谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。??

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谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建

阮红04567896:;<=>977,"

（0浙江大学生命科学学院

杭州

?0##"@）德国）

（"A’>大学微生物与生物技术学系

摘要：通过目标基因内部缺失片段的获得以及/.)重组交换等技术的有效运用，在氨基酸

工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中，成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株，并通过了BCD和测序等方法的分析验证。关键词：谷氨酸棒状杆菌，基因缺失，/.)重组。中图分类号：E@$

文献标识码：)

文章编号：###032"#1（"##"）#!3#!F$3#@

谷氨酸棒杆菌（!"#$%&’()*&#+,-./,*(-+),-）是全球用以氨基酸发酵工业的主要生产

［0］

菌，早在01F@年由G<7&,8<-9首次描述其为谷氨酸产生菌。该菌为革兰氏阳性菌，严格好氧，不运动，不产生孢子，生物素营养缺陷型，HIC的含量为F?JKFFJ。!(./,*(-+0

而且也能生产赖氨),-和它的亚种!(1/(2,-和!(/()*"1&#-&%*,-等不仅能生产谷氨酸，

酸、苏氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等多种氨基酸。至今，氨基酸制品已被全球广泛地用于食品工业添加剂、动物饲料、化妆品、药品和其它工业制品。据统计，全球

［"，?］

每年谷氨酸和赖氨酸生产量分别为0######-和?#####-左右。

基因工程是近年来改良微生物代谢途径的十分有效方法，已有一些报道证实可以通［!K2］

过控制氨基酸合成途径中的某些重要基因的表达调控来实现氨基酸的定向合成。目

前对于谷氨酸棒状杆菌一系列功能基因及其调节基因的研究是国内外该领域的重要研究

［@］内容。在我们已获取了两个与碳源代谢调控功能相关的目标研究基因"#13和"#14的基础上，建立了谷氨酸棒杆菌染色体上这两个目标基因的定点缺失技术，这将为今后开展谷

氨酸棒杆菌中众多目标基因的定点缺失以及缺失菌株的相关功能研究方面提供广泛的技术支持和大力帮助。

!

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材料和方法

菌株和质粒

菌株、质粒及其相关特性见表0。基因序列来源

来自于本实验室与碳源代谢功能相关的两个目标研究基因开读框，已被暂命名为

它们全序列详见文献［@］。它们的功能尚有待于进一步研究确证。"#13和"#14，

"本课题由德国政府/))/奖学金和国家教育部联合资助

作者简介：阮红（012$年—），女，博士，从事微生物基因调控和生物活性成分研究。

收稿日期：修回日期："##03#$302，"##03003#0

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。??

?期阮红等：谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建

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菌株和质粒

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!"#培养基

用于!;"#$%培养的Q’（Q1*+"A’%*)"-+）培养基和5;3$’/16%"’6培养的Q’或IR!S培养基参照文献［&H］。根据实验要求，在培养基中加入>HO50Q卡那霉素。!;"#$%和5;#3$’/16%"’6分别置于GHT和G@T下培养。!"$%&’操作

［］

脱磷酸化和5;3$’/16%"’6总<LE抽提参照U+V0"--,等方法&&。质粒的酶切降解、

连接反应、低熔点琼脂糖电泳回收<LE、!;"#$%感受态细胞制备和电激转化等参照4"0A［&H］

。5;3$’/16%"’6的感受态细胞制备和电激转化参照W"-.%*7%,)等方#*99V等方法

［&I］法。<LE引物制备和样品测序由德国MXYA’+9)%(2EY公司测序中心完成。

(

("!

