄青霉素、LB琼脂培养基、LB液体培养基、2×Taq MasterMix (含染料)(康为世纪, CW0682)、碱性磷酸酶(CIAP,

图2 pCS2-FokⅠ表达载体结构示意图

表1 pCS2-FokⅠ表达载体列表

pCS2-0.5TALE-FokⅠ系列 (简称pCS2-FokⅠ系列)

pCS2-A-FokⅠ系列 pCS2-C-FokⅠ系列 pCS2-T-FokⅠ系列 pCS2-G-FokⅠ系列

pCS2-0.5TALE-PEAS系列 (简称pCS2-PEAS系列)

pCS2-0.5TALE-PERR系列 (简称pCS2-PERR系列)

pCS2-A-PEAS pCS2-A-PERR

pCS2-C-PEAS pCS2-C-PERR

pCS2-T-PEAS pCS2-T-PERR

pCS2-G-PEAS pCS2-G-PERR

表2 构建和检测TALEN载体所需引物列表

名称 M13-47 RV-M A-For C-For G(NN)-For T-For 63dn SP6

序列(5′→3′)

CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC AGCGGATAACAATTTCACACAGGA TAGCGATTGCTAGTAATATT TAGCGATTGCTAGTCATGAC TAGCGATTGCTAGTAACAAT TAGCGATTGCTAGTAATGGG CGGCAACGCGATGGGATGTG ATTTAGGTGACACTATAG

用途

检测TALE重复序列单元数和序列的引物之一 检测TALE重复序列单元数和序列的引物之一 检测TALE重复序列连接方向的上游引物 检测TALE重复序列连接方向的上游引物 检测TALE重复序列连接方向的上游引物 检测TALE重复序列连接方向的上游引物 检测TALE重复序列连接方向的下游引物 检测TALE重复序列连接方向的测序引物

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TaKaRa, D2250)、1 mol/L Tris(pH 8.0)、50 mmol/L NaOH、70%乙醇、超纯水(ddH2O, 18 M?) 1.3 仪器与耗材 1.3.1 仪器

(1)构建TALEN所需仪器：超净工作台(细菌操作用)、细菌培养摇床、台式离心机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex)、NanoDrop(ND-1000 Spectro-photometer)、PCR仪

(2)在斑马鱼中检测TALEN活性所需的额外仪器：显微注射装置、体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离心机 1.3.2 耗材

细菌培养皿、移液器、移液器吸头、Eppendorf离心管、PCR管、显微注射针。

2 实验流程

2.1 采用“单元组装法”构建TALEN表达载体与活

性检测的基本原理与过程

由于TALE重复序列的结构是串联重复、首尾相接的, 因此, 理论上可以将重复单位中的任意两个相邻的氨基酸残基作为串联重复序列的起点和终点进行结构组装, 最后只需要把第一个重复单位和最后一个(或0.5个)重复单位的两端补齐, 即可构成完整的TALE重复序列。根据这一原理, 我们选择TALE重复单位中第11位的丝氨酸残基(Ser, S)到下一个重复单位中第10位的丙氨酸残基(Ala, A)之间的序列作为新的重复单位(称为“替换单元”, 图3A)进行TALE重复序列的构建。这样, 我们就可以利用氨基酸密码子的简并性, 在“替换单元”的一端(N端)设计一个SpeⅠ的酶切位点, 另一端(C端)设计其同尾酶NheⅠ的酶切位点。利用同尾酶可产生相同的粘性末端、但是连接在一起后又会丧失原有的酶切位点的特点, 通过反复的酶切—连接反应, 就可以将所需要的重复单元依次组装到一起(图3B)。最后, 将TALE重复序列跟FokⅠ切割结构域的编码序列整码(In-frame)连接, 即可构建出完整的TALEN编码序列及表达载体(图3C)。

更多关于构建、应用和检测TALEN的各种方法

的信息可参考本期另文发表的综述“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技

术”[9]

