GST融合蛋白表达与纯化

一、蛋白质纯化流程图

图1 可溶性重组蛋白的纯化图解，这种蛋白质可以被分泌或定位在周质内、膜组分内，或在大多数情况下在细胞质内。第一步是得到含有可溶性目的蛋白的提取物，之后可以进行常规的纯化步骤，或用亲和方法纯化带有标签的融合蛋白。

图2 在宿主细胞的细胞质中以包含体形式生产的不可溶性重组蛋白的纯化图解。必须将细胞破碎开，然后通过差异离心分离不可溶的包含体，使用变性溶剂来溶解，当除去变性剂后，溶解的蛋白质发生复性，还需要进一步的精制步骤来除去少量的污染蛋白质和未正确折叠的蛋白质。

图3 存在于天然宿主细胞中的可溶性蛋白质的纯化图解。必须将细胞破碎，以释放出蛋白质，通常每克细胞加入2-10ml适当的缓冲液，在除去不溶性材料后，处理通常需要几步，按正确的顺序使用各种标准的分级分离方法。要生产高纯度蛋白质，可能会需要最后的精致步骤，以除去最终的微量污染物。

图4 与膜相关的和溶解性差的蛋白质（非重组的）的纯化图解。通过分离含有目的蛋白的细胞器，可以实现第一步的纯化。通常用非离子型去污剂来溶解膜蛋白，尽管松散解离的蛋白质也可以在高pH、含EDTA（或使用少量的有机溶剂，如正丁醇）的条件下不用去污剂来提取，如果自始至终都需要有去污剂来维持蛋白质的完整性，则需要对常规的分级分离方法进行一些修改。

二、大肠杆菌表达系统的选择

基本方案一在p L启动子控制下的表达：温度诱导

与含有p L启动子载体一起使用的大肠杆菌宿主菌必须含有一种由cI857编码的温度敏感的阻遏蛋白，或作为休眠噬菌体整合到宿主的染色体中，或构建在携带外源基因的同一质粒中。在高温下，cI857基因的表达被灭活，呈现阻遏作用，使p L启动子下游的基因转录。细胞首先在30℃生长至理想的密度，然后将温度升至42℃，便可诱导蛋白质的合成，合适的抗生素是由表达载体决定的。

材料（带√的项见附录1）

含有在p L启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株（如Coli B、W3110）

√LB培养基

√1000x抗生素贮液

20ml无菌培养管

42℃水浴摇床

150ml摇瓶，无菌

1、制备少量大肠杆菌宿主菌株的液体培养物，该大肠杆菌是由处于稳定期的含有在p L启动子控制下的目的蛋白基因质粒转化的。方法是：从新鲜的LB琼脂平板上挑单菌落，接种于含2ml LB培养基（补加适当的抗生素贮液）的20ml 管中，将培养管在30℃旋转摇床中200rpm温浴过夜，不要超过30℃。

2、用PBS将一小份菌液稀释10倍，用水作空白对照，测OD600值，以证实培养物已达到稳定期（在1cm光径的比色杯中，OD值为1-2；OD值为1时，相当于0.5x109-1x109个/ml）。

3、将一个含有50ml LB培养基（含适当抗生素）的150ml摇瓶放入42℃水浴摇床中，预热培养基。要确保温度准确（过低的温度将导致阻遏物的灭活不完全，诱导不佳），注意某些宿主菌（如大肠杆菌HB101）不能耐受42℃，在此温度下生长明显降低。

4、将2ml过夜培养物转移至含有预热培养基的瓶中，取1ml样品，按第5步所述的方法进行处理。将50ml培养物放回42℃水浴摇床中，在剧烈振荡（200rpm）下温浴3h。在温浴的最后，取另外1ml样品。在接种和取样品时，操作要快，以保持温度稳定。

5、在室温条件下，用最大速度离心每种样品2min，弃去上清，进行SDS-PAGE 分析（见辅助方案2）。如果要保存的话，在SDS-PAGE前，沉淀物可于-20℃长期保存。

6、用剩余的50ml培养物来分析质粒的稳定性、确定样品的可溶性（见辅助方案3）或制备周质提取物或细胞外培养基样品（见辅助方案4和5）以获得重组蛋白。如果要保存的话，保存剩余的培养物（见辅助方案1）。

