六味地黄丸预防激素性股骨头缺血性坏死的 分子机制研究

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Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, April 2010, Vol. 24, No.4

2 李卫华1，

王晓2 刘冰山2 张永乐2 邓锦波1 孙国涛1

【摘 要】 目的 激素性股骨头缺血性坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）防治效果不理想，探讨六味地黄丸预防ONFH的可行性及分子机制，为预防激素性ONFH提供实验依据。 方法 取成年健康昆明小鼠36只，体重40～50 g，平均46 g，随机分为3组（n=12）：空白对照组（A组）、马血清/激素组（B组）、马血清/激素/六味地黄丸组（C组）。B、C组均2次腹腔注射马血清，2次剂量分别为10 mL/kg及5 mL/kg，间隔2周；第2次注射马血清同时肌肉注射醋酸泼尼松龙45 mL/（kg·d），共5 d，制备激素性ONFH小鼠模型。于应用激素同时B组灌服生理盐水10 mL/（kg·d），C组灌服六味地黄丸2 g/（kg·d）；A组同时间点肌肉注射及灌服等量生理盐水。观察小鼠一般情况，于第1次激素注射后2、4、8周处死小鼠，大体观察股骨头情况，取双侧股骨头及肝脏行组织学及免疫组织化学染色观察，TUNEL法检测细胞凋亡情况。 结果 B、C组分别于第2次腹腔注射马血清后死亡2只及1只小鼠，余小鼠均存活至实验完成。3组各时间点股骨头外观、形态及关节软骨面均正常。组织学观察示A组各时间点肝脏及股骨头均正常。B组第1次激素注射后2周肝细胞肿胀，细胞内可见小脂肪空泡，肝索结构不清，肝窦变窄；股骨头区骨小梁纤细、稀疏，部分可见断裂；且随时间推移，变化愈显著。C组各时间点肝脏及股骨头与A组相似。B组股骨头空骨陷窝率高于A、C组（P < 0.01），A、C组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。免疫组织化学染色观察，各时间点B组与A、C组比较，股骨头骨保护素局部表达阳性率下降，骨保护素配体局部表达阳性率上升，差异均有统计学意义（P < 0.01）。细胞凋亡检测示B组较A、C组骨细胞凋亡指数显著升高，差异有统计学意义（P < 0.01），A、C组间2、4周比较差异有统计学意义（P < 0.05），8周差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 六味地黄丸具有改善骨代谢、保护骨细胞、降脂等作用，可通过抑制小鼠股骨头局部骨细胞凋亡、拮抗激素影响股骨头内骨保护素/骨保护素配体表达，起到预防早期激素性ONFH的作用。【关键词】 激素性股骨头缺血性坏死 六味地黄丸 骨保护素 骨保护素配体 小鼠中图分类号： R684 R285.6

文献标志码：A

PREVENTING STEROID-INDUCED OSTEONECROSIS OF THE FEMORAL HEAD WITH LIUWEI DIHUANG PILLS

1, 222211

AND MOLECULAR MECHANISM/LI Weihua, WANG Xiao, LIU Bingshan, ZHANG Yongle, DENG Jinbo, SUN Guotao. 1

The Institute of Neurobiology, Medical School, Henan University, Kaifeng Henan, 475004, P.R.China; 2Department of Orthopaedics, Objective To evaluate the effects and the molecular mechanism of Liuwei dihuang pills in preventing 【Abstract】

Huaihe Hospital, Affiliated to Henan University. Corresponding author: SUN Guotao, E-mail: guotao_sun@http://www.77cn.com.cn

steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (ONFH) so as to provide an expremental basis for preventing ONFH clinically. Methods Thirty-six adult Kunming mice (weighing 40-50 g, 46 g on average) were randomly divided into three groups (n=12): group A (control group), group B (model group) and group C (prevention group). In groups B and C, ONFH mice models were produced by intraperitoneal injection of horse serum at first (10 mL/kg) and a second injection of horse serum intraperitoneally (5 mL/kg) and prednisolone intramuscularly [45 mL/(kg day), for 5 days] 2 weeks later. At the same time, the mice in group C were given Liuwei dihuang pills intragastrically [2 g/(kg day)] and were given normal saline [10 mL/(kg day)] in group B. In group A, mice were given normal saline intramuscularly and intragastrically as controls. The animals were sacrificed 2, 4, and 8 weeks after first treatment with prednisone, and femoral heads and livers were harvested to do histopathology analysis and apoptosis assay. Results Other mice survived throughout the experiment period except two death at 7 and 11 days after second injection of horse serum intraperitoneally in group B and one death at 24 hours after second injection of horse serum intraperitoneally in group C. The appearance and shape of the femoral head and the surface of cartilages were all normal. The histological observation showed: normal structures of liver and femoral head were seen in group A at each time point; swelling liver cells with small fat vacuole, unclear structure of hepatic cords and narrower sinus hepaticus were seen, the bone trabeculae of femoral head was thin, sparse and collapsed in some regions and the changes became more obvious with time in group B;

30771140）基金项目：国家自然科学基金资助项目（30800175、

1 河南大学医学院神经生物学研究所475004）2河南大学淮河医院骨科作者单位：（河南开封，；

E-mail: guotao_sun@http://www.77cn.com.cn通讯作者：孙国涛，副教授，硕士导师，研究方向：疾病分子机制与防治研究，

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group C had similar results to group A. The percentage of empty osteocyte lacunae was significantly higher in group B than in groups A and C (P < 0.01). The osteoprotegrin expression significantly decreased and the osteoprotegrin ligand expression significantly increased in group B when compared with groups A and C (P < 0.01). Apoptosis analysis showed that the apoptosis index in group B was significantly higher than that in groups A and C (P < 0.01). Conclusion Liuwei dihuang pills can prevent steroid-induced ONFH by improving lipid metabolism, releiving bone lesion, and protecting against cell death. 【Key words】 Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head Liuwei dihuang pills OsteoprotegerinOsteoprotegerin ligand Mice

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (30800175, 30771140）

股骨头缺血性坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由于多种因素破坏股骨头血供从而导致骨细胞和骨髓细胞死亡的一种病理过程，是骨科常见病和疑难病。长期或大剂量使用糖皮质激素，尤其是治疗自身免疫性疾病所诱导的ONFH发病率呈逐年上升趋势，居非创伤性ONFH的首位[1-3]，而器官移植术后因服用糖皮质激素造成的ONFH达8%～22%[4]。目前ONFH临床治疗进展缓慢，往往出现坏死才进行治疗，疗效较差，最终大多需行人工全髋关节置换。因此，干预、阻断使用激素导致的ONFH进展，具有重要意义。中医认为“肾藏精，精生髓，髓滋养骨”，六味地黄丸为“滋阴补肾”的经典良方，因此临床上常用六味地黄丸治疗骨质疏松和ONFH，并取得较好疗效[5]。本实验采用免疫相关的激素性ONFH小鼠模型，应用六味地黄丸干预，对其效果和分子机制进行探讨。1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料、仪器

健康成年昆明小鼠36只，雌雄各半，体重40～

50 g，

平均46 g，由河南省实验动物中心提供。马血清（Invitrogen公司，美国）；醋酸泼尼松龙（浙江仙琚制药股份有限公司）；六味地黄丸（河南宛西制药有限公司）；骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、骨保护素配体（osteoprotegerin ligand，OPGL）抗体（武汉博士德生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（herseradish peroxidase，HRP）标记二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物工程有限公司）。RM2135石蜡切片机（Leica公司，德国）；光学显微镜（Olympus公司，日本）。1.2 实验分组及方法

将36只小鼠随机分为3组（n=12）：空白对照组A组）、马血清/激素组（B组）、马血清/激素/六味地黄丸组（C组）。参照熊明月等[6]的激素性ONFH造模方法并改进，取B、C组小鼠按10 mL/kg腹腔注射马血清，间隔2周后按5 mL/kg再次腹腔注射马血清，第2次注射马血清同时肌肉注射醋酸泼尼松龙