和由本验室建立的人工核酸内切酶(Engineered

endonuclease, EEN)的综合数据库与知识库网站EENdb(http://eendb.zfgenetics.org/)[15]。 2.2 TALEN靶点选择与确认 2.2.1 TALEN靶点的预测与选择

应用TALEN技术的首要步骤是选择并确认基因组的靶位点。由于TALEN中的FokⅠ核酸酶结构域通常以二聚体的形式起作用, 因此, TALEN结合位点(或称TALE结合位点)也需要成对选择。这样, 一个完整的TALEN靶位点(或简称靶点)就包含一个左侧TALE结合位点及其0位的t碱基和一个右侧TALE结合位点及其0位的t碱基, 以及它们之间的间隔序列(Spacer)。其中, 左、右两侧的TALEN单侧靶点(即TALEN结合位点)也可称为“半位点”(Half-site)。除非有特别说明, 本文下面提到的TALEN靶点均指由左、右两个TALE结合位点(半位点)及其两侧0位的t碱基加上中间的Spacer所构成的完整的靶序列(图4)。

TALE/TALEN单侧靶点(即半位点)及其0位的t碱基的结构通式为：5′-t (N)n N-3′。应用本方法构建TALEN表达载体建议遵从如下原则选择靶点(图4)：

(1)半位点的方向：TALE蛋白自N端到C端识别并结合DNA单链的方向是从5′端到3′端(图4)。为了便于FokⅠ结构域形成二聚体, TALEN靶点中左、右两侧半位点的单链方向必须是相反的, 即一个半位点设计在正义链上, 另一个半位点则需设计在反义链上。

(2)半位点的长度：单侧靶点(半位点)最好控制在11~16 bp(即n = 11~16; 这里并不包括0位的t), 这样即能保证靶向的特异性, 也不需要太多的构建步骤。合成识别大于16 bp靶点的TALE重复序列和相应的TALEN需要增加酶切—连接的步骤, 花费额外的时间和精力; 如确有必要也可以选择。

(3)0位碱基(需要特别指出的是, 这个0位的t并不需要组装对应的TALE单元模块)：紧邻单侧靶点(半位点)5′端上游的第一个碱基(称为第0位的碱基)必须为t(图3、图4)[7,16]。

第4期

沈延等: TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程 537

图3 “单元组装法”构建TALEN表达载体的基本原理与过程示意图

(4)末位碱基：单侧靶点3′端的最后一个碱基(对应于TALE中的最后0.5个重复单位)尽量选择T(因为天然存在的TALE家族蛋白的靶序列中末位为T的占大多数)(图4)。

(5)Spacer的选择：本方法采用的TALE重复序列与FokⅠ切割结构域之间相连接的氨基酸残基数

为63, 因此, Spacer的碱基数最好控制在12~21 bp。同时, 如果计划用酶切的方法检测TALEN的活性与效率, 还需要在Spacer中找到一个单一的限制性内切酶位点, 并且尽量让这个酶切位点位于Spacer的中间位置。

(6)靶点预测工具：可以通过Bogdanove实验室

第4期

沈延等: TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程 543 (包括起始载体和中间载体)进行测序验证, 则只要测序结果正确即可, 无论所得到的序列跟预期序列等同还是反向互补, 均可用于后续的组装步骤。

(2)为了尽量降低序列的重复性, 本实验室采用的TALE重复单元中除了RVD之外, 某些其它位点(例如第四位的氨基酸残基)的序列也有可能存在一些差异(例如第四位的氨基酸残基有可能为A、D或E), 但是并不影响使用(图10)。

