变更场地的可比性研究-以注射用重组人生长激素为例

摘要

研究背景：在研发过程中或正式批准后生物制品的生产商经常会发生一些变更。变更的原因为改进生产工艺、增大规模、扩建/新建车间、提高产品稳定性和符合法规规定。当发生这些变更时，生产商通常需要评价产品的相关质量指标，以证明变更没有对药品的安全和有效性产生不利的影响。

研究目的：通过新建车间和老车间生产的注射用重组人生长激素比较研究，分析两个车间注射用重组人生长激素产品质量是否有差异，证明新车间产品是安全性和有效性。

研究方法：1、工艺的研究：根据老车间的历史数据，从被变更的工艺参数和关键质量属性的关系出发，在确定关键工艺参数和关键物料属性的基础上，研究是否由于变更而导致终产品质量的改变。2、所涉及厂房的评估：根据工艺研究结果对涉及到的变更进行风险评估，对变更的潜在影响进行分析。3、产品安全性和有效性研究：用产品放行标准为依据，通过比较两个车间原液、半成品和成品的关键质量属性，评价两个产品的一致性。

研究结果：用产品放行标准为依据，我们以新车间生产的20批原液和老车间原液历史上数据为比较的基础，进行了生物学活性、免疫化学性质，原液纯度、杂质和污染情况比较，证明两个车间的产品没有显著差异。强制降解试验对比表明没有发现两个车间原液的降解产物的降解产物种类和降解速率有显著差异。两个车间3批原液的长期稳定性没有显著差异。结构确证研究表明两个车间的一级和二级没有差异。大鼠体内生物学活性符合要求，没有显著差异。加速和长期稳定性研究表明，两者从杂质分布和降解速率上没有显著差异。

产品质量的相似性主要是由于新车间的在满足产品的工艺要求的基础上，并没有关键工艺参数的变更。发酵和冻干规模的放大没有对关键工艺参数的控制产生影响。这些证据表明新车间厂房和设备的验证表明其达到了设计要求，并可以满足注射用重组人生长激素的工艺要求。

研究结论：由于市场对于产品需求增大经常导致了厂房变更。用生产注射用重组人生长激素厂房变更为案例清楚表明：如果设计合理，在符合cGMP原则的理念的指导下，通过产品质量放行标准进行严格的比较学研究证明了在中国厂房变更的

可实现性。

关键词：重组人生长激素；可比性研究；场地变更，新建车间

Comparability Study of Injectable Recombinant Human Growth Hormone

Produced from Original Facility and Newly Built Facility

Abstract

Background:Due to market increased demand of biological therapeutics, a new facility is required to meet the market need. A critical systemic evaluation using product quality specification for lot release is designed and implemented for the products produced from both of original facility and newly built facility. This has been demonstrated a very successful approach for the case study of recombinant therapeutic protein human growth hormone in Shanghai, CHINA.

Research Objective:By analysis and comparison of the CQA of the products produced from original facility and newly built facility, we would to convince our self and Chinese drug approval agencies that the facility change not only meet our market demand, but most importantly also meet the requirement of drug quality.

Methods:The methods used were the risk analysis and control for all the possible changes in bio-process due to facility change, and the effects of differences between original facility and new facility on the quality of drug product. Finally, bioassays and regular analytical assays were used to show the quality similarity of Drug Substances and Drug Product.

Results:Our analytical data using 20 lots of drug substances from newly built facility to compare the data generated for the drug substances from the original facility for biological potency, in-vivo activity, immunochemicalproperties, purity and impurity shows great similarity. Degradation of the products under stress conditions displayed similar profiles for degradation products and degradation rates. In addition, our structural analysis indicated the similarity of primary and secondary structures of the final products from the both facility. All the evidences determined the facility change has NO noticeable or very minimal concerns to manufacture our current product once the correct design and strategy were used.

Conclusions:Our case study using injectable recombinant human growth hormone clearly indicated that, in China, a successful facility change for biological therapeutics with similar drug quality profile in comparison with the original facility can be achieved if a logical design and cGMP concept is correctly implemented.

Keywords:recombinant human growth hormone, comparable research, facility change, new facility

目 录

第1章

1.1 1.2 1.3 概述 ....................................................................................................................................... 1 重组人生长激素的发展历史 ............................................................................................... 1 场地变更的原因 ................................................................................................................... 6 注射用重组人生长激素工艺流程 ....................................................................................... 7 第2章 第3章

3.1

3.2

3.3 3.4 第4章

4.1 4.2 第5章

5.1

研究目的与意义 ................................................................................................................. 10 注射用重组人生长激素产品介绍 ..................................................................................... 10 原液的研究方法和质量标准 ............................................................................................. 11 3.1.1 重组人生长激素的结构 ......................................................................................... 11 3.1.2 放行标准 ................................................................................................................. 12

原液的研究方法和质量标准 ............................................................................................. 12 3.2.1 重组人生长激素的结构 ......................................................................................... 13 3.2.2 放行标准 ................................................................................................................. 14 3.2.3 生物学活性 ............................................................................................................. 15 3.2.4 免疫化学性质 ......................................................................................................... 15 3.2.5

强制降解试验和长期稳定性 ................................................................................. 16

半成品的研究方法和质量标准 ......................................................................................... 16 成品的研究方法和质量标准 ............................................................................................. 16 初步风险评估 ..................................................................................................................... 18 输入物料的变更分析和风险评估 ..................................................................................... 18 工艺的变更分析和风险评估 ............................................................................................. 21 对比研究结果 ..................................................................................................................... 23 原液的对比研究结果 ......................................................................................................... 23 5.1.1 结构确证 ................................................................................................................. 23 5.1.2 生物学活性 ............................................................................................................. 24 5.1.3 免疫化学性质 ......................................................................................................... 24 5.1.4 纯度、杂质和污染 ................................................................................................. 25 5.1.5

强制降解试验结果 ................................................................................................. 26

5.1.6 5.1.7 5.2

长期稳定性 ............................................................................................................. 27 工艺验证结果和讨论 ............................................................................................. 28

成品的对比研究结果 ......................................................................................................... 28 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4

放行检验结果 ......................................................................................................... 28 生物学活性 ............................................................................................................. 29 稳定性 ..................................................................................................................... 29 半成品的对比研究结果 ......................................................................................... 31

第6章 第7章

可比性研究讨论 ................................................................................................................. 32 结论 ..................................................................................................................................... 33

第1章 概述

1.1 重组人生长激素的发展历史

人生长激素（hGH）是由脑垂体前叶，含有嗜酸性颗粒的生长激素（GH）分泌细胞所分泌，为191个氨基酸构成的肽类激素。正常情况下，生长激素hGH呈脉冲式分泌，生长激素（HGH）的分泌受下丘脑产生的生长激素释放素(GHRH)的调节，还受性别、年龄和昼夜节律的影响，睡眠状态下分泌明显增加。生长激素的主要生理功能是促进神经组织以外的所有其他组织生长；促进机体合成代谢和蛋白质合成；促进脂肪分解；对胰岛素有拮抗作用；抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用。生长激素主要生理作用是对人体各种组织尤其是蛋白质有促进合成作用，能刺激骨关节软骨和骨骺软骨生长，因而能增高。人体一旦缺乏生长激素就导致生长停滞。