45 mL/（kg·d）

，共5 d，制备激素性ONFH小鼠模型。于应用激素同时B组灌服生理盐水10 mL/（kg·d），

C组灌服六味地黄丸2 g/（kg·d）。A组小鼠不制备模型，于同时间点肌肉注射和灌服等量生理盐水。于第1次激素注射后2、4、8周，各组随机取3只小鼠，2%苯戊二钠（10 mL/kg）腹腔注射麻醉后，10%多聚甲醛40 mL心脏灌注固定，取肝脏组织、双侧股骨头进行观察。

1.3 观测指标1.3.1

一般情况 观察注射马血清后各组动物食量、

步态及精神状况。

1.3.2 大体观察 取材后观察各组股骨头外观及关节软骨面情况。

1.3.3 组织学观察 将肝脏组织及双侧股骨头置于10%多聚甲醛溶液中固定24 h后，肝脏组织梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，5 μm厚切片，行HE染色观察；股骨头用盐酸、硝酸、甲酸、三氯化铝配置的混合脱钙液脱钙24 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，取部分标本切片，厚4～5 μm，行HE染色观察。光镜下观察骨小梁、骨细胞、髓腔脂肪细胞的变化，计数100个骨细胞，计算空骨陷窝所占百分比（空骨陷窝率）。

1.3.4 免疫组织化学染色观察 取部分股骨头石蜡包埋块切片，厚4 μm，于60℃烤箱烤片3 h，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水合，加3%H2O2反应30 min，PBS漂洗3次，微波抗原修复10 min，PBS漂洗，10%山羊血清封闭30 min，OPG、OPGL一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗，滴加HRP标记二抗室温反应3 h，PBS漂洗，DAB显色10 min，PBS漂洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。同一切片任选5个视野，计数100个骨细胞中含棕黄色颗粒阳性细胞所占比例，取其平均值，即为阳性率。

1.3.5 细胞凋亡检测 按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明方法操作，取部分股骨头石蜡切片行蛋白酶K处理，TdT酶进行DNA断裂末端的生物素标记反应，与HRP标记的链亲和素特异性结合，DAB显色，苏木素复染，光镜下观察，计数100个骨细胞中细胞核染色成棕色颗粒的阳性细胞数目，取其平均值，即为凋亡指数（apoptosis index，AI）。

（

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1.4 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件包进行分析。数据以均

少见（图2 c）。各时间点B组空骨陷窝率与A、C组比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）；A、C组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；见表1。2.4 免疫组织化学染色

A组各时间点OPG棕黄色颗粒多见，OPGL棕黄色颗粒较少，阳性率无明显改变。B组第1次激素注射后2周，OPG棕黄色颗粒偶见，阳性率较A组明显降低；OPGL棕黄色颗粒较多，阳性率较A组明显升高；4、8周OPG阳性率降低及OPGL阳性率升高有增加趋势。C组各时间点OPG棕黄色颗粒多见、OPGL棕黄色颗粒较少，随时间延长，阳性染色率稍升高和降低。见图3、4。各时间点B组OPG、OPGL阳性率与A、C组比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）；A、C组间OPG阳性率第2周时差异有统计学意义（P < 0.05），第4、8周时差异无统计学意义（P > 0.05）；A、C 组间OPGL阳性率第2、4 周比较差异有统计学意义（P < 0.05），第8 周差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。2.5

细胞凋亡检测

B组各时间点均可见细胞核中出现较多棕黄色颗粒的阳性细胞，其AI随时间延长而增大；A、C组各时间点阳性细胞偶见，细胞AI无明显改变（图5）。各时间点B组AI均高于A、C组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A、C组间2、4周差异有统计学意义（P < 0.05），8周差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

表1 各组第1次激素注射后各时间点空骨陷窝率（n=3，% ± s）Tab.1 Percentage of empty osteocyte lacunae of the femoral head at each time point after the first hormone injection in three groups（n=3，%， ± s）

