SSCP实验步骤

SSCP实验步骤

一、泡菜液细菌总DNA提取

1． 样品中加入500μl裂解缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl,0.1mol/L EDTA,1.5mol/L

NaCl,1%CTAB;pH8.0）,20μl溶菌酶(25mg/mL),于37℃处理40min. 2． 加入5μl蛋白酶K(10mg/mL)于37℃处理40min. 3． 再加入120μl SDS(10%),65℃处理2h.

4． 粗提的DNA中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)上下颠倒,混匀25min,离心

(12000g,10min).

5． 取上清加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)上下颠倒,混匀5min,离心(12000g,30min). 6． 取上清加入0.6倍体积的异丙醇常温沉淀1h,离心(12000g,15min)后去上清液. 7． 用70%乙醇洗涤一次,1ml,2min,离心12000g,5min,将DNA溶于30μl无菌水. 8． 加入1μlRNase(20mg/mL)50℃10min. 二、PCR扩增(25μl反应体系) H2O 15 Buf 2.5 Mg2+ 2 dNTP 2 引物1 1 (f341) 引物2 1 (r533) Ex-Taq 0.25 DNA 1

94℃预变性5min;94℃变性40s,50℃退火30s,72℃延伸35s,30个循环;72℃10min. 三、λ核酸外切酶降解标记的反意义链

反应体系中包括:λ核酶外切酶1μl,10×buffer 2μl,PCR产物20μl.37℃温浴过夜,处理完毕后,75℃10min灭活λ核酸外切酶. 四、电泳

清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净,用前用酒精擦试,烘干后,固定,倒入下层分离胶,加1ml水使液面平整,待分离胶凝固后把水倒出,倒入浓缩胶,插入梳子,随时观察凝胶聚合情况并补加丙烯酰胺.室温聚合1小时后,向电泳槽加入1×TBE,拨掉梳子,用注射器冲洗点样孔. 250V预电泳30分钟,同时准备点样.

30%聚丙烯酰胺 5×TBE 双蒸水 80%甘油 10%APS TEMED 分离胶22% 9.27ml 2.52ml 0 0.774ml 86.4μl 6.273μl 浓缩胶9% 1.25ml 0.84ml 1.84ml 0.258ml 28.8μl 2.091μl 取4μlPCR产物置于PCR管中,加4μl变性buffer,离心混匀,98℃变10min,迅速冰浴10min,加入点样孔.250V电泳18小时. 五、染色 1.固定 2.银染 3.显色

六、条带回收(PAGE胶回收试剂盒)

1.切下凝胶,转移到1.5mlEP管中,用30μl无菌去离子水冲洗2次.

2.加入30μl洗脱液(0.5M醋酸铵,10mM醋酸镁,1mM EDTA,0.1%十二烷基硫酸钠),用无菌的大枪头捣碎,再加入80μl 洗脱液,60℃培养2小时,4℃,5000g离心5min. 3.吸取上清液到另一支EP管中.

4.PAGE胶回收试剂盒回收,最后加入20μl双蒸水. 七、回收产物PCR扩增 H2O 18 Buf 2.5 Mg2+ 1.5 dNTP 1 引物1 0.5 引物2 0.5 Ex-Taq 0.2 DNA 1

94℃预变性5min;94℃变性40s,56℃退火30s,72℃延伸35s,30个循环;72℃10min. 八、λ核酸外切酶处理,产物再次跑胶,检测是否是单条带 九、克隆

1.PCR产物回收(琼脂糖凝胶回收试剂盒) 2.PCR产物与T18载体连接

T18vector 0.5μl , Solution 2.5μl , PCR回收产物7μl . 4℃过夜连接. 3.连接产物的转化

A.将连接产物吸到100μl感受态细胞中,温和混匀,置于冰上30min.

B.42℃热休克90s,迅速放回冰中,将细胞冷却1-2min后,加入800μlLB培养基,37℃,125rpm,摇荡培养细菌45-90min.

C.4000rpm离心1min,沉淀菌体,吸去上清液,留250μl左右转化混合物铺于LB琼脂平板上(Amp+),室温下放置20-30min,待溶液完全被琼脂吸收后,倒置平皿37℃培养12-16小时. D.随机挑取单菌落作PCR进行初步检测,并振荡培养.

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