1886年Pierre Marie 第一次在临床上观察到脑下垂体的功能，发现在肢端肥大病人中脑下垂体增大。20世纪约翰霍普金斯医院的Harvey Cushing第一次试验发现垂体前叶在人、小鼠和狗中具有促生长作用[1~4]。1921年，Evans和Long牛垂体前叶的提取物可以刺激正常大鼠的生长[5]，很快又发现此提取物可以使去垂体的大鼠保持生长[6]。促进生长的提取物发现可以刺激合成代谢效应，降低尿中氮、钙和磷的排泄[7,8]。尿中这些元素的测定提供了一个简便的生物活性检测方法，并用于在垂体提取物中分离活性组分。

1944年Li和Evans第一次从牛垂体中分离现在已知为生长激素的多肽激素[9]。由于牛生长激素没有成功的促进人的长高[10]，因此人们开始从尸体或去除垂体的乳腺按患者的垂体中提取人生长激素[11-13]。在临床试验中，人和猴子的生长激素产生了合成代谢，并刺激了长高[14-15]。猿和非猿的生长激素的的生物化学差异被鉴别出来，同时解释了生理效应的物种特异性[14]。

在1957和1985年之间，从尸体垂体提取的人生长激素被用于很多生长激素缺乏儿童的激素替代治疗中[16]。在此期间，生长激素治疗发现是有效并没有什么副反应。然而，人垂体生长激素是稀缺和昂贵的。其他治疗的应用开发，或人生长激素的细胞作用机理的研究时不可能的。

科学的进步改变了人生长激素领域的发展。人生长激素的DNA被克隆到了细菌

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质粒上[17]，从此开辟了基因工程人生长激素商业化的道路。1985年被报道[18]发现儿童期使用人生长激素的儿童，成年后发现罹患致命的神经退行性疾病-克雅病，因此美国食品药品监督管理局（FDA）在上世纪80年代命令停止一切提取自死人脑垂体的hGH，并不准应用于人体上。这一事件促发了重组人生长激素在临床上商业化使用。随着在细菌中大规模生产人生长激素，人生长激素的供应不再成为人体或实验室进行各种治疗研究的限制。

20世纪80年代，基因工程兴起。1981年Genentech公司利用大肠杆菌（E. Coli）包涵体技术研制出含192氨基酸的基因重组人生长激素——Met-rhGH。与天然hGH相比，在N-末端多了一个蛋氨酸残基，又称为somatrem (Protropin?)。随着基因工程技术的发展，1986年通过基因重组技术合成出含天然序列的重组人生长激素。

上世纪90年代人们纯化了人生长激素受体蛋白，并克隆了基因[19,20]。通过X射线晶体衍射解析了人生长激素受体蛋白和人生长激素的相互作用的三维结构[21]。生长激素受体结构的知识对生长激素信号传导机理的研究提供了新的视野和方向。直接单位点突变技术被用于对生长激素配体-受体相互作用的研究[22]，分子方法也被用于生长激素受体激动剂的设计。

人生长激素基因簇大约有66,500个碱基，位于第17染色体的长臂上[23]。由GH-N（正常生长激素基因），CS-L（类绒毛膜生长激素），CS-A（绒毛膜生长激素A），GH-V（生长激素变体基因，也是胎盘生长激素）和CS-B（绒毛膜生长激素B）5个基因家族组成。GH-N和GH-V有时也称为GH-1和GH-2。绒毛膜生长激素也是胎盘催乳素基因。这5个基因的DNA序列高度同源。因此猜测生长激素基因家族通过基因复制而产生的。

只有GH-N是正常健康必须的。切除或突变GH-N基因引起IA型生长激素缺乏，这是最严重的生长激素缺乏。具有这个缺陷的个体不能产生内源性生长激素。在出生或出生3~6个月引起有明显的重度低血糖和生长延缓[24]。这些患者初始对生长激素替代有响应，但治疗1年内由于生长激素抗体产生而抑制了生长。GH-N基因在垂体前叶表达，是在儿童和成年人中循环的主要形式[25]。生长激素是分泌蛋白，它的合成是一个含26个氨基酸的激素前体。当生长激素跨过内质网膜转运到贮藏粒中时信号肽被切除。GH-N表达的生长激素是一个22kDa，191个氨基酸的单链多肽。生长激素生物活性构象含有两个二硫键桥。22kDa GH-N基因产物在人的肝脏和受体结

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合，并刺激IGF-1的产生和长高。

所有的人生长激素都是采用注射的方式给药。皮下和肌内注射时等价的[26]。因为有较小的疼痛感，皮下注射更好。腹部的皮下注射比大腿的皮下注射有更高的生长激素血清浓度，然而刺激IGF-1的水平相当[27]。在循环系统内生长激素和高亲和的生长激素结合蛋白（GHBP）结合，和这个蛋白结合延长了生长激素在循环系统的半衰期。给药的时间不影响血清中生长激素的水平，晚上给药模拟了生理的生长激素峰值[28]。生长激素的清除半衰期大约在2到3小时之间。通过在肝脏和肾脏的代谢而清除的，成年人比儿童清除速率更快[29]。

人生长激素是非糖基化的，因此目前国际上已经批准上市的重组人生长激素主要是由细菌（E. Coli）生产的，如Genentech的Nutropin?，Eli Lilly的Humatrope?，Novo Nordisk的Norditrope?等。也有用哺乳动物细胞生产的，如Serono的Saizen?；以及由酵母生产的，如LG的Valtropin?。表1列出了目前主要重组人生长激素的生产商和在美国和中国批准上市的时间。我国内已上市产品均是由大肠杆菌（E. Coli）生产的。

表1主要重组人生长激素的生产商

生产商 商品名 美国批准日期 中国批准日期 美国礼来制药 美国基因技术公司 辉瑞制药 默克雪兰诺 诺和诺德制药有限公司 山德士制药有限公司 Humatrope Nutropin Genotropin Saizen Omnitrope 1987年3月 1993年11月 1995年8月 1996年10月 2006年5月 / / / 2009年6月 / 2009年7月 2008年4月 2008年6月 / 1999年7月 1998年 1999年 NorditropinFlexpro 2000年6月 上海联合赛生物工程有限公司 珍怡 长春金赛药业有限责任公司 赛增 安徽安科生物工程股份有限公安苏萌 司 *met-hGH已下市