组别

GroupA B C

**

数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验，P值 < 0.05 为有统计学意义。2 结果

2.1 一般情况

第1次腹腔注射马血清后所有小鼠均无明显变化。第2次腹腔注射马血清后约6 h，B、C组小鼠出现食量减少、萎靡、反应迟钝、活动少等现象，C组小鼠约1周后逐步好转，B组小鼠约2周后逐步好转；A组小鼠无明显变化。B组小鼠于第2次腹腔注射马血清后7 d、11 d各死亡1只，C组小鼠于第2次腹腔注射马血清后10 min死亡1只，余小鼠均存活至实验完成。2.2 大体观察

3组各时间点股骨头外观形态均正常，关节软骨面均光滑、平整，色泽无异常。2.3 组织学观察

2.3.1 肝脏组织 A组各时间点肝脏组织均正常，肝小叶、肝索、肝窦等结构清晰，肝细胞无肿胀（图1 a）。B组于第1次激素注射后2周肝细胞肿胀，肝细胞内可见小脂肪空泡，肝索结构不清，肝窦变窄（图1 b）；4周观察情况与2周相似；8周肝细胞内可见大小不等的脂肪空泡，胞体肿胀，部分胞核被挤压至一边，肝索结构不清，肝窦变窄不易辨认。C 组2周见小部分肝细胞肿胀，偶见肝细胞内小脂肪空泡，肝索结构尚清晰（图1 c）；4、8周肝组织正常。

2.3.2 股骨头 A组各时间点骨小梁粗大、完整，排列规则，骨细胞清晰可见，偶见空骨陷窝，髓间脂肪细胞相对较少，形态正常，造血细胞丰富（图2 a）。B组第1次激素注射后2周见骨小梁变细，部分断裂，骨细胞空骨陷窝增多，部分骨细胞边聚、固缩，髓间脂肪细胞直径增大，数目增多；4、8周骨小梁变细、稀疏，断裂处增加，可见骨碎片出现，空骨陷窝率增高（图2 b）。C组各时间点骨小梁与A组相比无明显改变，空骨陷窝

2周2 weeks 6.80 ± 2.28*23.20 ± 3.63 9.20 ± 2.68*

4周4 weeks 7.20 ± 1.30*26.80 ± 4.60 9.60 ± 2.70 *

8周8 weeks 7.00 ± 2.24*28.40 ± 3.85 8.40 ± 2.30*

与B组比较P值 < 0.01 Compared with group B, P < 0.01

表2 各组第1次激素注射后各时间点OPG和OPGL阳性率（n=3，% ± s）

Tab.2 Positive rate of OPG and OPGL at each time point after the first hormone injection in three groups（n=3，%）

组别

GroupA B C

**

OPG

2周2 weeks22.80 ± 4.38*# 5.60 ± 1.67 #16.40 ± 2.30*

4周4 weeks20.40 ± 3.80* 5.20 ± 1.30# 17.40 ± 2.97*

8周8 weeks21.20 ± 3.56* 5.00 ± 1.58# 17.80 ± 3.77*

2周2 weeks 4.80 ± 1.40*#26.20 ± 4.52# 9.40 ± 3.04*

OPGL4周4 weeks 5.40 ± 1.62*#27.40 ± 4.17# 8.20 ± 2.29*

8周8 weeks 5.60 ± 1.14*27.80 ± 3.19# 8.00 ± 2.92*

#

与B 组比较P 值 < 0.01，与C 组比较P 值< 0.05

Compared with group B, P < 0.01; #compared with group C, P < 0.05

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图1 各组第1次激素注射后2周肝脏组织学观察（HE × 400）

A组

察（HE × 400）

A组 B组 C组 图

3 各组第1次激素注射后8周

OPG

） A组 B组

C组 图4

各组第1次激素注射后8周

DAB × 400） A组 B组 C组 图5 各组第1次激素注射后8周骨细胞凋亡TUNEL染色观察（× 400

） A

组 B组

C组

Fig.1 Histological observation of the liver after 2 weeks of the first hormone injection in three groups (HE × 400)

Group

B

C Histological observation of the femoral head after 4 weeks of the first hormone injection in three groups (HE × 400)

A

Group B

GroupFig.3 observation of OPG protein after 8 weeks of the first hormone injection in three groups

