昆明小鼠胰腺干细胞分离培养及特异性标志物巢蛋白的鉴定

探讨胰腺干细胞的分离、培养及其特异性标志物巢蛋白鉴定的基本技术方法。选取新生昆明种小鼠25只,分离胰腺组织,V型胶原酶消化,结合自然沉降技术形成不连续密度梯度离心。分别从磷酸盐缓冲液门.068g／L Percoll液(第一界面)、1.068g／L Percoll液门、096g／LPercoll液(第二界面)、1.096g／L Percoll液门、118g／L Percoll液(第三界面)收集细胞。各界面细胞均加入含体

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8中国组织工程研究与床康复第 卷第 7￣ 2 0 - 2 1出版 J 0 7 0- J u n l f iia Re a i at e Ts u o r a o Cl c l h b l i is eE gn e n n# v n ie d gRe e r h F b u r 1, 0 7 s a c e r a y 8 2 0 V/7 。. o. N Z No 7",.

基穗 l医学

昆明小鼠胰腺干细胞分离培养及特异性标志物巢蛋白的鉴定★★★陈维平’岑妍慧’,,叶健 何少健’刘琼东，,,袁路’’ (广西医科大学组织学与胚胎学教研室，西壮族自治区南宁市 5 0 2;广西壮广 30 1族自治区计划生育研究中心，西壮族自治区南宁市广 5 02 ) 3 0 1 P r l液 (二界面 ) 10 6gLP r l液门、1/ ec l液 (三 ec l第 o、.9/ ec l o 1 8 gLP r l第 o界面 )收集细胞。各界面细胞均加入含体积分数为 01胎牛血清的、 D M低糖培养基，于经多聚赖氨酸处理的培养瓶中常规培养。2 ME置 4h后将培养基更换为不含胎牛血清的 DMEM低糖培养基，并加入 1 / 0 mgL的角质细胞生长因子和 2 , 0 L的碱性成纤维细胞生长因子，察体外培观养的各界面细胞的形态学特征。胰腺的内分泌部存在 1细胞，硫腙能 3双与 1 3细胞分泌颗粒中的锌螯合而呈现铁红色。收集的各界面细胞进行将

广西科技厅资助项目(科青 0 2 o 9;科攻 0 9 0 7 1 )广西计桂 29 0桂 5 2 0—G“;划生育委员会科研课题 (人口计生研 0 0 桂 5 2)

I o a i n nd u t e f pa r a i se e l f o s l to a c lur o nc e tc t m c l s rm Knn i o e a m ng m us nd he i e i c to o si a t d ntf a i n f Ne tn sis s e i c m a ke t p cf r r i

ch n We.ig, C n Ya—u’ Y i e i n’ p e nh i, e Ja , H a -a 1 Lu e Sh oj n, i iQing d g, Yu n Lu (De rm e tOfHit o n o - on a ’’ pa t n

solgy a d Embrol y, y o gGan xi g Me I al Ci Unieri, Na ni 5 00, Gua gx u g c v st y n ng 3 21 n iZh an Auon m o gi t o us Re on, ia; Chn Re ea c s r h Cenero ami an ig o t fF l Pl nn f y

双硫腙染色，测细胞来源。疫组织化学法检测各界面巢蛋白的表达。检免结果第一、界面细胞 6%~ 0双硫腙染色呈阳性，源于胰腺的内二 5 9%来分泌部；三界面细胞双硫腙染色呈阴性，源于胰腺的外分泌部。胰第来从腺的内分泌部获得的细胞聚集呈胰岛样细胞团贴壁生长，8 7 4 - 2 h后可见许多大、、个核的细胞从胰岛样细胞团中向周围长出，附壁生长圆单以的方式在局部形成细胞集落。胰腺的外分泌部获得的细胞主要呈上皮从

G u g Zhu n Auon an￣ a g t omou s Regon Nan n 5 0 i, nig 30 21, G u n i a gx Zh a t n u ng Au o omou g in, i s Re o Chnasl硼 l e y: a gr n m m h i c n ec n o y Bu e f甲 r d b a tf t t e Scen e a d T h ol r au o g G u g Zh an an￣ u g Autno o g in,No 2 00 o m us Re o .0 29 9:05 20 7. G 9 0 1: t e ci t h S en讯c Res arh e c Pr r m o am i a ig e mm i e g o a fF l Plnnn C y￣e o f Gu gx an i Zhu n Auon a g t omou s Rego in.No. 0 05 2 Ab ta t To e po e t e b sc t h qu o s lt n u ur h sr c: x lr h a i ec ni e t ioa e a d c k e te