基本方案2 在trp启动子控制下的表达：化学诱导

细胞在最低营养培养基中生长至对数生长期，以获得色氨酸饥饿，用色氨酸类似物吲哚-3-丙烯酸灭活残余的trp阻遏物。

材料（带√的项见附录1）

用含有trp启动子和目的基因的质粒转化的大肠杆菌宿主菌株

√M9最低营养培养基加0.5%（m/V）酪蛋白水解物（Difco公司）

√1000x抗生素贮液

√400x吲哚-3-丙烯酸（IAA）

20ml无菌培养管

150ml摇瓶

37℃定轨摇床

1、从新鲜的琼脂平板上挑取含trp启动子和目的蛋白基因质粒转化的大肠杆菌宿主菌株的单一菌落，接种至含有2ml M9培养基（含0.5%的酪蛋白水解物

和适量的抗生素）的20ml培养管，将培养管在定轨摇床上（200rpm）37℃培养过夜。

2、用水作空白对照，测OD600。

3、将过夜培养物移至含有50ml M9培养基/酪蛋白水解物（补加适量的抗生素）的150ml培养管内。

4、取1ml起始样品，立即按第7步的方法进行处理或-20℃保存。

5、在37℃定轨摇床中，剧烈振荡（200rpm）将培养物温浴1-2h，测OD600，以确保细胞进入完全对数生长期（OD600为0.2-0.5）。

6、加入400xIAA贮液至终浓度为1xIAA（25μg/ml）诱导蛋白表达，继续培养3h，取第二份（终）1ml样品。

7、对于每个1ml样品，于室温下，用最大速度离心2min，弃去上清，进行SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。如果要保存的话，-20℃保存沉淀物。

8、用剩余的培养物来分析蛋白的可溶性（见辅助方案3）、蛋白质在周质（见辅助方案4）或培养基中（见辅助方案5）的定位，或分析质粒稳定性。如果希望，保存剩余的培养物（见辅助方案1）。

备择方案1 在lac/tac启动子控制下的表达

对于lac启动子或tac启动子（lac和tac启动子的杂交体）控制下的蛋白质表达，通常往培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使lac阻遏物释放，从而诱导表达。宿主菌必须在染色体或质粒（含目的基因的质粒或兼容的质粒）中含有lac I阻遏物基因。对于这些启动子，按基本方案2（trp启动子）进行操作，但应当用适当转化的宿主菌作为其实材料，而且第6步的诱导，用100xIPTG （终浓度为0.4-1.0mmol/L；见附录1）代替400xIAA。

备择方案2 T7 RNA聚合酶/启动子表达系统

这种方案是通过具有高度活性和效率的T7 RNA聚合酶的lacUV5启动子进行诱导，它与T7启动子（p T7）结合，并在其控制下转录基因。该方案使用大肠杆菌宿主菌，该宿主菌DNA中整合有lacUV5控制下的T7 RNA聚合酶基因，同时该宿主菌转化有在pT7控制下的氨苄青霉素抗性基因和目的蛋白基因的质粒DNA。对于这种系统，可按基本方案2（trp启动子）的步骤进行操作，但应当用适当转化的宿主菌作为起始材料，使用氨苄青霉素选择，而且第6步的诱导，用100xIPTG（终浓度为0.5-1mmol/L；见附录1）代替400xIAA。

将该系统进行改造，使其能够通过第二个质粒（如pLysE或pLysS，它们也编码氯霉素抗性）诱导T7溶菌酶（它与聚合酶结合，这样便在非诱导条件下停止转录），而且且能够在第二种抗生素选择下维持生存。因此还可以利用第二种抗生素（如30mg/L的氯霉素）进行选择。

辅助方案1 菌株保存

材料（带√的项见附录1）

转化的大肠杆菌宿主菌株

√LB培养基

√1000x抗生素贮液

√20%（V/V）甘油，无菌的

√LB平板

20ml培养管

30℃或37℃定轨摇床

1、从新鲜琼脂平板上挑单菌落，接种2ml LB培养基（补加适当的抗生素；在20ml培养管中），在定轨摇床上培养过夜。对于基于p L的系统，温度为30℃，对于其他系统，温度为37℃。

