第五章 酶类药物

第五章酶类药物

第一节药用酶概述

酶是生物催化剂，在生理pH值和温度下具有高度专一的催化活性，能迅速产生高效的特异性反应，随着科技的发展，酶类药物大大地应用到治疗上，如神曲和麦芽等药物，含有能降解糖、脂肪与蛋白质的水解酶，可以用于帮助消化，近几十年来，酶类药物在治疗上有较大的进展。大多数酶制剂为口服剂型，现能由于注射的酶制剂只有细胞色素C、纤溶酶等少数几种。

目前对药用酶的研究热点是，在维持活性状态下的酶蛋白能否被吸收，如何减少药用酶的抗原性问题及新型药用酶的研究等。

一、酶类药物应具备的条件：

①在生理pH值下（中性），具有最高活力和稳定性。如大肠杆菌谷氨酰胺酶最适pH值为5.0，在生理pH值时基本没有活性，所以不能用于人类疾病的治疗。

②对基质（作用的底物）有较高的亲和力。酶的Km值较低时，只需要少量的酶制剂就能催化血液或组织中较低浓度的基质发生化学反应，从而高效发挥治疗作用。

③血清中半衰期较长。要求药用酶从血液中清除率较慢，以利于充分发挥治疗作用。

④纯度高，特别是注射用的纯度要求更高。

⑤免疫原性较低或无免疫原性。酶是蛋白质，所以酶类药物都不同程度存在免疫原问题，可以对酶进行化学修饰降低免疫原性，或者寻求制备免疫原性较低或无免疫原性的酶。

⑥最好不需要外源辅助因子的药用酶。有些酶需要辅酶或ATP和金属离子方能进行酶反应，在治疗中常常受到限制。

二、药用酶的分类及应用

（一）促进消化酶类：为最早的医用酶，包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等水解酶，乳糖酶。

（二）消炎酶类：溶菌酶，核酸酶等可以移去血块治疗血栓静脉炎等疾病。

（三）与治疗心脑血管疾病有关的酶类：纤维蛋白溶解酶、尿激酶等，这类酶对于溶解血栓有独特效果，可以促进血块溶解，防止血栓的形成。

（四）抗肿瘤的酶类：通过破坏肿瘤细胞所需的代谢物来抑制其生长，L-天冬酰胺酶，可以治疗白血病。

（五）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类：链激酶，尿激酶等，血纤维在血液的凝固与解凝过程中有重要作用，提高血液中蛋白水解酶的水平，助于促进血栓的溶解。

（六）其他治疗酶：细胞色素C参与生物氧化的一种有效的电子传递体，用于组织缺氧治疗的急救和辅助用药。

第二节 酶类药物的制造过程

酶制备的步骤：

①酶的原材料的选择和预处理。

②酶的提取与纯化。

③酶活性的测定和纯度检测。

一、酶类药物的原料选择

酶作为生物催化剂普遍存在于动植物和微生物中，可直接从生物体分离获得。酶可以通过化学合成法合成，但由于各种因素的限制，目前药用酶的生产主要是直接从动植物种提取、纯化和利用微生物发酵生产。 近10多年来，动植物细胞培养技术取得了很大的进步，但因为周期长，成本高等问题，实际应用还有一定困难。目前工业大规模生产一般都是以微生物为主要来源

（一）动物类或植物类原料

1、选用材料注意事项：

（1）选择含有效成分高的动、植物及不同的器官和组织。提取不同的酶，原料选择有很大的区别

（2）注意不同生长发育情况及营养状况。动物与年龄、性别和饲养条件有关，植物注意生长的季节，选择最佳采集时间。

（3）原料来源丰富、易得。

（4）提纯步骤简便易行。动物去结缔和脂肪组织，冷冻储存，植物，择时采集，并就地去除不用部分，有用部分保鲜处理。原料储存法有：冷冻法、有机溶剂脱水法、防腐剂保险等。

2、动物材料的预处理

（1）机械处理 （2）反复冻融

（3）丙酮粉组织经过丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使得蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到溶液中。

3、微生物的预处理

要是胞外酶，则除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶。但对胞内酶则需要将菌体细胞破壁，制成无细胞的悬浮液后再行提取。

（1）干燥法：空气干燥、真空干燥、冷冻干燥

（2）机械法：研磨法、组织匀浆、超声波法、高压匀浆法

（3）酶法处理

（二）微生物发酵法生产酶类药物

1、微生物酶制剂高产菌株的选育

（1）酶制剂生产菌的要求：

①产酶量高，酶的性质应符合使用要求；

②不是致病菌，不产毒素；

③稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；

④能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。

（2）获取优良菌株有三种途径：

①从自然界分离筛选。自然界是产酶菌种的主要来源，筛选产酶菌的方法与其他发酵微生物的筛选方法疾病一致，包括菌样采集、菌种的分离与初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等步骤。

②用物理或化学方法处理、诱变。X射线照射等等。

③用基因重组与细胞融合技术，构建性能优良的工程菌。同源重组等。

2、生物酶制剂的生产发酵技术

（1）培养基组成

碳源、氮源、无机盐、生长因子和产酶促进剂

（2）培养方式：

固体培养：固体培养法亦称麸曲培养法 ，该法是利用麸皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基 。

液体培养：液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为液体表面培养和液体深层培养两种。

3、影响酶产量的因素

（1）温度：一般发酵温度比种子培养时略高些，这样对产酶有利。

（2）发酵的pH：可用糖或淀粉调节，pH低则可用氨来调节。一般pH值为4-6.