重组人生长激素在大肠杆菌中的表达有两种形式，第一种形式是甲硫氨酸生长激素m-hGH，他和天然生长激素有一个氨基酸的差异，在N端多了一个甲硫氨酸，美

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国基因技术公司和诺和诺德最初的产品就是m-hGH，目前这种形式的重组人生长激素已经下市。第二种形式是真实的人生长激素。一些研究表明甲硫氨酸生长激素比真实的人生长激素产生较高的抗体[30]，美国礼来公司的Humatrope是第一个批准的和天然序列一致的重组人生长激素[31]。甲硫氨酸残基和细菌蛋白结合的痕量的人生长激素比单纯的甲硫氨酸人生长激素产生更高的免疫原性，这个问题可以通过纯化而缓解。抗体的产生很少干扰人生长激素的生物活性，因为抗体的亲和性和浓度均较低[31]。生长激素抗体水平使得市场不再追随甲硫氨酸人生长激素。哺乳动物细胞的人生长激素有非常低的免疫原性[32]。目前主要的重组人生长激素的生产商均提供的是和天然人生长激素一致的重组人生长激素。大多数生产商采用的是大肠杆菌系统，因为目前批准上市的产品证明大肠杆菌系统表达的人生长激素的免疫原性并未对产品的有效性和安全性产生不利的影响采用大肠杆菌系统是最经济的，而且大肠杆菌系统已经是比较成熟的基因工程技术，上游构建和下游纯化均有比较成熟的技术，工艺控制比较稳定。

重组人生长激素是一个单链多肽激素，通常以生物活性的单体存在，但正像大家所知的他易聚集为二聚体，并在热和机械应力下（如制备过程中的摇动等）转化为多聚体而失去活性。

生长激素的药物配方趋向于不稳定，尤其在溶液中，生长激素容易生成降解产物，如脱氨和氧化产物。主要的降解反应是1）直接水解脱氨或通过环状琥珀酰亚胺中间体而形成L-asp-hGH，L-iso-asp-hGH， D-asp-hGH以及D-iso-asp-hGH；2）在14和125位上甲硫氨酸残基的氧化；3）聚集；4）肽骨架的截断。

冻干状态以及溶液状态的生长激素的主要降解产物是脱氨组分。脱氨发生在149的Asn天冬酰胺上，在152的天冬酰胺残基上也会产生少量的脱氨。在溶液中人生长激素在14和125位上的甲硫氨酸极易氧化。溶液中hGH氧化形成亚砜主要原因是配方中的溶解氧。蒸馏水中氧气的溶解度大约是200uM，而对于4IU/ml的生长激素来说，其浓度相当于60nM。在正常的储存条件下，溶解氧的量超过了3000倍生长激素的化学计量，所以是不能通过塞盖或包装前对缓冲溶液除气来解决溶解氧的问题。

很多降解反应多可以通过冻干从蛋白质中移走水分而显著降低，所以现在生长激素通常都是冻干的，在4℃以冻干形式储存的冻干剂型，使用前再重新溶解，大部分

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的商品重组人生长激素是冻干形式的。

除了常见的冻干形式制剂外，考虑到使用方便和患者的依从性，人生长激素的溶液制剂和缓释制剂的研究也很多。目前国际上诺和诺德和美国基因技术公司均有溶液剂型的生长激素上市，但由于人生长激素在溶液中很不稳定，因此货架期要比冻干剂型短很多，而且对运输的要求也比较高，溶液剂型对温度的敏感性比冻干剂型高很多。

从二十世纪八九十年代至今，普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质的变性。Dean[33]认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下，蛋白质将失去活性；而脱水过程本身能使蛋白质损伤，从而复水后蛋白失去活性。保护剂的作用一般认为是通过与蛋白的氢键作用而保护了蛋白由于失去水分而裸露的基团。保护剂的浓度和冻干速率相关，由于对于药物制剂来说保护剂的浓度不能过高，所以要有较大的冻干速率。

人生长激素制剂的稳定性是和水分以及氧有密切的关系，在低的水分含量以及最小氧的存在下制剂的稳定性最好[34]。但是在不加保护剂的情况下，如果单纯降低水分含量可能适得其反，因为蛋白如果失去最后一层水分的保护，将因为基团的暴露而聚集变性。有报道[35]人生长激素在含水量4.6%时完全变性，而在含水量7.6%时没有变性。所以冻干过程应该加入合适的保护剂以及其他辅料，并且含水量不是越低越好。较少氧对蛋白的氧化，可以通过充氮气来保护[36]。

冷冻干燥过程中的降温速率的选择与保护剂的浓度有关，如果保护剂浓度很高，以不太大的降温速率就能使溶液以玻璃态固化。很多人认为快速冷冻有益于生物活性，因为快速冷冻可以减少缓冲液结晶引起的pH变化，减低蛋白质局部高离子强度的接触时间，减少变性可能发生的时间。但是很多证据表明冻融和冷冻干燥后，快速冷冻对蛋白的活性回收不利，并对贮藏期冻干产品的稳定性也有影响[37]。用磷酸缓冲液和甘露醇作为赋形剂体系，在pH7.4~7.8时，冷冻速率对人生长激素的可溶性聚合物形成的影响检测不到，可是对不溶性聚合物形成的影响是显著的，冷冻速率越高聚合物越多。不溶性聚合物的形成被冷冻前的低pH加速。

冻干溶液的pH很重要，对脱氨的影响较大。选用不同的缓冲溶液对pH的要求也不一样。当选用磷酸盐作为缓冲液时，在较低的pH（6.0）下，有较少的脱氨组分，但在此pH下较易产生聚集[38]。人生长激素溶液剂型就是选用较低的pH，添加非离

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子表面活性剂防止聚集。

人生长激素最常用的冻干保护剂是甘氨酸和甘露醇。两种配方比很重要，根据剂量的不同两种物质加入的比例是不同一样的。甘露醇作为保护剂和甘氨酸一起起到稳定冻干制剂的作用。为了保证重新溶解后人生长激素的稳定，也有在溶解水中加入非离子表面活性剂来增加溶液的物理稳定性，如诺和诺德的NorditropinSimpleXx，在溶解水中加入泊洛沙姆188以增加物理稳定性。表2列出了价格典型的商品化重组人生长激素的配方。

表2常见商品化重组人生长激素的冻干配方*

商品名 赋形剂 缓冲盐 rhGH 甘氨甘露蔗NaH2PO4 Na2HPO4 pH 酸 醇 糖 4.5IU 1.5 27.6 0 / 0.30 0.30 6.7 Genotropin 17.4 5.8 2.2 1.8 / 0.32 0.32 6.7 15 5 5 25 / 0 1.13 7.5 冻干Humatrope 剂型 18 6 6 18 / 0 1.36 7.5 Nutropin 15 5 1.7 45 / 0.45 1.3 7.4 Saizen 15 5 / / 34.2 6.5-8.5 *来源于FDA网站相关产品的说明书

表2中可以看到大多数上市产品采用的甘氨酸和甘露醇配方系统。本文讨论的产品就是采用冷冻干燥技术制备的冻干粉针剂型，也采用和上市产品同样的甘氨酸和甘露醇体系，配方均得到批准，长期稳定性研究发现，冻干剂型和溶液剂型相比较在货架期要稳定的很多，这也是目前市场上还是主要以冻干剂型为主的原因。

剂型 规格 1.2 场地变更的原因

注射用重组人生长激素是上海联合赛生物工程有限公司已上市十多年的老产品，随着市场的扩大，原生产车间已不能满足市场需求，为此在原址上新建了注射用重组人生长激素生产车间，用于注射用重组人生长激素的生产。由于在原址上新建，原质量检测、原辅材料采购和储存，以及质量保证系统均采用原来的系统，检测、原辅材料和质量保证系统的风险较低。