2、核实细胞处于稳定期（OD600为1-2），用50μl接种含有2ml LB培养基（加入适当的抗生素）的20ml的培养管，培养2-3h。

3、在每个冷冻管中加入0.9ml培养物，标记，充分旋涡混合，立即冷冻，于-80℃保存冷冻后的菌株。

4、要从冷冻保存物开始新的培养，用无菌环刮冷冻管的表面，然后在LB平板上划线，或浸入液体培养基中，将冷冻管放回-80℃保存。

辅助方案2 SDS-PAGE分析样品的制备

目的是在变性条件下将样品中的所有蛋白质溶解到溶液中，以便在SDS胶中通过一维电泳能够分辨混合物。如果必要，制备过量的样品，以便能够在几块胶上重复上样。一旦在SDS样品缓冲液中溶解，样品便能够在-20℃保存多年。

材料（带√的项见附录1）

目的样品（见基本方案1和2、备择方案1和2）

√2xSDS样品缓冲液

牙签，无菌的

超声破碎仪（Branson公司，带微探头）

1a、可溶性样品：在1.5ml的微量离心管中，将样品加到等体积的2xSDS样品缓冲液中。

1b、沉淀物样品：用无菌牙签将5-10mg的沉淀物移至一个预先称重的1.5ml 的微量离心管中，称重沉淀物。每10mg加入400μl 1xSDS样品缓冲液，在30-50W 功率下超声10s重悬，始终将超声破碎仪探头置于液面下面，以防止产生泡沫。

2、在加热块中加热至90℃，保持5min。按SDS-PAGE进行操作。

辅助方案3 可溶性分析

为了确定后续的纯化策略，需要分析重组蛋白的可溶性（见第6.1单元）。

材料

表达目的蛋白的转化大肠杆菌宿主菌株

25mmol/L HEPES（pH=7.6；高压，4℃保存可达1年）

50ml和5ml离心管

离心机（如Sorvall RC5B，带SS34转头），4℃

超声破碎仪

注意：在整个过程中，细胞都应当置于冰浴中，以使样品的改变降低至最低程度。

1、在50ml离心管中，4℃、4000g离心15min，收获25ml表达目的蛋白的转化大肠杆菌宿主细胞，弃上清，将沉淀重悬于1-1.5ml 25mmol/L的HEPES （pH=7.6），得到OD600的值约为40。

2、将离心管置于冰浴中，超声3次，每次1min，每次脉冲之间间隔30s，

以防过热。在1.5ml的微量离心管中取100μl细胞裂解物（总蛋白质），-20℃保存备用。

3、将悬液移至5ml的离心管中，4℃、30000g（在SS34转头中为16000rpm）离心30min，将上清（可溶组分）倒入另一个5ml的管中，使其与沉淀物（不可溶组分）分开。

4、制备三种组分（总组分、可溶组分和不可溶组分），用于SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。

辅助方案4 周质提取物的制备

本方案叙述了用小规模的方法来证实蛋白质表达定位于大肠杆菌周质间隙中。

材料（带√的项见附录1）

表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞

√PBS

20%蔗糖（m/V）/10mmol/L Tris·Cl（pH7.5；附录1），冰冷

√0.5mol/L EDTA（pH8.0）

冰冷水

注意：在整个过程中，细胞都应当置于冰浴中，以使样品的改变降至最低程度。

1、在1.5ml离心管中放入约2x109个表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞（OD600为1时相当于约109个细胞），4℃，最大转速离心2min，弃上清，将沉淀重悬于1ml PBS中，将管子充分涡旋混合。

2、重复离心，弃上清，将沉淀重悬于150μl冰冷的20%蔗糖/10mmol/L Tris·Cl （pH7.5）中，充分涡旋混合，加入5μl 0.5mol/L的EDTA（pH8.0）。

3、取出50μl代表总细胞组分的小份，-20℃保存，将剩余的样品置于冰上保持10min，以使EDTA能够将细胞壁结构变疏松。

4、将细胞碎片离心5min，弃上清，在100μl冰水中剧烈涡旋，重悬沉淀。

5、在冰上放置10min，然后离心5min。

6、小心地收集上清（周质组分）于1.5ml离心管中，-20℃保存。

7、用棉签除去沉淀中剩余的液体，在100μl冰水中重悬沉淀，保存此溶液，作为细胞质和膜组分。

8、制备三种组分（全细胞组分、周质组分和胞质/膜组分），进行SDS-PAGE 分析（见辅助方案2）

辅助方案5 细胞外培养基样品的制备

通过分析培养基中的样品能够检查指导目的蛋白细胞外分泌的表达系统。如果培养物中蛋白质浓度很低（如低于100mg/L），可以加入牛血清白蛋白（BSA）作为沉淀的载体和核。