实验结果

!"#$或!"#%基因内缺失的%&’片段的构建和克隆

采用如图&所示方法：根据基因库中首先获取#,7.或#,78内基因缺失的<LE片段，

开读框#,7.或#,78及其上下游序列分别设计出各组四种引物6&、其中6I和6I、6G和6?，

（在其引物序列中以下划线标出），6G有I&#/A互补序列6&和6?有U(97Z酶切位点。以分别以6&、5;3$’/16%"’6野生菌的染色体<LE为模板<LE，6I为引物和以6G、6?为引物

进行常规6F7获得产物EA&I、再各自以产物为<LE模板，以6&和6?EAG?以及’A&I、’G?；为引物，采用!"[56J9A聚合酶（=3#"+.AEY4公司6*99:4/+-)%*!M试剂盒）进行F*9,,A98%*6F7反应可获得在#,7.或#,78的基因内缺失的<LE片段PA.E或PA.’。其中为#,7.缺失设计的四种引物6&、（>\AFFYYEE!!FFYYFYFF!FE!Y6I、6G和6?序列分别如下：EA6&

；（E!FYEF!FF!EE!FYEFFY!FY!!FEYAG\）EA6I；（>\A!Y!!!EEY!!!EY!YYYYYFEF!!F!!YEYYEYFEYF!F!E!!F!EYFAG\）EA6G；（>\AF!EYY!YE!YYEE!!FYEYEFFEEYYEFYFAG\）。为#,78FEEEYFEEFAG\）EA6?

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。??

%;:微生物学报%#卷

缺失分别设计出的四种引物!"、（()’**++,,--**++!#、!$和!%序列分别如下：&’!"

；（()’***,-**,*-,,,*--,,+-,*--,**+-*,*+++-++,+,,,*-*-+’$)）&’!#；（,-++-*,,+*,-+*-++**,,,-++--+-*’$)）&’!$

；（()’**++,,--**++*,+++++,-**-++-+,-+,+++*,+,--+--*-,+’$)）&’!%。*./00’/12.!*3的反应条件为：*--**-+-**---+**,-*++*+*’$)）4%5#678!#(9

（4%5$:0!;:5$:0!<#5"678!<#5":678!%5）。$:个循环

由常规!*3获得产物,’"#（%=:>?）和,’$%（%<">?），由*./00’/12.!*3再获得!"#$内

缺失的@A,片段B’C,（4$:>?）；由常规!*3获得&’"#（%<">?）和&’$%（%=$>?），再由*./00’（4$$>?）；进一步将B’C,和B’C&经&’!3D酶切后分/12.!*3获得!"#%内缺失的片段B’C&别克隆到基因取代载体?E"46/>0FG&中，在&H’!()@I(!中构建了重组质粒?E"4’C,和电泳结果见图#和图$

。?E"4’C&，

图1!"#$23/!"#%基因内缺失片段的获得

B7JH#*/80K.PGK7/8/M!*3?./CPGKQ7KNC2L2K78J78K2.8FL.2J7/8/M!"#$F8C!"#%

@A,6F.S2.；"：,’"#；#：,’$%；$：&’"#；%：&’$%；R：

(：B’C,；;：

B’C&H

161

)6*+,-./01,/中!"#$或!"#%基因缺失菌株的构建

采用基因重组交换技术（见图%）。将已克隆的重组质粒

［］

分别导入野生型菌?E"4’C,和?E"4’C&通过高效电激转化"#，

株中进行@A,重组；载体含有E63基因，在含卡那霉素的培养基进行初次筛选以获得第一次重组，即载体@A,在野生型染色

体上的定点整合；由于载体又含有*+’%基因，不能使菌体在含

因此以蔗糖为基质进行再次筛选可排":U蔗糖的基质上生长，

图4

和&’!5&(%

除载体@A,，载体与染色体@A,发生第二次重组，并不再具有

重组质粒&’!5&($卡那霉素抗性；其中再重组结果将因重组位点的差异而不同，通

过!*3方法可筛选和鉴定基因缺失突变子，其中获得较小!*3

产物（大小为4$:或4$$>?）的菌株为相应的基因缺失突变子。在获得!"#$和!"#%单基因缺失菌株的基础上，任选其一的

制备感受态细胞，然后将相应不同!"#$或!"#%单基因缺失菌株，

的重组质粒?E"4’C&或?E"4’C,导入菌株，采用图%方法重组整

B7JH$32G/6>78F8K?LF067C0

?E"4’C,T?E"4’C&R："S>’LFCC2.；"：?E"4’C,C7J20K’2CQ7KN&’!3D；#：?E"4’C&C7’J20K2CQ7KN&’!3DH

合和筛选技术，获取在原单基因缺失基础上的双重基因缺失株。以其染色体@A,或直接

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。??