本次是在原厂址增建了一个注射用重组人生长激素的生产线，包括了原液生产车间和制剂生产车间，对于本次新建车间经历了下面几个阶段。

表3新增车间经历的阶段流程

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阶段 设计前 要求 根据历史研究和生产数据分析和评估原液和制剂的关键工艺参数，并分析其对终产品质量属性的影响。 厂房设计 根据关键工艺参数的分析结果，提出对厂房和设备的工艺设计要求。厂房和设备应可以满足有效控制关键工艺参数的要求。 安装确认 试制 完成厂房和设备3Q 在新建车间进行试制，考察车间、设备、人员等是否可以按照预定的工艺参数进行生产，并得到合格的产品。 工艺验证 根据是试制的结果完善工艺规程和批记录等，然后进行工艺验证。 比较研究 持续改进 新车间和老车间的原液和成品进行全面的药学比较研究。 新老车间进行持续的考察和比较，对更多批次的原液和成品进行回顾性的验证，进一步确认工艺的稳定性。 在新车间的设计前根据实际需要，放大了发酵规模和冻干规模，保持其他操作单元规模不变。对于生物制品，其生产工艺是关键的，因此在整个新车间发展阶段，以不改变关键工艺参数和关键质量属性为前提进行设计、实施和验证。

1.3 注射用重组人生长激素工艺流程

注射用重组人生长激素是冻干粉针剂型，其原液通过基因工程技术将目的基因插入载体质粒中，然后将质粒转化到大肠杆菌而得到可以表达重组人生长激素的大肠杆菌工程菌，再通过大肠杆菌的培养使之生产目的蛋白重组人生长激素。由于重组人生长激素是通过大肠杆菌来生产的，因此需要将目的产物和大肠杆菌其他组分如宿主蛋白等进行分离。培养后的大肠杆菌需要通过一系列的工艺步骤进行分离纯化后才能得到纯净的重组人生长激素原液。得到的原液经过配制、除菌过滤、冻干和包装等制剂过程，得到终产品注射用重组人生长激素冻干粉针。

对于药品的生产，图1形象的给出了关键物料属性和关键工艺参数对关键质量属性的影响。根据这一定义，工艺状态取决于该工艺的关键工艺参数和输出物料的关键物料属性[39]。

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CPPs 关键工艺参数

CMAs 输入物料 药品生产单元操作 CQAs 产出物

图1关键物料属性（CMAs）和关键工艺参数（CPPs）对关键质量属性（CQAs）的影响

生物制品由于分子量大，结构复杂，对于分析方法和仪器设备要求颇高；尽管如此，现代分析技术难以按照个体分子的2级及3级结构进行完整表征化测定，因此主要通过控制其生产工艺来说明批次生产的相似性；而生产工艺是通过多个生产单元操作来实现的。注射用重组人生长激素的生产工艺也被分为多个单元操作，图2给出了注射用重组人生长激素生产工艺流程图。流程图中根据图1的方法，给出了每个单元操作的输入物料和产出物。从图中可以看出，上一步骤的产出物是下一步骤的输入物料，这里将工艺的产出物除原液、半成品和成品外的工艺产出物均定义为中间品。

根据多年的生产经验对每一个单元操作的物料属性和工艺参数进行分析，并评估其对关键质量属性的影响。当输入物料的某个质量属性（如水分、纯度）的变化能显著影响产出物的属性时，则定义其为关键物料属性。当工艺参数运行参数（如流速、转速）或工艺状态变量（如温度、压力、pH）的实际变化能显著影响产出物料的属性时，则定义该工艺参数是关键的[40]。新建车间输入物料和产出物的关键属性CMAs和CQA应和老车间保持一致。

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输入物料

生产操作单元

产出物

细胞库（MCB和WCB） 培养基、工艺空气、纯化水 发酵培养 离心捕获菌体 初纯 精纯 配制 除菌过滤 灌装 冻干 钆盖 包装 中间品1 中间品1 中间品2 各种盐、纯化水 中间品3 层析介质、过滤膜、注射用水 重组人生长激素原液 辅料、注射用水 中间品4 过滤膜、工艺空气、注射用水 半成品 胶塞、西林瓶、注射用水 中间品5 氮气 冻干品 铝盖 成品 瓶贴、说明书、外包装 中间品2 中间品3 重组人生长激素原液 中间品4 半成品 中间品5 中间品6 成品 包装成品 图2注射用重组人生长激素工艺流程图

（下划线表示单元操作的产出物）

从总体的工艺流程上看原液是成品关键物料，新车间原液的关键质量属性和老车间不应有显著差异，原液后面工艺的变更不对原液的质量属性产生不利的影响。

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第2章 研究目的与意义

根据《关于贯彻实施<药品生产质量管理规范（2010年修订）>的通知》（国食药监安〔2011〕101号）和《关于进一步明确眼用制剂等产品实施新修订药品GMP期限的通知》（国食药监安〔2012〕106号）要求，涉及无菌检查项目制剂和原料药均应在2013年12月31日前达到新修订的药品GMP要求。其他应在2015年12月31日前达到新修订药品GMP要求。生物制品均应在2013年12月31日前达到新修订的药品GMP要求。

《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（简称新版GMP）[41]是一次重大的GMP修订，特别是针对无菌药品的生产提高了要求，很多生产商为符合新版GMP要求必须对原有厂房进行改建，与此同时很多生物制品通过改建或扩建淘汰老的工艺，采用新工艺。如何将变更后的产品与变更前的产品进行对比是很多生产商面临的问题。

生产方法、工艺、质控检测方法以及产品表征检测方法的改进，使生产商能够较好对变更对生产工艺和生产设施的影响进行识别和评估，这使得从药学上证明其有可比性成为可能。比如，近年来大分子分离技术、产品以及工艺相关技术大大改进，生产商在建立产品和生物活性表征方面经验证的灵敏方法以及对这些检测中差异显著性评价方面所具有的能力，有能力在不必重复进行临床药效研究的情况下，对产品可比性研究进行评价。如果可比性试验证明生产变更并未对产品的安全性、特性、纯度和效价产生影响，可认为这两种产品具有可比性。

可比性研究是厂房变更的关键，本文尝试以注射用重组人生长激素新建厂房的可比性研究为例，对如何评价产品变更前后的可比性进行探讨。

第3章 注射用重组人生长激素产品介绍

药品的安全性和有效性是通过上市前非临床和临床试验而评价，药品的关键质量属性通过临床期间的药学研究而最终确定的，因此对于已上市产品的变更，其关键质量属性不应发生变更，否则需要追加非临床或临床试验来确认其安全性和有效性。

注射用重组人生长激素产品已上市10多年，欧洲药典、美国药典和中国药典均

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收录了此产品，具有比较成熟的分析方法，质量标准也是基于对产品和工艺的了解而建立的，因此质量标准反映了其关键质量属性。下面从原液、半成品和成品3个方面分别介绍新车间产品的研究方法和质量标准。

3.1 原液的研究方法和质量标准

重组人生长激素的关键质量属性包括一级、二级和三级结构、理化性质、免疫化学性质、生物活性、纯度和杂质以及产品的稳定性，原液的研究方法应包含上述内容。

3.1.1 重组人生长激素的结构

图3给出了人生长激素的一级氨基酸序列和二硫键位置。

图3人生长激素一级结构图[42]