图10 TALE重复单元中可变的氨基酸残基

(3)本方法(“单元组装法”)在载体构建上有一个独特的优点：载体构建过程中每一轮产生的中间载体(甚至酶切、回收的产物)都可以保留下来, 用于其他TALEN的构建。这样一方面可以避免重复构建中间载体, 另一方面可以节省时间和精力, 提高构建效率。TALEN载体构建得越多, 中间载体就会积累得越多, 这样新TALEN的构建效率也会越来越高。例如, 如果预先构建好全部16个双单元载体, 就可以直接从双单元开始构建TALEN, 而不需要从单载体开始, 这样就可以节省一轮的时间; 如果除了4个单载体之外, 还预先构建好全部的双单元(16个)、三单元(64个)和四单元(256个)载体, 那么只需要两轮就可以构建出16个完整的TALE重复单元, 比从单载体开始可节省一半的时间。 3.4 TALEN组装中的酶切问题

NheⅠ、SpeⅠ和HindⅢ等内切酶也可以选用其他公司的产品。根据我们的经验, 用NheⅠ和HindⅢ双酶切TALE重复序列载体时有时会出现多余的条带(预期应该只有一个条带), 这有可能是NheⅠ或HindⅢ的星活性造成的。如果出现这种情况, 建议改用NEB的HF(high fidelity)酶, 同时减少质粒的用量(例如<1 μg), 酶切时间也不要太长(例如控制在2 h之内)。 3.5 TALEN显微注射的问题

对于新构建的TALEN对, 可尝试注射不同的剂

量的mRNA, 从中选取一个最佳剂量用于制备斑马鱼突变体。一般而言, mRNA的注射量越大, TALEN作用的效率就越高, 不过, 斑马鱼胚胎的畸形率也会随之上升、存活率下降; 每半位点TALEN mRNA的注射剂量超过100 pg后胚胎畸形率的上升会更为明显。根据我们的经验, 剂量范围可控制在50~150 pg/半位点, 一般100 pg左右为最佳剂量, 可兼顾胚胎的存活率和TALEN的效率。在这个剂量下, 斑马鱼胚胎的存活率一般可达到90%以上。

4 结果示例与经验总结

本实验室在原来已发表的文章基础上, 增加了针对最后一位碱基(对应最后的0.5个TALE重复单

元)为A、C和G的FokⅠ载体, 并构建出了所有的三单元TALE载体(64个)和四单元TALE载体(256个), 这样既扩大了靶点的选择范围, 又可以节省载体的构建时间。目前, 本实验室利用单元组装法已成功构建了100多对针对斑马鱼不同基因组位点的TALEN, 经内切酶检测, 突变成功率大于70%(未发表数据), 这与Cade等[19]最近报道的结果类似。本实验室一半以上的TALEN位点的突变效率大于30%, 有的甚至接近100%, 这充分显示了在斑马鱼中应用TALEN技术的高效和简便。其中, 本实验室大部分未检测到活性的TALEN靶点的信息可参考EENdb网站(http://eendb.zfgenetics.org/)[10]。

斑马鱼性成熟一般需要3个月的时间。如果希望加快实验进度, 可以通过增加营养、改善饲养条件来缩短斑马鱼性成熟所需的时间。例如, 鱼的密度要适中, 在正常喂食之外加几次餐, 特别是晚上要加餐。如果饲养得当, 大部分雄鱼出生后两个月即可跟雌鱼杂交产生后代。最快甚至可以做到一个半月的雄鱼就开始用于交配、产生后代。在同等的饲养条件下, 雌鱼所需的性成熟时间要相对长一些。建议优先筛选雄性F0。根据我们的经验, TALEN的效率达到10%以上时, 一般最多筛选10个F0即可获得所需的突变。

打靶成功后, 建议至少保留两个不同的(indel)突变鱼系, 并且最好是造成不同的frame-shift突变, 以便相互印证突变表型。注意根据斑马鱼突变体和等位基因的命名规则为筛选到的鱼系和突变进行正确命名[20,21]。

如果得到了很重要的突变体, 建议考虑

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通过精子冻存的方法进行长期保种[22]。

附 录：补充材料见WWW.Chinagene.cn。

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本文来源：https://www.bwwdw.com/article/byj3.html