样生长，逐渐汇合成片，上皮样细胞集落的周围可见大、、个核并在圆单的细胞生长并形成集落。各界面大、、个核的细胞，蛋白均呈阳性圆单巢表达。提示从胰腺内、分泌部的组织中能成功获取胰腺干细胞特

异性外标志 N si达阳性的干样细胞。 et n表 关键词：腺，胞学；问丝蛋白质类；鼠胰细中小陈维平，妍慧，岑叶健，少健，琼东，路 l小鼠胰腺干细胞分离培养及特异 何刘袁昆明

p n rai tm l n d n晦 i p c c mak r fN si。 w a ce t se c l a d ie t t s e￣ re e t e c e s s o ns lc e n wb ee t d 25 e om Kun ig m i . mn e c Th p n r a i t s e e a ce t c i u wa s s

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a d e a td y n s p r e b a

dic n iu s s o tn ou de i nst y grdi t a en e tfg t c ndu ai on bn n idig ph si- ub i nc, C l y o s sde e e l wer l c e m m he fs n e a s ec l t o e d f t rtit f c o i e f ph s ae u e/, 8 g L Per l s c n nera f 106 / o ph t b f r106 / o . c 1 e o d it f c o . 8 g L e

P rol .9 gL P r l a d ti itr c o 10 6 gL ec l1O 6, ec I n hr nefe f/ o d a,9 , P rol, 1 , e c l a d c l a e n a c l r a k t ae e c l1 1 g L P r l/ 8 o。 n ut t i ut e f s r t d i d v u l ew t o sn f ra d n w ab h d t s D i p My ie a e d ig I c ro y r e ME c n an , h t o a M t ie 0 1 o dv ume f cin ol r t o FBS. Twe t-ou ou It r t e a ny f r h r a e . h medu s im wa s

性标志物巢蛋白的鉴定【, J中国组织工程研究与临床康复， 0 7 1 () 2 21 8 】 2 0,17: 8 -2 3 1[ w . l f m/ l f ju l p I,777 -2 p ) d w w z c, z c/ o ma u fe 0 -,k1 8 s. f g kc e g ke/is p]

0 5言 I

r pa e y s r m- e ME me im t h d i n o 0 mg L e l db u f e D c e r M du wi t e a dt 1 , h i f ok a t o ye r wt f cor a d 0 L a c i o ba t r wt er i c t g o h a n t s n 2 u b si f br ls g o h f cor o o ev a t t bs re t m oph o ial ha cer of e l a ea h he r ol c c r t s g a c l s t c

糖尿病作为一种以持续性高血糖为特征的内分泌

it f c . 1 c l r o n n t e i e Is ce o y p ro f n e a 3 e l we e f u d i h n ma e rt r o in o e s t t p n r a: d hz n h lt i i e rt d f m 1 l n a ce s￣ i e c eae w t zn s ce e r o d h e o 3 l ad e c spr e t r rd. AI c l ol ced f m e ch it fa es n e si d en e Ie l c l t m s e a nef c wer e e gien di ion t nig t d ec h i s ur s Th xpes i f v t z e sai n o et t t er o c, h e e e r son o prt i o en Nesi tn, t e s ec h p￣c marero n e t t k fpa cra i sem l。 wa c e s c l s deece y i t t d b mm u c tc m ialas a, 6%一9 no yo he c s y 5 0% c l r m h e l f s o te is d s c d it rac h we ost e i i on t nn d frtan e on n ef e s s o d p iv n dt z e saiig an i hi der e r m h nem a s rt y p ti f p cea id f v o t e it I ece or oron o an r s: te e l h c l s f m h hi ner e m t e t r it f d ac wer g a ie n c e ne tv a d am e f m te xem a r o h e t I s c eor ori an r a e

r t y p tonofp c e s, Cel g eg t∞ m h ori f l a gr a i f s on t e p ton o p cea dh e s is l -k lg up, a d 4 72 h r er an r s a er a n ui l e c I r d ni e o n 8- ou I s at。 man i r n d m o on cl rc l p eard f m h e c l y bg. ou d an n u ea l a p e s e∞ tos eI