（3）通气：（供氧）临界氧浓度 。氧必须是溶解于培养基中的氧 。

（4）搅拌：增加液体湍流速度 ，减少气泡周围液膜厚度 。有利于促进细胞的新陈代谢。

（5）和消泡剂：发酵过程中，由于发酵液受到强烈的通气搅拌，培养基中某些成分的变化及代谢中产生气体，会形成较多的泡沫，而且气泡不易消失，是由于培养基中蛋白质分子排在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故。

消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸类，胺类，酰胺类，磷酸酯类，金属皂类，聚硅氧烷等。

（6添加诱导剂和抑制剂：诱导酶诱导酶的合成，诱导酶是该酶作用底物或者是其类似物。抑制剂促进酶的形成 。加入适量表面活性剂 。

二、酶类药物的提取和纯化

1、酶的提取

（1）水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取，经过预处理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒，丙酮粉都可用水溶液抽提。

水溶液的pH选择对抽提具有影响，应考虑的因素有：

① 酶的稳定性

② 酶的溶解性

③ 酶与其他物质结合的性质

④ 选择pH的总原则是，在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的适当的pH。

（2）有机溶剂法 某些结合酶，由于和脂质结合牢固，需用有机溶剂除去脂质，且不能使酶变性。常用有机溶剂是丁醇。

① 丁醇性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂与水分子间能起表面活性剂的桥梁作用。

② 丁醇提取方法：均相法和两相法

（3）表面活性剂法表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故可用于提取结合酶。

2、酶的纯化

不同的酶，因性质不同，其纯化工艺可能有很大不同。

评价一个纯化工艺好坏，主要看两个指标：酶比活和总活力回收率。

纯化过程中的技术难点：

（1）杂质的除去酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等 。

① 调pH和加热沉淀法

② 蛋白质表面变性法利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡，

可以除去杂蛋白。

③ 选择性变性法利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。

④ 降解或沉淀核苷酸法用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于离心分离。用核酸沉淀剂

如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等

⑤ 利用结合底物保护法除去杂蛋白酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，热稳定性大大提高，这样

就可用加热法除去杂蛋白。

（2）脱盐

① 透析

② 凝胶过滤

（3）浓缩

① 冷冻干燥法

② 离子交换法

③ 超滤法

④ 凝胶吸水法

（4）酶的结晶

① 酶的结晶方法 酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。 盐析法：操作要在低温下进行，加盐，缓冲液pH要接近酶的等电点。多数酶就可形成结晶。有时也可交替置在4℃冰箱中和室温下来形成结晶。

有机溶剂法：一般要含少量无机盐的情况下，选择使酶稳定的pH，缓慢地滴加有机溶剂 。使用的缓冲液一般不用磷酸盐，而用氯化物或乙酸盐。

复合结晶法：有时可以利用某些酶与有机化合物或金属离子形成复合物或盐的性质来结晶。

透析平衡法、等电点法

② 结晶条件的选择

酶液的纯度：酶的纯度越高，结晶越容易，长成大的单晶可能性也越大。结晶对酶有明显的纯化

作用。

酶的浓度

温度：结晶的温度通常在4℃下或室温25℃下，低温条件下酶不仅溶解度低，而且不易变性。 时间：结晶形成的时间,数小时到几个月，有的甚至需要1年或更长时间。一般来说，较大而性能

好的结晶是在生长慢的情况下得到的。一般希望使微晶的形成快些，然后慢慢地改变沉淀条件，再使微晶慢慢长大。

pH:

晶种：不易结晶的蛋白质和酶，有的需加入微量的晶种才能结晶

结晶器皿处理：结晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用结晶母液再冲洗一次。 结晶的玻璃

器皿，可用硅涂料进行表面处理，以使表面光滑且不润湿。这样可减少晶核数目 ，形成大的结晶。

（5）酶分离和纯化中应注意的问题

① 防止酶蛋白变性

② 防止辅助因子流失

③ 防止酶被蛋白水解酶降解

第三节 重要酶类药物

一、胃蛋白酶

广泛存在哺乳动物、鸟类、爬虫类及鱼类的胃液中，以酶原的方式存在于胃底的细胞里。

（一）化学组成与性质

药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原酶等，为粗制的酶制剂。水溶液呈酸性，难溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。