重组人生长激素的分子式为C990H1528N262O300S7，分子量22125道尔顿。其他结构信息列于表4中。

新车间重组人生长激素原液应进行结构的确证，证明其和天然的人生长激素的结构具有一致的一级和二级结构。结构确证检测包括：肽图质谱覆盖率、质谱分子量、N末端和C末端序列检测、二硫键配对检测和圆二色谱法检测。两个车间各取1~3

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批原液进行结构检测，表4列出了检测项目和两个车间原液结构的一致性评价标准。

表4人生长激素结构确证研究内容

检测项目 理论值 22,125Dalton 一致性标准 3批原液检测，分子量和理论值误差小于1%；和对照品平均分子量相差小于20Dalton 两种酶酶切，分子量覆盖率应大于90% 相同条件检测，应和对照品谱图一致 质谱分子量 氨基酸序列 alfa螺旋占多数 肽图质谱覆盖率 圆二色谱法 二硫键配对 两对二硫键：Cys53-Cys165仅有C53-C165和C182和C189和Cys182-Cys189 两对分子内二硫键，没有错配和分子间二硫键 NH2-FPTIPLSRLF SVEGSCGF-COOH N末端10个残基序列为NH2-FPTIPLSRLF C末端8个残基序列为SVEGSCGF-COOH N末端序列 C末端序列 3.1.2 放行标准

注射用重组人生长激素产品已上市10多年，并且是在《中华人民共和国药典》中有收录，因此质量标准反映了其关键质量属性，下面从原液、半成品和成品3个方面分别介绍新车间产品的研究方法和质量标准。

3.2 原液的研究方法和质量标准

重组人生长激素的关键质量属性包括一级、二级和三级结构、理化性质、免疫化学性质、生物活性、纯度和杂质，以及产品的稳定性，因此原液的研究方法应从上述方面进行。

12

3.2.1 重组人生长激素的结构

图3给出了人生长激素的一级氨基酸序列和二硫键位置。

图4人生长激素一级结构图[]

重组人生长激素的分子式为C990H1528N262O300S7，分子量22125道尔顿。其他结构信息列于表4中。

新车间重组人生长激素原液，应进行结构的确证，证明其和天然的人生长激素的结构具有一致的一级和二级结构。两个车间各取1~3批原液进行结构检测，检测包括：肽图质谱覆盖率、质谱分子量、N末端和C末端序列检测、二硫键配对检测和圆二色谱法检测。表4列出了这些检测的理论值和两个车间原液结构的一致性评价标准。

表5人生长激素结构确证研究内容

检测项目 理论值 22,125Dalton 一致性标准 3批原液检测，分子量和理论值误差小于1%；和对照品平均分子量相差小于20Dalton 两种酶酶切，分子量覆盖率应大于90% 相同条件检测，应和对照品谱图一致 质谱分子量 氨基酸序列 alfa螺旋占多数 肽图质谱覆盖率 圆二色谱法 13

二硫键配对 两对二硫键：Cys53-Cys165仅有C53-C165和C182和C189和Cys182-Cys189 两对分子内二硫键，没有错配和分子间二硫键 NH2-FPTIPLSRLF SVEGSCGF-COOH N末端10个残基序列为NH2-FPTIPLSRLF C末端8个残基序列为SVEGSCGF-COOH N末端序列 C末端序列 3.2.2 放行标准

新车间重组人生长激素原液不仅应符合放行检验标准，还应基于收集的历史数据，通过统计学方法建立两个车间比较的验收标准。

根据分析方法的性质，可以将放行标准分为定量标准和定性标准，定性标准作为定量标准的补充，更全面的展现产品杂质增减情况。重组人生长激素主要相关杂质有：脱氨组分、氧化组分、多聚体、工艺中被截断的人生长激素片段。主要工艺杂质有：内毒素、宿主菌体蛋白、外源DNA、微生物。内控放行标准的检测方法涵盖了上述杂质的分析。因此可以通过对放行检测结果的比较，证明厂房的变更对原液的理化性质、纯度和杂质是否产生了不利影响。新车间采用至少10批次原液和老车间进行比较，原液应符合放行标准，同时对定量检测数据的统计分析，比较两个车间的平均值和标准偏差，判断两者是否有显著差异。

表6列出了主要的放行标准检测项目，检测方法基本是药典方法，分析方法可靠并均经过验证。

表6重组人生长激素原液的放行标准

检测项目 外观 鉴别 方法（1） 目检 分析方法 《中华人民共和国药典》二部重组人生长激素项下的鉴别（1）项方法（反相色谱法） 方法（2） 《中华人民共和国药典》二部重组人生长激素项下的鉴别（4）项方法（等电聚焦电泳IEF） 检查 相关蛋白 《中华人民共和国药典》二部注射用重组人生长激素项下的相关蛋白检测方法（反相色谱法） 高分子蛋白 《中华人民共和国药典》二部注射用重组人生长激素项14

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36

37

下的高分子蛋白检测方法（分子排阻色潽法） 电荷异构体 细菌内毒素 等电聚焦电泳 《中华人民共和国药典》二部附录XI E 残余宿主蛋《中华人民共和国药典》二部重组人生长激素项下的菌白 DNA残留 体蛋白残余量检测方法 《中华人民共和国药典》二部重组人生长激素项下的外源性DNA残留量下的方法 含量 《中华人民共和国药典》二部注射用重组人生长激素项下方法 3.2.3 生物学活性

《中华人民共和国药典二部》附录XII P生长激素生物测定法是采用去垂体大鼠体重法和胫骨法进行的生物活性测定法，和生长激素的体内药效学研究采用相同的方法，因此去垂体大鼠体重法和胫骨法测定结果也反映了动物体内药效结果。

《中华人民共和国药典二部》重组人生长激素各论中规定生物活性：照生长激素生物测定法（附录XII P）依法检查，每1mg蛋白中含生长激素不得少于2.5单位（每年至少测定一次）。

两个车间各取1~3批同时进行重组人生长激素体内生物学活性的检验，两个车间原液的生物活性应符合《中华人民共和国药典》重组人生长激素各论中的规定，两者的活性平均值和标准偏差应没有显著差异，以此证明厂房的变更未改变其体内生物学活性。

3.2.4 免疫化学性质

免疫化学性质的检测可以采用免疫斑点法或western blot方法，两种方法均针对重组人生长激素的抗原特性进行检测。

免疫化学性质的研究，可以证明两个车间生产的原液抗原特异性一致性，它的一致性可以进一步说明两者结构的一致。

15

3.2.5 强制降解试验和长期稳定性

新车间生产的原液可以通过高温和光照强制破坏试验，检测相关蛋白、高分子蛋白质、电荷异构体、含量，比较两者之间降解物和降解速率。在工艺不变的情况下降解产物类型和降解速率应该没有显著变化，新车间原液和老车间强制降解比较应不得产生新的降解产物。

重组人生长激素原液为冷冻保存，因此无需进行加速稳定性考察，仅进行长期稳定性考察。将新车间和老车间的长期稳定性历史数据进行统计分析和比较，降解速率和杂质类别上应没有明显的差异。