材料

表达目的蛋白的转化大肠杆菌细胞

2g/L BSA（可选；用0.22μm的膜除菌，4℃保存≤1个月）

200g/L的三氯醋酸（TCA；用0.22μm的滤器除菌，4℃保存≤1个月）

70%（V/V）乙醇

适于水溶液的0.22μm膜

1、在1.5ml的微量离心管中放入1ml表达目的蛋白的大肠杆菌细胞培养物，4℃，最高转速离心2min，收集上清，将其过0.22μm的膜，收入1.5ml的微量离心管中，弃沉淀。

2、可选：加入100μl 2g/L的BSA。

3、加入1ml 200g/L的TCA，充分涡旋，将管置于冰上15-30min，以使蛋白质沉淀。

4、4℃，最高转速离心10min，弃上清，用2ml 70%乙醇洗涤沉淀物至少2次，以除去TCA。

5、制备沉淀物用于SDS-PAGE分析（见辅助方案2）。

三、GST融合蛋白的表达与纯化

可使用pGEX载体（图5）在大肠杆菌中高水平地表达与谷胱甘肽S转移酶（GST）融合的多肽，这种表达是可诱导型的，且是细胞内表达，用谷胱甘肽-Sepharose 4B结合物的亲和层析，在非变性条件下，很容易纯化这种GST融合蛋白。使用GST和重组多肽之间的特异性蛋白酶切割位点，可以从目的蛋白上切下氨基酸的GST部分，最后，将样品重新上谷胱甘肽-Sepharose柱，能够除去GST部分。

图5 pGEX载体是质粒表达载体，它将克隆基因与谷胱甘肽S转移酶（GST）融合表达。在用异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导之前，lac阻抑物基因与lac启动子（p tac）结合，阻抑GST融合蛋白的表达，使用如括号内所示的多接头位点能够将目的多肽正好插

在GST基因的后面，在GST载体蛋白和目的蛋白之间有蛋白酶切割位点，所以能够将GST 部分除去。在多接头序列的下面和在质粒上标明了限制性内切核酸酶位点，选择载体和适当的克隆位点的一个很重要的考虑是加到靶多肽N端的外来残基尽可能少。

基本方案一谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的表达

本方案内容：在振荡培养箱中制备1.8L转化的大肠杆菌（3个2L的培养瓶中各装600ml），使用更多或更大的培养瓶可以进行中等的规模放大，进一步的规模放大要使用发酵罐来完成。

通过550nm（OD550）的光密度读数或通过SDS-PAGE分析细菌培养物都可以检测培养物的生长，在诱导之后，不要让细胞生长过长的时间，因为会发生细胞裂解，释放出能够降解融合蛋白的蛋白酶，对于鉴定细胞破裂，用显微镜观察细胞是一种很有用的方法。

材料（带√的项见附录1）

√LB培养基，调pH至7.2

√5mg/ml氨苄青霉素

在pGEX载体中表达GST目的蛋白融合蛋白的转化大肠杆菌细胞的甘油培养物

√100mmol/L异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷（IPTG）

500ml和2L培养瓶

紫外/可见光分光光度计

大离心杯

低速制冷离心机（如Beckman J6-B和JS4.2转头或相当的），4℃

1、制备LB培养基，往3个2L的瓶中各加入600ml，往两个500ml的瓶中加入各100ml，在慢排气（液体）设定下高压灭菌20-30min，冷却至室温。

2、往一个含100ml LB培养基的瓶中加入1ml 5mg/ml的氨苄青霉素，使用接种环接种表达目的GST融合蛋白的转化大肠杆菌，用火焰烧所有瓶口，以降低污染的危险。37℃振荡（250-300rpm）培养过夜，用紫外/可见光分光光度计测量OD550，从第二个500ml的瓶（无氨苄青霉素）取培养基作为对照（过夜培养物的OD550应约为1.0）。