pI为pH1.0，最适pH1.5～2.0。可溶于70％乙醇和pH4的20％乙醇中。

胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物。

（二）生产工艺

1、工艺流程

2、工艺过程及控制要点

① 酸解，过滤

② 脱脂，去杂质

③ 浓缩，干燥

3、胃膜素和胃蛋白酶联产工艺

① 胃膜素也是从猪胃粘膜中提取的一种黏蛋白。胃膜素水溶液能被60%以上的乙醇或丙酮沉淀，所

以可利用提取胃膜素的母液制备胃蛋白酶。

② 联产工艺：向分离胃膜素的母液中，边搅拌边加冷丙酮，至相对密度0.91，既有淡黄色胃蛋白酶

沉出，静置过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。

4、结晶胃蛋白酶的制备

（三）质量控制

1、质量标准：

2、活力测定

二、胰蛋白酶

（一）组成和性质

胰蛋白酶是从牛、羊胰脏提取、结晶的冻干制剂。易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂。在pH1.8时，短时煮沸几乎不失活；在碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有保护和激活作用，胰蛋白酶的pI为10.1。 牛胰蛋白酶在肠激酶或自身催化下，释放出6肽，变成有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶分子量24000，由223个氨基酸残基组成。

胰蛋白酶专一作用于由碱性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所组成的肽键。酶本身很容易自溶。

（二）、生产工艺

（1）工艺路线

（三）检验方法

（1）质量标准

①性状白色或类白色结晶性粉末。

②澄清度本品10mg加蒸馏水或生理盐水1ml完全溶解。溶解应完全澄清。

③pH 0.5%的水溶液pH为5~7。

④干燥失重真空干燥到恒重，失重不得超过8%。

⑤糜蛋白酶限度检查不得超过5%。

（2）活性测定

三、尿激酶

是一种碱性蛋白，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中。人尿中平均含量5-6IU/mL。临床上尿激酶已经广泛用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。

（一）结构与性质

① 存在多种相对分子质量形式，主要的有31300、54700两种。

② 尿中存在尿胃蛋白酶原，酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，可以把分子量54700的天然尿激

酶降解成分子量31300的尿激酶。

③ 尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必须氨基酸。

④ 尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，尿激酶也有酯酶活力。

⑤ 尿激酶PI为8-9，溶液中不稳定，冻干可稳定数年。

（二）生产工艺

1、工艺流程

（三）质量控制

成品为白色或米色澄清溶液或白色冻干粉。

每毫克蛋白的酶活力不得低于120000 IU。

尿激酶活力测定方法：

（1）气泡上升法

① 试剂：血纤维蛋白原溶液、牛凝血酶溶液、血纤维溶酶原溶液、尿激酶标准品溶液。

② 反应体系：四种溶液的混合体系。

③ 操作：12 mm*75 mm小试管，置于冰水浴中，依次加入上述溶液，迅速搅拌，立即置于37度水浴

保温。反应体系应在30-45s凝结，凝块内有小气泡生成。当凝块溶解时，气泡逐渐上升，在气泡上升到反应体系体积一半时作为反应终点。

④ 标准取消：以酶浓度为纵坐标，凝块溶解时间为横坐标，绘制标准曲线。

样品测定：被测样品稀释成10-20IU/ML，同以上操作，根据凝块溶解时间，从标准曲线查得样品的活力单位。

（2）平板法

四、超氧化物歧化酶（SOD）

SOD是一种重要的氧自由基清除剂，能专一清楚超氧阴离子自由基。

目前SOD临床应用集中在自身免疫性疾病上，也可用于抗辐射，抗肿瘤，治疗氧中毒，心肌缺氧

与缺血再灌注综合症一级某些心血管疾病。

SOD属于重金属酶，广泛存在于动植物、微生物细胞中。

（一）结构和性质

SOD的性质不仅取决于蛋白质部分，还取决于活性中心金属离子的存在，金属离子种类不同，SOD的性质有所不同，其中Cu，Zn-SOD与其他两种SOD差别较大，而Mn-SOD与Fe-SOD之间差别较小。

1、SOD活性中心和构象

2、SOD的理化性质

SOD是一种金属蛋白，因此它对热、pH及其在某些性质上表现出异常的稳定性。

（1）热稳定性

（2）pH对SOD的影响

在pH=5.3-10.5范围内对SOD活性不受影响。

pH=3.6时SOD中Zn要脱落95%。

pH=12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变，从而导致酶活性丧失。

（3）吸收光谱

取决于酶蛋白和金属辅基。

紫外光谱区：250 nm-270 nm

可见光区：680 nm

4、金属辅基与酶活性

Cu与Zn的作用是不同的

Zn仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关。

Cu与催化活性有关，透析除去Cu则酶活性全部丧失，一旦重新加入Cu，酶活性又可以恢复。

（二）生产工艺

1、收集红细胞

2、溶血、去血红蛋白

3、沉淀、热变性

4、柱层析

5、冷冻干燥

（三）检测方法

1、SOD的纯度鉴定

（1）均一性

（2）酶比活

（3）理化性质

2、SOD活性测定

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