障碍综合征，导致全身性代谢紊乱，可并继发眼、、肾神经、血管等器官的慢性进行性病变，心引起功能损伤及衰竭”。在成体的胰腺组织中是否存在低分化的干细 l

胞，何有效的将其分离并在体外条件下纯化、增培如扩

养，目前存在争议。获得足够数量的胰腺干细胞，临为床治疗糖尿病探索新的途径，在技术和方法上仍有一定的困难。

1材料和方法 11材料实验于 2 0— 72 0— 5在广西医科大 . 0 5 0/0 6 0

g o p; te e c l g rg t u tl e c lne, C l∞m h ru s h s l a g e ae js i o is e l f e s d k o s teet xem a s cr or p to o p n e e h l I e et y or n f a cras p￣ ei—k y i um l el gr i ew a d n gr du l u e o l .Bi o u d a a al f s y d t si e c g,r n nd mon ucea l pp r d on l rc l a ea e e s a o d to e c lgr p nd a gr g t d i tI e c l i,Ne t r un h s I ou s a g e a e us i ones e k o si o nf t e bg, run nd m o on l rc l owe ost e e prs on h i o da n ucea l sh d p iv x e si。 e s i idc t g t a h se c l t mm u or c ie p siv s i s n i i h tte tm l w h i a n e si n ea v t o t e Ne t a i n t e an e t se h p c a i t m c l a e ud r c e l m r r c l be a e t

S c S f l s k o h r se v d UC e SuI y fo t e it a d e t r m h nem I an xem a ece or o in o a cr sts ue. I s rt y p r o fp n ea is tCh n W P, C n YH, Y . He S, Lu QD, Yu n L I a in a d c l r f e e eJ J i a l olt n ut e o s o up n ra i t m e l f a c e t s e c l r c s om n n o s n h e t c t n o s i a Ku mig m u e a d t e i n i a i fNe t s d i f o n

学完成。选取 S F级新生昆明种小鼠 2 P 5只 (由广西医 科大学实验动物中心提供 )体质量 5 - 0 ,雄不， 0 10g雌拘。主要试剂：型胶原酶 ( g )胎牛血清 (州四 V Sima;杭

季青，批号 0 0 0 7 )D M低糖培养基 ( S 5 3 3 0; ME U AHy ln 0; rol co e P1 2) Pe c I液 5 ( me s am p a ma i a rh h r ca

boe h;质细胞生长因子 ( ima;性成纤维细 itc )角 Sg )碱胞生长因子 ( ima;巢蛋白抗体 ( S e c n Sg ) U A Ch mi o MA 3 3;聚甲￣ ( ima。 B 5 )多 -Sg ) 12方法 .胰腺干细胞的分离：鼠颈椎脱臼法处死，小

i p c c ma e .h n g o Z z i o g h n a j u L c u n a gu t s e m r r o g u u h G n c e g Y ni y i h a g K n f s k Z u n 2 0; () 2 2 1 8 ( h a 0 71 7: 8 -2 3C i ) 1 1 n[w z lf w w, c gk -/k1 8 (s. f 77 -2 2 p ) d] p

摘要：讨胰腺干细胞的分离、养及其特异性标志物巢蛋白鉴定的基探培本技术方法。选取新生昆明种小鼠 2 5只，离胰腺组织，型胶原酶消分 V化，合自然沉降技术形成不连续密度梯度离心。分别从磷酸盐缓冲液结门.6 / ec l液 (一界面 )10 8 gL P r l液门、9 / 0 8 gL P rol第、.6 / ec l o 0 6 gL18 22

经体积分数为 07 .5的乙醇消毒，

露腹腔，离胰腺，暴分在预盛 D H n’的培养皿中剥离胰腺表面的被膜 - a k s液POBx 20Seyn 104 k 380 3 i . r w w.lfo :. 0,hnag 100 f 358@s a o w￣ c . m o1 2 n cn g kc

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