重组人生长激素原液长期稳定性考察方法如下：拟考察点为0、3、6、12、18、24、36个月。原液包装形式和老车间一致，贮存温度2~8℃。按照《中国药典》2010年版附录XIX C“原料药与药物制剂稳定性试验指导原则”，本品为注射剂，指导原则规定的重点考察项目为：外观色泽、含量、pH值、可见异物、有关物质。因此重点考察项目为：性状、含量、pH值、可见异物、有关物质（相关蛋白、高分子蛋白）、水分指标。在0、24和36个月进行全项检测。

3.3 半成品的研究方法和质量标准

重组人生长激素原液和辅料按照处方比例进行混合后除菌过滤得到半成品。半成品的放行标准包括：内毒素、无菌、蛋白含量。新车间半成品应符合放行标准，和历史数据比较没有显著差异。半成品除放行标准的检测还应增加稳定性考察，在室温下，考察0、8、16和24小时半成品相关蛋白、高分子蛋白和含量，新车间半成品在考察期内应符合成品的放行标准，比较两个车间上述指标平均值和相对标准偏差，两个车间应无显著差异。

3.4 成品的研究方法和质量标准

注射用重组人生长激素已经被录入《中华人民共和国药典》，因此其放行标准是不低于《中华人民共和国药典》2010年版的各论的要求，放行检测涵盖了注射用重组人生长激素理化性质、纯度和杂质、生物学活性等产品关键质量属性。可以作为评价两个车间产品质量的比较标准。

16

新车间注射用重组人生长激素的研究，不仅要求符合放行标准，还应进行生物活性和稳定性考察。新车间至少3个连续批和老车间进行比较，比较方法如下：

? 半成品和成品放行检测中的定量项目应采用统计分析的方法和老车间的历

史数据比较，比较平均值，相对标准偏差。 ? 两个车间同期生产的产品均应符合质量标准。

? 对两个车间同期生产的产品杂质进行分析，应没有新增杂质的出现。 ? 两个车间的产品同时进行高温和光照的强制降解试验，比较两个车间产品在

高温和光照情况下降解速率是否有不同，杂质类型是否有差异。

? 新车间连续3批产品进行加速稳定性考察，采用市售小包装贮存，温度25℃

±2℃，湿度60%±5%。参照《中国药典》2005年版附录XIX C《原料药与药物制剂稳定性试验指导原则》以及《化学药物稳定性研究技术指导原则》设置考察时间点，考察点为0、1、3、4.5和6个月。重点考察项目为：性状、含量、pH值、可见异物和有关物质（相关蛋白和高分子蛋白）。0和6个月进行全项检测。新车间和老车间产品的历史数据进行比较，两者在降解速率和杂质类别上应没有明显的差异。

? 新车间每个规格至少3批进行长期稳定性考察，采用市售小包装贮存，贮存

温度5℃±3℃。按照《中国药典》2005年版附录XIX C《原料药与药物制剂稳定性试验指导原则》以及《化学药物稳定性研究技术指导原则》设置考察时间点。时间点在第一年一般为每3个月末一次，第二年每6个月末一次，以后每年末一次。即第0、3、6、9、12、18、24、36个月末取样检测考察指标。重点考察项目为：性状、含量、pH值、可见异物和有关物质（相关蛋白和高分子蛋白）。0、24和36个月分别进行全项检测。和老车间同规格产品进行比较，两者在稳定性上应没有明显差异。

表7注射用重组人生长激素放行标准检测方法

检测项目 外观 鉴别 方法（1） 目检 分析方法 《中华人民共和国药典》二部重组人生长激素项下的鉴别（1）项方法（反相色谱法） 方法（2） 《中华人民共和国药典》二部重组人生长激素项下的鉴17

别（4）项方法（等电聚焦电泳IEF） 检查 水分 相关蛋白 费休氏法容量滴定法 《中华人民共和国药典》二部注射用重组人生长激素项下的相关蛋白检测方法（反相色谱法） 高分子蛋白 《中华人民共和国药典》二部注射用重组人生长激素项下的高分子蛋白检测方法（分子排阻色潽法） 电荷异构体 异常毒性 细菌内毒素 装量差异 无菌 酸碱度 等电聚焦电泳 《中华人民共和国药典》二部附录XI C 《中华人民共和国药典》二部附录XI E 《中华人民共和国药典》二部附录I B注射剂 《中华人民共和国药典》二部附录XI H 薄膜过滤法 《中华人民共和国药典》二部附录 VI H 溶液的澄清《中华人民共和国药典》二部附录IX A第一法和附录IX 度与颜色 可见异物 不溶性微粒 含量 B 《中华人民共和国药典》二部附录IX H灯检法 《中华人民共和国药典》二部附录IX C第一法 《中华人民共和国药典》二部注射用重组人生长激素项下方法 生物学活性 《中华人民共和国药典》二部重组人生长激素项下方法 第4章 初步风险评估

4.1 输入物料的变更分析和风险评估

根据图2的工艺流程图，首先对注射用重组人生长激素工艺中的输入物料分别进行分析，找出由于厂房变更而引起变化的输入物料，然后针对这些输入物料进行变更的风险识别和评估。表8将注射用重组人生长激素的全部输入物料列出，并对可能引起变化的物料进行了识别。

18

表8输入物料的变更分析

物料名称 细胞库（MCB和WCB） 发酵培养基 是否变更 否 风险分析 生物制品的起始物料，是关键物料，由于在原址增建车间，因此种子批采用和原车间相同的种子批，需规定采用相同的转运方式。 否 半合成培养基，是关键物料，来源和质量标准和原车间一致。储存和称量的地址均未变化。 各种盐 否 初纯和精纯使用了各种盐，如作为缓冲剂的磷酸盐等，这些化学物料的来源、质量标准未发生变化，检测、储存和称量地址均无变化。 层析介质 否 层析介质是关键物料，来源和种类对分离影响很大，因此是不能变更的。采用和原车间一致的采购、质控、存储。 过滤膜 否 过滤膜的来源、材质非常重要，不能变更。采用和原车间一致的采购、质控、存储。 工艺空气 是 工艺空气和产品接触的单元操作主要是发酵和除菌过滤。发酵需要通气保持溶氧。过滤是通过气压使半成品滤过除菌过滤膜。工艺空气系统进行了改造，涉及到变更，风险较高需要进行全面验证。 纯化水 是 发酵和初纯采用纯化水，因为大肠杆菌的发酵相对对水的要求没有细胞培养高，同时大肠杆菌本身产生大量的内毒素，因此在工艺的上游采用纯化水。 注射用水 是 注射用水用于精纯、半成品配制、器具的最后清洗等过程。对于原液生产水是控制内毒素的关键因素，制剂的配料等均采用注射用水，因此注射用水十分重要。新建车间水系统进行了改造，涉及到变更，风险较高，需要进行全面验证。 19