Group A

Group B

Group

A

B组

C组 图2 各组第1次激素注射后

(DAB × 400)

injection in three groups (DAB × 400)

Group C observation of OPGL protein after 8 weeks of the first hormone Group

A

B

C TUNEL

staining observation of the femoral head after

A

Group B

Group C

8 weeks of the first hormone injection in three groups (× 400)

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表3 各组第1次激素注射后各时间点股骨头AI（n=3，%）Tab.3 Osteocyte apoptosis index of the femoral head at each time point after the first hormone injection in three groups（n=3，%）组别 2周4周8周Group2 weeks4 weeks8 weeksA 5.17 ± 2.04*# 4.67 ± 1.75*# 5.33 ± 1.63* B 22.80 ± 4.38# 27.20 ± 4.82 #27.60 ± 5.55# C

8.67 ± 2.42

*

9.00 ± 2.76*

7.33 ± 2.42

*

*与B组比较P值 < 0.05，#

与C组比较P值< 0.05

*

Compared with group B, P < 0.05; #compared with group C, P < 0.05

3

讨论

学者们通过大量激素性ONFH发病机制相关临

床和实验研究，提出了脂肪代谢紊乱、血管内凝血、骨细胞脂肪沉积、骨质疏松及微骨折、激素毒性作用等多种学说

[2，7-10]

，但均未能阐明其确切发病机制，为临床

防治工作带来很大困难。目前认为其可能机制为：①造成脂肪代谢紊乱、高脂血症，脂肪在肝脏沉积，股骨头滋养血管内脂肪栓塞，骨内压升高；②引起骨内小血管炎，血液高凝、低纤溶状态使股骨头滋养血管内血栓形成，血供减少；③使骨质减少，骨质疏松，引起股骨头骨小梁骨折、软骨下骨塌陷，导致ONFH。六味地黄丸具有改善骨代谢、保护骨细胞、降脂等作用，是中医传统滋阴补肾的经典良方。体外细胞培养发现给予六味地黄丸的动物血清中含有促进成骨细胞增殖的因子，六味地黄丸通过促进骨吸收和骨形成两方面的作用，活化整个骨代谢过程[11]。关俭等[12]通过临床资料分析表明，六味地黄丸不仅能有效改善骨质疏松症患者临床症状，还显著提高了其骨折好发部位的骨密度值。近年来六味地黄丸在该方面的应用研究不断增加，但从分子机制方面研究六味地黄丸对激素性ONFH干预作用的报道较少。

OPG/OPGL/核因子κB受体活化因子系统是近年来发现的参与骨质重塑的重要信号传导通路，属于TNF超家族成员。该系统在调节破骨细胞分化成熟过程中具有重要作用，OPG是影响破骨细胞分化成熟、调节骨代谢的关键因子，由成骨细胞、骨髓基质细胞以旁分泌方式生成并在骨微环境中发挥作用。体外实验研究表明，OPG的主要作用包括抑制破骨细胞形成、降低破骨细胞活性并促进破骨细胞凋亡；OPGL的主要作用是促进破骨细胞分化，激活和抑制破骨细胞凋亡[13-14]。研究发现OPG/OPGL系统与糖皮质激素性骨坏死的发病机制密切相关

[15-17]

。因此，进一步研究

六味地黄丸对OPG表达的调节作用和分子机制，有助于六味地黄丸在骨质损伤疾病中的临床应用。本研究结果显示，激素使用可导致OPG表达降低和OPGL表

达增加，表明糖皮质激素可能通过下调OPG和上调OPGL来提高破骨细胞的活性，增加骨吸收，导致骨质疏松，骨强度下降，骨小梁微骨折引起微血管破坏，小梁间微循环中断，最终导致ONFH。应用六味地黄丸可以抑制OPG和OPGL的上述变化，从而促进成骨细胞增殖，降低并抑制破骨细胞活性，有效改善了骨代谢，改善了骨骼生物力学状态，逆转或延缓股骨头坏死的发生。