3、在无菌条件下，往每个含600ml LB培养基的2L的瓶中加入6ml 5mg/ml 的氨苄青霉素（终浓度为0.1mmol/L）往每个2L的瓶中加入30ml过夜培养物，37℃振荡培养，直到OD550达到0.5-0.7（约2h），从每个瓶中取出1ml的样品，留作凝胶分析。

应当靠经验确定每种重组蛋白的最佳生长条件，如果细胞在较低的温度下生长能够将表达的蛋白质由包含体转变为可溶性的组分，必须延长培养时间。

4、诱导细胞表达：往每个瓶中加入6ml 100mmol/L IPTG（终浓度为1.0mmol/L），37℃培养2.5-3h。从摇瓶中取培养物，测定最终的OD550，从每个瓶中取出1ml，用作凝胶分析。

5、将各培养物各倒入一个离心杯中，4℃，4000g离心20min，小心倒出上清，在每个离心杯中留下15-50ml上清，在这些上清中重悬沉淀的细胞。

6、将悬液移至一个50ml的离心管中，4℃，4000g离心20min，倒掉上清，将其放入-80℃冰箱中冷冻沉淀。

7、用SDS-PAGE（见第10.1单元）分析诱导前和诱导后的样品，证实诱导蛋

白质的表达。

基本方案二可溶性GST融合蛋白的亲和层析纯化

材料（带√的项见附录1）

谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂（Amersham Pharmacia Biotech公司）

√PBS

√谷胱甘肽缓冲液

√PBS/EDTA/PMSF缓冲液

表达融合蛋白的大肠杆菌培养物沉淀（见基本方案1第6步）

√裂解缓冲液，冰冷的

√洗涤缓冲液，冰冷的

√PBS/EDTA

2.5cm×8cm谷胱甘肽-Sepharose 4B柱（如Bio-Rad Econo公司）

蠕动泵

超声破碎仪，装有细尖探头（如Branson公司）

60ml离心杯（能够承受48000g的离心力）

高速冷冻离心机（如Beckman JZ-21M离心机和JA-18转头，或相当的）4℃Dounce匀浆器

注意：除SDS-PAGE（室温）外，所有步骤都应当在4℃冷室中进行，除非另有说明。

1、将20ml谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂倒入2.5cm×8cm的柱中（装柱的细节参见第8.3单元），用蠕动泵，用5-10倍体积的PBS洗涤谷胱甘肽柱，流速为1.5ml/min，以除去乙醇贮存溶液。

树脂的量应当足够纯化1.8L培养物中的融合蛋白，这1.8L培养物中含有60-120mg的融合蛋白。

2、用3-5倍体积的谷胱甘肽缓冲液洗涤柱，流速为1.5ml/min，然后用10倍体积的PBS/EDTA/PMSF洗涤柱，流速为1.5ml/min。

以前用过的柱在贮存过程中可能会被部分氧化，在使用前24h以内应当重新平衡（第2步）。

3、将每600ml培养物的沉淀重悬于15ml冰冷的裂解缓冲液（25-50μl缓冲液/ml的培养物）中，用装有细尖探头的超声破碎仪超声裂解细胞，超声10次，每次工作10s、间歇1min，在超声过程中，要将细胞置于冰上，并防止产生泡沫，否则会使融合蛋白变性，保留裂解物样品（约100μl）用于凝胶分析，将其余的裂解物移至一个60ml的离心杯中。

4、将裂解物于4℃，48000g离心20min，将上清（含可溶性的融合蛋白）倒入一个干净的50ml离心管中。

5、将沉淀重悬于冰冷的洗涤缓冲液，体积与第3步所用的裂解缓冲液体积相同，用Dounce匀浆器重悬沉淀。

6、用SDS-PAGE（见第10.1单元）分析裂解物、上清和重悬的沉淀物，证实融合蛋白在上清中。

7、将上清上到一根预平衡过的谷胱甘肽柱（第2步）中，流速≤0.1ml/min （如过夜），收集各组分，用SDS-PAGE（见第10.1单元）分析未结合峰的多个组分，以证实融合蛋白已经结合，而且未超过柱的容量。

在早期的未结合组分中没有融合蛋白，但在晚期未结合组分中出现融合蛋白，这表明已经超过了柱的容量。

8、用5-10倍体积的PBS/EDTA/PMSF洗涤柱，流速为1.5ml/min，之后用10倍体积的PBS/EDTA洗涤柱，流速为1.5ml/min，以除去PMSF。