辅料 否 辅料是关键物料，采用和原车间一致的采购、质控、存储，没有变更。 包装材料 否 内包装材料和产品接触，其来源、材质等均是关键属性，新车间采用和原车间一样的采购、质控、存储，没有变更。 氮气 否 在冻干完成后进行充氮气，使瓶内保持少许负压。氮气的来源和质量标准没有变化。 重组人生长激素原液 半成品 中间品1~6 否 这些均是工艺过程中得到的工艺产出物，虽然工艺是在新车间实施的，但其物料质量标准、储存条件没有发生变更。 否 否 输入物料的变更分析可以看出，新增车间由于需要新的制水和工艺空气系统，因此水和工艺空气可能发生了变更。制水和工艺空气系统需要在厂房完成后进行全面的验证，以保证符合预定的要求，并和原车间的控制水平一致。表9对水和工艺空气的关键质量属性进行了风险评估，以便于判断变更对产品质量是否产生显著的影响。

表9变更物料的风险评估

物料名称 工艺参数 空气压缩机压力 储罐压力等 发生频率O* 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 20

严重程度S* 4 4 6 6 6 8 6 8 8 8 8 不可检测度D* 2 2 4 2 2 2 2 2 2 2 2 RPN=O*S*D 16 16 48 24 24 32 24 32 40 40 40 工艺空气 P级过滤器参数 干燥参数 Q级过滤器参数 S级过滤器参数 原水来源 制水工艺 纯化水 清洗工艺 灭菌工艺 管路和分配系统 取样点分布 制水工艺 注射用水 循环保温 管路和分配系统 取样点分布 2 2 2 2 2 8 8 8 8 8 2 2 2 2 2 40 32 32 40 40 *发生的频率O：指发生的频率，分1-10级，从几乎不可能发生失效到发生失效几乎无法避免；严重程度S：指对关键质量属性的影响后果的严重程度评价指标，一般分1-10级，从无失效后果到无警告的严重危害后果；不可检测度D：指不可探测的程度，分1-10级，从几乎肯定到几乎不可能检测。

从风险评估的结果看，虽然制水和工艺空气系统发生了变更，但由于其关键质量属性均是可测的，根据老车间的日常监控，在符合设计要求的情况下，工艺空气和水的质量发生不符合要求的频率也很低，因此RPN值不高，说明水和工艺空气的变更风险较小，可以通过对制水和工艺空气系统的验证，以及日常监控降低风险。

4.2 工艺的变更分析和风险评估

根据图2的工艺流程图对每个单元操作进行分析，找出发生变更的单元操作，然后针对变更的单元操作进行风险识别和评估。表10对每个单元操作进行了风险分析，并分析其是否发生了变更。

表10注射用重组人生长激素工艺单元操作的变更分析

操作单元 发酵培养 是否发生变更 是 风险分析 新车间采用新发酵系统，发酵体积放大了一倍，因此本操作单元风险较高，需要进行风险的识别和评估。 捕获菌体 否 采用和老车间一样的设备和操作条件，通过增加设备进行放大，单元操作没有变更。 初纯 否 采用和老车间一样的操作条件和工艺设备，单元操作没有变更。 精纯 否 采用和老车间一样的操作条件和工艺设备，单元操作没有变更。 21

否 配制 药品的配方对产品的质量产生重大的影响，同时配方为注册标准，因此为关键工艺参数，变更需重新申报。同比放大体积，配制方法和储存条件没有变更。 除菌过滤 灌装 冻干 钆盖 包装 是 是 否 否 否 变更为两级过滤，增加一个除菌过滤膜。 批量增大使灌装时间延长。 采用和原车间一样的操作条件，单元操作没有变更。 采用和原车间一样的操作条件，单元操作没有变更。 采用和原车间一样的操作条件，单元操作没有变更。 从表10的分析可以看出，新建车间的变更主要发生在发酵培养、除菌过滤和灌装3个单元操作中。表11针对这三个单元操作的工艺参数进行了风险评估。

表11注射用重组人生长激素工艺的风险评估

单元操作 工艺参数 温度 通气量 发生频率* 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 2 2 22

严重程度* 8 6 6 6 6 6 6 8 10 8 10 8 不可检测度* 2 2 2 4 2 2 2 2 2 2 2 2 RPN 32 24 24 48 24 24 24 32 40 64 40 32 发酵培养 转速 补料速度 pH控制 培养时间 过滤体积/过滤膜面积 过滤压力 除菌过滤 完整性测试 半成品保存时间 半成品保存温度 灌装 温度 灌装体积 灌装速度 单元操作时间 *同表9的说明

2 2 2 8 4 6 2 2 2 32 16 24 根据表11的风险评估可以看出，虽然发酵培养、除菌过滤和灌装的操作单元发生了变更，通过对其工艺参数的分析可以看出，由于单元操作的关键工艺参数均可测定，并易于控制，发生不符合的频率较低，因此总RPN值没有超过64的，说明变更的风险不大。可以通过工艺验证，证明其工艺的可控性，并证明对产品的质量是否产生显著的影响，并通过中间品或半成品的检测降低其风险。

从以上的风险评估看，本次的场地变更虽然物料和单元操作均有变更，但变更对产品质量的潜在影响比较小。生产工艺应进行充分的验证，包含对工艺文件的核查、培训情况的确认、工况系统的确认、工艺设备的确认、生产操作和监控、取样和检验、时限验证、稳定性的考察。在工艺验证通过的前提下，通过产品的日常监测可以降低引起质量不合格的风险。

第5章 对比研究结果

5.1 原液的对比研究结果

5.1.1 结构确证

两个车间各取3批原液进行结构确证。 结构确证检测项目 N末端测序 C末端测序 分子量Dalton 二硫键 新车间 NH2-FPTIPLSRLF SVEGSCGF-COOH 22083.9 Cys53-Cys165 Cys182-Cys189 肽图质谱覆盖率 100% 23

老车间 NH2-FPTIPLSRLF SVEGSCGF-COOH 22093.4 Cys53-Cys165 Cys182-Cys189 100% 圆二色谱法 消光系数，M-1 cm-1 氨基酸组成 与对照品一致 16,863 与理论一致 与对照品一致 17,070 与理论一致 结构确证说明变更场地生产的重组人生长激素的结构是正确的，和原车间的产品一致。

5.1.2 生物学活性

采用去垂体大鼠体重法和胫骨法测定生长激素生物学活性，分别检测连续3批原液的比活，新车间平均比活为3.1IU/mg，原车间平均比活为3.0IU/mg。均符合《中华人民共和国药典二部》的规定，两个车间的原液生物活性一致。

表12两个车间生物活性的比较

车间 批次 生物活性（IU/mg） 平均值 5.1.3 免疫化学性质

1 3.05 新车间 2 3.14 3.1 3 3.09 1 2.98 老车间 2 3.10 3.0 3 3.04 采用免疫斑点试验对重组人生长激素的抗原特异性进行检测。检测均呈现阳性。

表13两个车间免疫斑点检测结果对比

新车间 批次 1 免疫斑点结果 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 2 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 3 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 4 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 24

原车间 批次 1 免疫斑点结果 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 2 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 3 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 4 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色

5 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 5 阳性对照品显色，阴性对照品不显色，供试品显色 5.1.4 纯度、杂质和污染