六味地黄丸调节脂代谢的作用已经有较多研究[18]；本研究结果显示六味地黄丸对激素应用导致的肝脏脂质代谢紊乱具有明显预防作用。已有研究表明，激素性ONFH的早期，骨组织中存在大量凋亡细胞，并据此提出骨细胞凋亡可能是导致激素性ONFH的机制之一[19-20]。本实验结果表明，激素应用导致骨细胞凋亡明显，应用六味地黄丸后明显减少了骨细胞凋亡，干预了早期激素性ONFH的发生。

综上述，六味地黄丸通过改善骨代谢、保护骨细胞、降脂等作用，抑制了股骨头局部骨细胞的凋亡，有效拮抗了激素对股骨头内OPG/OPGL表达的影响，阻止、延缓了早期激素性ONFH的进程。

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（收稿：2009-12-03 修回：2010-02-13）

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（本文编辑：刘丹）

短篇报道

陈云丰1

陆叶1 敖荣广2

【关键词】 锁骨中段骨折 畸形愈合 胸廓出口综合征中图分类号： R683.41 R687.32

文献标志码：B

固定。术后切口Ⅰ期愈合，患肢行避免肩关节负荷的被动功能

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病例介绍

患者 女，57岁。摔倒后左肩部直接着地，致左肩疼痛，活动受限。X线片示左锁骨中1/3骨折，予手法复位后“8”字绷带固定。伤后5个月因左肩、左前臂疼痛影响正常生活于我院就诊。检查：双侧肩关节不对称，左锁骨骨折处可扪及一非触痛性肿块；左肩前屈< 80°，外展< 50°。肩关节Constant评分为55分，上肢、肩、手功能障碍（DASH）评分为31.5分。正位X线片示左锁骨骨折畸形愈合，双侧锁骨切线位X线片示左肋锁间隙明显狭窄。CT三维重建和血管造影提示骨折畸形愈合，锁骨下血管无压迫、损伤。肌电图示左臂丛神经损伤。诊断为锁骨中段骨折畸形愈合，胸廓出口综合征，左臂丛神经损伤。

行左锁骨截骨矫形和钢板内固定术：患者在臂丛和颈丛神经阻滞麻醉下，取沙滩椅位。在锁骨中段取长弧形切口，保护锁骨上神经分支，暴露原骨折愈合部，见骨折畸形愈合和骨赘过度生长，沿原始骨折线用骨刀完整去除外骨痂，骨折断端骨髓腔扩髓后骨折复位，取8孔重建钢板置于锁骨前上方，螺钉

1 上海交通大学附属第六人民医院骨科200233）作者单位：（上海，；2复旦大学华山医院南汇分院

通讯作者：陈云丰，副主任医师，硕士导师，研究方向：四肢创伤，E-mail: drchenyf@http://www.77cn.com.cn

锻炼，同时前臂颈腕带悬吊，4周后至康复科行系统肩关节功能康复锻炼。术后1年随访，肩关节疼痛不适等症状完全消失；左肩前屈135°，外展95°；Constant评分为85分，DASH评分为3.0分；X线片示骨折线消失，骨折已完全愈合；无患肢残留刺痛和功能不良等并发症。术后2年随访，肩关节和前臂无任何症状，Constant评分为92分，DASH评分为0分。2

讨论

移位锁骨中段骨折非手术治疗后大多有不同程度成角或短缩，若骨折畸形愈合伴骨痂过度生长，可导致胸廓出口综合征。胸廓出口综合征的治疗包括手术治疗和非手术治疗。非手术治疗很难彻底治愈，手术治疗是主要方法。手术适应证：经1～3个月非手术治疗后症状无改善甚至加重者；尺神经传导速度通过胸廓出口低于60 m/s者；血管造影显示锁骨下动脉和静脉局部明显狭窄受阻者。手术方法有前斜角肌切除、第1肋骨切除、锁骨部分或完全切除等。因部分或完全切除锁骨可引起肩胛骨不稳，所以目前针对锁骨畸形愈合引起的胸廓出口综合征推荐的手术方法是去除额外骨痂，重新复位和钢板内固定，缓解神经、血管压迫，促进矫正后骨折生长。

(收稿：2010-01-18 修回：2010-01-31)

（本文编辑：苟莉）

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