期阮红等：

谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建

细胞悬液为检测模板，进行两组引物（!"#$和!"#%）、（&"#$和&"#%）下的#’(反应，检验

是否都生成各自)*+,-.的小片段，如两组都检测到)*+,-.#’(小片段的即为双基因缺失菌株。!"#

!"#$或!"#%基因缺失菌株的$%&分析

以野生型生长菌!/"#$%&’()$’$,),012相对照，对获得第一次重组菌（!/"#$%&’(*

和单基因缺失菌株（!/"#$%&’()$’$,),0!)$’$,),0345!和!/"#$%&’()$’$,),0345&）!和

，用各自+,-.和+,-/对应的两组引物（!"#$和!"#%）（&"#$和&"、!/"#$%&’()$’$,),0!&）

进行#’(检测。如图6所示，野生型菌株!/"#$%&’()$’$,),012获得#’(产物约在#%）

$*6-.或0*,-.大小；+,-.和+,-/各自的单基因缺失突变株!/"#$%&’()$’$,),0!!和!/

对仅第一次重组菌进行#’(检测，发"#$%&’()$’$,),0!&获得#’(产物约)*+,-.大小；

现它们同时存在两种#’(产物（!/"#$%&’()$’$,),0345!有$*6-.和+,).7大小片段，!/。以上#’(检测结果（图6）与期望的"#$%&’()$’$,),0345&有0*,-.和+,,.7大小片段）一致，

表明缺失突变的方法和获得的缺失菌株是可靠的。

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。??

卷

图!!"#$和!"#%基因缺失株的"#$分析鉴定

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通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。??

S期阮红等：

谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建S5’

此外，对单基因缺失菌株基础上发展的双基因缺失菌株，采用两组引物的!"#反应

来检测和筛选，均获得了$%&’()两组!"#产物。!"#

测序分析结果

进对!"#$和!"#%的基因缺失菌株&*’()*+,-.),+’$’,!-和&*’()*+,-.),+’$’,!.，

［1］

行染色体/0-上的定点序列测定，对照基因库序列和基因缺失菌株设计方案，定点序列测定结果显示（图5）基因!"#$和!"#%/0-缺失区域的序列准确率为&&%234+$$3，内已经获得了预期的定点缺失。

$讨论

利用基因缺失技术进行目标基因功能的定向研究，是国内外基因功能研究的重要手

［+’6+7］

段和可靠依据。采用开读框内定点缺失技术和染色体上/0-整合重组技术，我们在谷氨酸棒杆菌&*’()*+,-.),中成功建立了两个目标基因!"#$和!"#%的染色体定点缺

失方法，该方法具有技术应用的普遍性，可以指导开展该菌株内众多功能基因的定向缺失研究，特别对于目前有关该菌株代谢中调控基因的研究方面，更是值得借鉴。在筛选到的转座子插入突变菌株中，获得了与葡萄糖和乙酸盐等碳源代谢相关的目标研究基因!"#$

［1］

和!"#%。通过本研究建立了这两个目标基因的单基因缺失株和双基因缺失株，这些为我们进一步分析研究缺失菌株在碳源代谢中的功能变化提供了必要的准备。

目前主要围绕!"#$和!"#%基因缺失菌株与野生型菌株的生理功能方面，进行一些生长特征的比较和一些代谢酶的酶学特性分析研究。至今尚没有发现它们在葡萄糖和乙酸等不同碳源上生长特性的明显差异，葡萄糖和乙酸代谢途径中一系列相关酶的酶学特征还在进一步的调查中，此外，这两个基因的过量表达菌株正在构建中，该两个目标基因是否对于谷氨酸棒杆菌碳源代谢及其调控作用有积极的意义，尚有待进一步验证，深入系统的研究在进行中。

参

考

文

献

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通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。??

LML微生物学报L4

卷

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