8哺乳动物表达系统

哺乳动物基因工程

基因工程1 基因工程的基本概念 2 基因工程的基本原理 3 基因工程所需的基本条件 4 基因工程的操作过程 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 6 大肠杆菌基因工程 7 酵母基因工程 8 哺乳动物基因工程

9 高等植物基因工程

8 哺乳动物基因工程A 高等哺乳动物基因工程的基本概念 B 高等哺乳动物的受体系统 C 高等哺乳动物的载体系统 D 高等哺乳动物的基因转移 E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白

8 哺乳动物基因工程A 高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物转基因技术 高等哺乳动物细胞基因表达技术

转基因动物个体 哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型 人体基因治疗

动物工程细胞 蛋白多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型

8 哺乳动物基因工程B 高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物细胞的生长特性 高等哺乳动物受体细胞的条件 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 常用的高等哺乳动物受体细胞

高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构 上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代 且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞 会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状

态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。

高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件

细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大规模培养 遗传稳定性 合适的标记 生长快且齐 安全性能好 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 便于转化株的筛选和维持 分裂周期短，生长均一，便于控制 不合成分泌致病物质，不致癌

大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能 满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞嘌呤核苷酸生物合成途径5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)

嘧啶核苷酸生物合成途径

从头合成途径

氨基喋呤(AP) 尿嘧啶核苷一磷酸(UMP) 氨基喋呤(AP)

GMP

次黄嘌呤核苷一磷酸(HMP)次黄嘌呤磷酸 核糖转移酶

AMP

胸腺嘧啶核苷一磷酸(TMP)(TK) 胸腺嘧啶 核苷激酶

(HPRT) 补救合成途径 次黄嘌

呤核苷(HR)

胸腺嘧啶核苷(TR)

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)编码基因缺陷的受体细胞(tk -)

不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上(HAT培养基)生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)编码基因缺陷的受体细胞 (hprt -)

不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上(HAT培养基)生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补

高等哺乳动物受体细胞的遗传标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记 APHDHFR HPH编码产物 氨基糖苷磷酸转移酶 二氢叶酸还原酶 潮霉素B磷酸转移酶 筛选药物 G418 氨甲喋呤 潮霉素B 作用机理 APH灭活G418 DHFR变体抗氨甲喋呤 HPH灭活潮霉素B

TK-

胸腺嘧啶核苷激酶

氨基喋呤

TK合成TMPXGPRT合成GMP

XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸 ADA腺嘌呤核苷脱氨酶

腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A

常用的高等哺乳动物受体细胞迄今为止，用于医疗用品(药物、抗体、诊断试剂)大规模生产

的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞(CHO),其优势有如下几个方面：

遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞(GRAS)

8 哺乳动物基因工程C 高等哺乳动物的载体系统人腺病毒DNA 猴空泡病毒DNA(SV40)

人乳多瘤病毒DNA(BKV)人牛痘病毒DNA

人腺病毒DNA腺病毒的生物学特性 腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体 ，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。 目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的

主要是C亚属的2型(Ad2)和5型(Ad5)病毒。腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目

动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。

人腺病毒DNA腺病毒的基因组DNAIVa2 ITR VA L1 L2 L3 L4 L5 ITR

E1

E2

E3

E4

腺病毒基因组DNA全长36 kb,其包装上限为原基因组的105%, DNA两端各有 一个反向重复序列(ITR);E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的 表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期 基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒 的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段， 使得载体的装载量提高到4 kb以上。

人腺病毒DNA腺病毒DNA载体的特点 基因重排低 外源基因与病毒D

NA重组后能稳定复制几 个周期 安全性能好 不整合人的染色体DNA,不会导致恶性肿 瘤 宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格 使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达

猴多瘤病毒DNA(SV40)SV40的生物学特性

SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体,由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为

5224bp的双链环状DNASV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核 小体的微型染色体结构。 SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类 动物后，便发生非同源整合而致癌。

猴多瘤病毒DNA(SV40)SV40的基因组DNA t / T基因编码病毒的小抗 原和大抗原与病毒的致癌作用 密切相关 SV40在裂解宿主细胞前的晚 期状态时，每个宿主细胞含有 105个病毒DNA拷贝，因此十分 适合用于高效表达外源蛋白ori tVP2VP3

T

SV40 DNA

VP1

猴多瘤病毒DNA(SV40)SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建重组的SV40 DNA分子必须经过 包装后才具有感染能力，因此插入的 外源DNA片段不能太大。为了尽量提 高SV40的装载量，必须删除一些基因 片段，因此重组的SV40分子必须与野 生型病毒共感染受体细胞，才能形成 有感染力的重组病毒颗粒。pBR322 SV40 ori ori pV2-GPT gpt

pBR322Apr

SV40viral gene

pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其 中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该 载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.

猴多瘤病毒DNA(SV40)利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序病毒晚期基因启动子 插入外源基因 SV40 载体 重组分子 筛选 增殖 转化

去除细菌序列筛选标记

ori 分离病毒DNA

感染

缺陷的SV40 辅助病毒

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