RNA提取经验

RNA纯化作为分子生物学实验的起始实验由于其繁杂的抽提过程且稍不注意样品容易被RNA酶降一直困扰着诸多的科研人员。针对于不同的样本应该采取不同的处理方法和抽提方式。细胞样品是几类样本当中最容易抽提的样本，裂解充分且不易降解；动物组织则相对较难，一是样本容易从活体脱离之后容易被降解，第二是有一些样本不容易打碎裂解，比如骨组织、肌肉组织等；而植物组织抽提RNA最常见的是杂质多。本文从采集样品开始来一一解决您RNA纯化过程中的难题。

一、抽提RNA的目的及各实验对RNA抽提样本的要求：

1、cDNA文库、芯片实验要求RNA完整性而无酶反应抑制物残留； 2、Northern对RNA的完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低； 3、RT实验堆RNA完整性要求不高，但RACE实验除外，但由于通常下游做PCR实验，所以对酶反应抑制物要求较高。

二、各样品中RNA的含量

高丰度（2-4ug/mg）：肝脏、胰脏、心脏

中丰度（0.05-2 ug/mg）：脑、胚胎、肾脏、肺、胸腺、卵巢 低丰度（＜0.05 ug/mg）：膀胱、骨、脂肪

三、样品的采集与保存

在样品离开活体之后或者离开了原来的生长环境，内源性的RNA酶释放出来会马上降解RNA，降解的速度与内源性RNA酶含量及温度高低有关，所以必须马上进行内源RNA酶的失活。

我们通常采用的原始方法有两种，迅速研磨破碎后加入裂解液（胍）中保存；二是立即切成小块投入液氮中。

但是加入裂解液的方法并不适用于样品内源性酶含量高的样本，也不适用于不容易研磨的样本，比如植物杂质较多，肝脏、胸腺、胰腺、脾脏、脑等内源性酶较

多，肌肉、骨组织等不易研磨都不适用于该方法；而液氮法虽然适用于更广泛的样本，但是液氮使用稍有不当便会引起人员受伤，且携带不方便，不适用于异地采样和样品的转移。

这里为大家介绍第三种方法，RNAlater溶液。RNAlater溶液是一种水样的储存液，能稳定保护新鲜未被冷冻的组织样品（冷冻样品可使用RNAlater ICE）。采集样品之前无需携带危险的液氮或者裂解液，只需携带几个装有RNAlater的离心管即可。采样后将组织样品浸没，溶液技能深入细胞，稳定RNA。而后样品试问保存一周，4℃一个月，-20℃可长期保存。使用RNAlater保存的样品可以与玻璃纤维结合法、酸性苯酚法以及使用Oligo(dT)分离mRNA等方法结合而不再需要特殊处理出去样品中的RNAlater，所以使用起来更加的方便省力也更加安全。

四、影响降解和得率的重要因素-----破碎和匀浆

根据样品种类来区分，细胞是最易抽提的样本，由于其不需要破碎即可直接匀浆且样本可直接变为流体形式和裂解液充分混匀，所以也大大减少了被内源酶降解的可能。

动物组织则需要充分破碎再匀浆，尤其是一些不易破碎的组织，比如柔韧的结缔组织、坚硬的骨组织，都需要先充分破碎再匀浆，否则会严重影响RNA的产物浓度，得到的RNA样本浓度较低且未被破碎的部分很快被降解掉了。内源酶含量低且交易匀浆的组织，可以再裂解液中通过匀浆器一次性完成破碎和匀浆的过程，否则必须分开来操作。

酵母菌和细菌等有壁的样本，需要使用相应的酶先破壁然后才能进行匀浆。 植物则比较容易破碎匀浆，但困难的去处杂质，如果植物组织的杂质被去除干净之后其抽提的难易程度和细胞类样本相当。

五、裂解液的选择和RNA的降解

常用的裂解液几乎都能够一直Rnase的活性，因此选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。但猪呢对于内源酶含量高的样品可以使用在裂解液中加入本

分的方法，以增加灭活内源酶的能力。

RNA的讲解可以说是RNA抽提过程中最困扰实验人员的因素之一了。 针对于新鲜细胞来将如果试剂是没有任何问题的，外源性污染基本可以排除，那么降解很大程度都来源于实验人员加入的裂解液量的不足。加大裂解液的用量即可改善结果。

新鲜组织如果内源性酶含量低且易匀浆则和细胞一样的处理方法，但是针对于那些内源酶含量高的组织，即使使用电动匀浆器也不能避免RNA的讲解。可以使用液氮条件下将组织研碎，也可直接使用RNAlater来保存样本，这样就可以避免这种情况了，可以在常温情况下来研磨组织或者用匀浆器研碎组织即可。而针对于这样的组织在研碎后需要加入更多的裂解液来裂解样本。

冷冻样本，对于采集的样本除非置入RNAlater中保存外，如选择使用-70度冰箱保存绝对不可直接置入冰箱中，必须先经由液氮迅速冷却之后才可置于-70度的冰箱中保存样本。针对于冰冻样本，可选择RNAlater ICE。针对于冰冻组织如果不经过任何处理直接破碎很容易产生降解并改变RNA的表达谱，所以可以使用RNAlater ICE来解决这个难题。直接将冰冻样本投入RNAlater ICE溶液中，使其在溶液中解冻，而在组织从坚硬的冰冻状态转变为柔软状态时，该溶液即深入到组织中，是RNA酶失活，起到了在室温下保护冰冻组织RNA的作用。 针对于一些脂肪含量高的组织可以在裂解之前使用氯仿来先取出脂类物质，然后再进行裂解操作。