新车间进行了连续20批原液的放行检验，均符合内控放行标准。将这20批原液的纯度、杂质和污染，和原车间历史数据进行了比较（见表14）。可以看出两个车间纯度和杂质的均值和SD值一致，说明两个车间的生产对纯度和杂质控制水平是一致的，变更未对原液的质量产生不利的影响。

表14原液纯度、杂质和污染的比较结果

检测项目 新车间 均值 SD 0.67% 0.07% 0.5% 0.02 0.93 / / / 老车间 均值 2.30% 0.28% 99.7% 1.02 13.37 <0.25 <2.5 <2 SD 0.58% 0.09% 0.5% 0.02 0.69 / / / 相关蛋白质 高分子蛋白质 电泳纯度 含量(mg/mg蛋白) HPLC含量（mg/ml） 细菌内毒素 菌体蛋白残留量HCP 外源性DNA残留量（DNA探针杂交法） 电荷异构体（等电聚焦法） 2.18% 0.32% 99.8% 1.03 13.02 <0.25 <2.5 <2 电泳图谱比对，从条带数目和深浅上未发现差异 除了对杂质含量进行了统计比较外，同时对新老车间杂质谱进行了分析： ? 反相色谱检测：杂质峰谱一致，没有发现新的杂质峰。说明两个车间质量是

一致的，变更车间没有产生新的杂质。

? 分子排阻色潽法检测：除了二聚体和多聚体峰外，没有产生新的杂质。 ? 非还原SDS-PAGE电泳：除主带外，没有发现新增杂质。 ? 等电聚焦电泳：除主带外，没有发现新增杂质。

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1 2 3 4 5 6 7 89 10

97.4k 66.2k

43.0k

31.0k

20.1k

14.4k

图5两个车间的电泳图谱对比

（1~4为还原电泳图，7~10为非还原电泳，5为Marker，其中：

1~2和9~10为新车间，3~4和7~8为原车间）

可以看出两个车间原液杂质谱没有差异，变更车间没有对原液质量产生不利影响。

5.1.5 强制降解试验结果

两个车间各去一批原液进行高温的强制降解试验，采用反相色谱、分子筛色谱和等电聚焦色谱检测方法对降解途径进行分析，以比较降解途径是否发生了改变。

40℃温度下放置，分别在第0、5和10天进行性状、酸碱度、相关蛋白、高分子蛋白、可见异物和含量检测。两者性状和可见异物均符合规定，未发生显著变化。两者酸碱度未发生显著变化。

相关蛋白质、高分子蛋白质和含量反映了降解产物的变化，而高分子蛋白质和含量采用相同的检测方法，因此对相关蛋白质和高分子蛋白质的图谱进行了比较。在反相色谱检测中，可以看到新老车间原液高温加速条件下杂质峰相同，未见其他新杂质峰出现。在分子排阻色潽法检测中也看到相同的结果。

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—原车间 —新车间

rhGH

氧脱化 氨

图6两个车间高温强制降解试验分子筛色谱对比图

—原车间 —新车间

rhGH

二聚体

图7两个车间高温强制降解试验反相色谱对比图

5.1.6 长期稳定性

新车间重组人生长激素原液12个月考察期内，含量、高分子蛋白和相关蛋白敏感指标均未发生显著变化，和原车间一致。

表15两个车间原液长期稳定性的比较

车间 批次 1 相关蛋白质 均值 2.0% 2.4% 2.5% SD 0.31% 0.42% 0.36% 27

高分子蛋白质 均值 0.3% 0.4% 0.3% SD 0.05% 0.08% 0.07% 含量 (mg/ml) 均值 14.30 14.59 14.54 SD 0.24 0.16 0.17 原车间 2 3 1 新车间 2 3 2.1% 2.4% 2.5% 0.26% 0.38% 0.35% 0.1% 0.2% 0.0% 0.00% 0.31% 0.00% 13.50 12.51 14.20 0.12 0.16 0.06 新车间原液12个月的稳定性考察结果和老车间长期稳定性历史数据进行了比较,可以初步得出如下结论：

1） 性状：所有批次在考察过程中均为无色澄清液体；鉴别4项、微生物

限度、脱氨组份及细菌内毒素等指标均符合标准规定。 2） 相关蛋白含量均符合规定，两个车间原液在贮存期间稳定。 3） 高分子蛋白质在留样过程中变化幅度很小。 4） 在稳性考察过程中蛋白含量几乎不变。

5.1.7 工艺验证结果和讨论

对重组人生长激素原液相关的文件、培训、工况、工艺设备、生产操作和环境控制进行了全面的验证，表明：

? 生产、监控及检测人员培训到位，能满足生产、监控和检测的要求； ? 车间空调系统洁净度均符合要求；

? 水系统运行平稳，纯化水和注射用水水质均符合药典标准，能满足工艺生产

要求；

? 生产所用物料管理严格，均购置于合格供应商，并按要求检测、存放和使用； ? ?

现有的设备均完成了3Q，并运行平稳；

主要中间品的关键质量属性：纯度和杂质分布均和历史数据相同，中间品质量检测指标要求，未低于行动限指标，菌体得率和表达量和历史数据一致.说明各单元具有相同的去杂效率，变更车间没有对中间品关键质量属性产生影响。

5.2 成品的对比研究结果

5.2.1 放行检验结果

两个车间制剂的性状、无菌、鉴别、装量差异、异常毒性、溶液的澄清度与颜色

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和细菌内毒素均符合成品的质量标准，并且没有差异。

比较两个车间的定量指标：酸碱度、水分、相关蛋白质、高分子蛋白质、电泳纯度、不溶性微粒、含量也均符合成品的质量标准，两个车间的均值和SD基本一致，说明变更车间没有对上述指标产生不利影响，两者是一致的。

杂质分析和比较结果如下：

1) 反相色谱检测，两个车间各有相对保留时间一致的4个杂质峰，除了这4个

杂质峰外，没有出现其他不同的杂质峰。并且这4个杂质的比例也非常一致，说明两个车间质量是一致的，变更车间没有产生新的杂质。

2) 分子筛检测，两个车间各有2个杂质峰，除了相对保留时间0.88-0.90的二聚

体峰外，在相对保留时间0.64-0.66还有一个未知杂质。两个车间均有此未知杂质，变更车间没有产生新的杂质。

3) 通过比较非还原电泳图谱，除主带外，两个车间各有1条相对迁移比例

0.80-0.82的杂质带，制剂I车间较制剂III车间有一批多一条相对迁移比例0.85的杂质带，说明变更车间没有产生新的杂质。

通过上述比较可以看出两个车间成品质量一致，变更车间没有对成品关键质量属性产生影响。 5.2.2 生物学活性

连续测定3批4IU规格成品的生物学活性，新车间平均生物学活性为4.4IU，和原车间平均4.2IU历史数据一致。

表16新车间3批成品生物活性结果

批次 生物活性（IU/mg） 平均值 5.2.3 稳定性 5.2.3.1 强制降解试验

1 4.4 2 4.3 4.4 3 4.5 比较了高温降解试验两个车间制剂反相色谱和尺寸排阻色谱的色谱图，未发现新增杂质峰。分析相关蛋白和高分子蛋白的增长率，新车间制剂相关蛋白和高分子蛋

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