针对于植物样本来说前处理情况比较复杂，由于大部分植物当中都含有针对于RNA抽提来讲可视为污染的物质，例如多酚和多糖，而这两张种物质的残留往往会影响下游实验的结果。建议进行植物RNA抽提的客户使用Ambion公司的Plant RNA Isolation Aid来去除植物的污染物后再进行RNA抽提操作，而去除污染后的植物样本抽提起来就像抽提细胞类样本一样容易了。Plant RNA Isolation Aid含有一种高分子量的聚合物，可以结合植物中大部分的污染物，尤其是多酚和多糖。建议下游可使用玻璃纤维滤器的方法来分离RNA，这种方法没有任何乙醇沉淀的步骤，所以特别适合用于分离植物RNA。因为已知许多植物组织中普通的污染物可以通过乙醇共沉淀的方法和核酸一起共沉淀，这样就严重影响了

植物组织RNA抽提结果的质量。比如Ambion公司的RNAqueous系列产品就是一类不使用酒精沉淀的方法的玻璃纤维滤器抽提系统。

这里推荐大家一个比较详尽的介绍各种组织处理方法解决方案的网页：http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_183.html，它对每一种组织都给出了详尽的处理办法。

六、如何选择一款适合自己试验的抽提试剂盒

总的来说RNA抽提的方法有四大类：固相硅胶吸附技术、磁珠技术、阴离子交换技术和酚法有机抽提技术，也有的比较好的试剂盒是结合了这几项技术之后所研发产生的更加方便抽提质量更好的Kit。

现在又各种各样的试剂盒供科研人员进行选择，而其中最简单的为柱式分离的方法，前面提到他是结合了玻璃纤维滤器的方法，这样的优点就是不需要有机相的萃取、不需要乙醇沉淀或者蛋白质酶消化的步骤，是一种无苯酚操作系统，20分钟的快速操作即可完成实验。而对于下游需要进行RT-PCR或者QRT-PCR的实验人员来讲，大家需要的是抽提出的RNA样本中绝对不含有DNA残留，否则很难对实验结果进行区分，这样就需要去除RNA样本中的DNA残留。RNAqueous-4PCR Kit中含有了全部的去处基因组DNA的配套试剂，经处理后RNA样本无DNA残留。且该试剂盒中还含有一种特殊的物质，这种胺类物质可以再通过乙醇沉淀法配合使用来浓缩洗脱RNA，以增加产物浓度。也可以选用单独的DNA-free Kit、TURBO DNA-free Kit来去除基因组DNA。

针对于血液样本，可以选择RiboPure-Blood Kit，它划时代的直接从全血当中直接获得高产率高质量的RNA，而不需要预先分离白细胞，并且该试剂盒中还配备了RNAlater溶液以增加血液样本中RNA的稳定性。

或者可以选用最通用的TRI Reagenet溶液，样品在TRI Reagent中被溶解后加入氯仿后即可分为三相，RNA被划分如最上层的水相当中，DNA在两相之间，蛋白质则在下层的有机相中。随后加入异丙醇来沉淀RNA。

七、抽提实验前的准备

所有做过RNA抽提实验的人烦恼于RNA抽提实验的前期繁杂准备工作，但由于RNA酶无处不在，所以又必须在整个操作过程中避免产生新的RNase污染。除非去购买现成昂贵的一次性耗材否则我们所有的加样枪头、管子等都需要经过DEPC的处理。DEPC的配置虽然很简单，但是DEPC的毒性却不容我们所忽视，还有就是配置之后需要进过过夜的摇匀处理后才能使用。配置好的DEPC水又必须再使枪头、管子等进行8-12小时的浸泡，之后高压灭菌使DEPC灭活，再进行几个小时的烘干，两三天之后我们一切准备工作做好了之后才可以开始RNA抽提实验操作。这样极其浪费时间也无法避免DEPC对实验人员造成的伤害。而且我们进行抽提实验的其他物品，比如加样枪，超净台，电子天平等等是无法进行DEPC水过夜浸泡的，所以这些物品我们没办法去除其上的RNA酶，稍有不当就会产生RNA的降解。

这里给大家推荐一种方便的产品----RNaseZaq。它有两种形式，一种为可喷洒的溶液式，一种为涂抹的湿巾式，可根据不同的需要选取不同的类型。在试验前进行玻璃器皿表面实验台面等进行喷洒和擦拭，即可取出其表面的RNA酶，完全避免了外源RNA酶降解RNA的问题。也可对普通的加样枪、管子等塑料制品进行擦拭和喷洒以去除其携带的RNA酶，即可免除DEPC处理的操作步骤，节省了时间也避免了被其毒性侵害的风险。 八、小RNA抽提

近年来microRNA已经成为人们研究的热点问题，经研究发现这22个核苷酸的小分子在基因表达调控中起着至关重要的作用，发育、分化、凋亡甚至癌症都与其息息相关。正因为它很重要所以现在有越来越多的人来进行microRNA试验技术和工具的研发，而Ambion公司推出的两款专门针对小RNA抽提的试剂盒则更加的引人注目。

分析小RNA即要求抽提的RNA样本中小RNA绝对不能丢失掉，否则无法进行下游实验，而现在大多数RNA抽提试剂盒的分离程序都用来回收信使RNA而往往忽略了更小的RNA。这些操作进行之后我们抽提出的总RNA样品中往往小RNA在很大程度上已经丢失掉了，而采用标准的玻璃纤维滤器或者硅酸盐媳妇

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