如果要用凝血酶或Xa因子切割样品（见基本方案3），必须首先从样品中除去任何的丝氨酸蛋白酶抑制剂（如PMSF）。

9、用5倍床体积的谷胱甘肽缓冲液从柱上洗脱融合蛋白，流速为0.3ml/min，用在线式紫外检测仪或通过各个组分的吸收读数，在280nm处监测融合蛋白的洗脱，用SDS-PAGE分析各组分，合并含GST融合蛋白（纯度通常>90%），0-4℃保存。

备择方案用亲和层析从包含体中纯化GST融合蛋白

在用尿素或另一种变性剂将包含体溶解之后，再用透析（见第6.3单元）的方法复性，通常能够从包含体中纯化谷胱甘肽S转移酶（GST）融合蛋白。作为从包含体中纯化蛋白质的一种备选方案，当使用pGEX载体时，让细胞在较低的温度下生长通常能够将融合蛋白转变到上清中，而每升的培养物中仍然能够产生≥10mg的融合蛋白。

附加材料（也见基本方案2；带√的项见附录1）

√U缓冲液

Triton-100

√PBS/甘油缓冲液

低速制冷离心机（如Beckman J6-B和JS-4.2转头，或相当的），4℃

注意：所有步骤都应当在4℃冷室中进行，除非另有说明。

1、预平衡谷胱甘肽柱、裂解细胞、分离裂解物的沉淀（含有包含体）和上清（见基本方案2第1-5步）。

2、将洗涤过的沉淀于4℃，48000g离心20min，倒掉上清，将每600ml原始培养物的沉淀溶于12ml新配制的U缓冲液中，在冰上温育2h。

3、4℃，48000g离心20min，将上清（含有提取的融合蛋白）小心地移至一支干净的50ml离心管中，加入Triton-100，使终浓度为1%（V/V）。

4、加入20倍体积的PBS/甘油缓冲液透析2-3h，然后加入大于100倍体积的PBS/EDTA/PMSF缓冲液透析过夜。

5、从透析袋中取出样品，于4℃，4000g离心20min，过柱纯化融合蛋白（见基本方案2第7-9步）。

基本方案三蛋白酶切割融合蛋白溶液以除去GST亲和标签

对于每种重组融合蛋白必须凭经验确定最佳的切割条件（如温度、酶-底物比率、温育时间的长度和缓冲液条件）。

材料（带√的项见附录1）

亲和纯化的融合蛋白溶液

凝血酶（Sigma公司），溶于水中，浓度为0.5U/μl；或1μg/μl的Xa因子（Boehringer Mannheim公司）

0.15mol/L PMSF，溶于异丙醇中

√PBS/EDTA/PMSF缓冲液

Beckman J6-B离心机和JS-4.2转头（或相当的），4℃

1、往亲和纯化的融合蛋白溶液中加入适量的凝血酶（pGEX-T载体）或Xa 因子（pGEX-X载体），在37℃（凝血酶）或25℃（Xa因子）振荡水浴消化2-8h。

对于每种重组融合蛋白必须先凭经验确定适当的酶量，即在试验性的蛋白酶解分析实验中试验大量消化的条件。

2、中止制备性消化：加入1：500稀释的0.15mol/L PMSF贮液，37℃温育15min（凝血酶）或25℃温育30min（Xa因子）。

3、于4℃加入2L PBS/EDTA/PMSF透析2次，每次换液至少间隔4h。

如果要将样品重新上谷胱甘肽-Sepharose层析，以除去GST部分和未被切割的融合蛋白，则将谷胱甘肽完全除去是很重要的。

当使用MWCO＜12000的透析袋时，由于在透析过程中谷胱甘肽平衡很慢，所以透析条件应当增加到至少换3次液，每次使用2L透析缓冲液。

4、将透析后的样品于4℃，4000g离心20min，以除去任何的沉淀物，在0-4℃将上清移至一个干净的管中，用SDS-PAGE（见第10.1单元）分析。

在谷胱甘肽柱上重新层析可以将切下的目的蛋白与GST和未切开的融合蛋白分开。

四、装柱

基本方案一脱盐（分组分离）

材料（带√的条目见附录1）

对目的蛋白具有适当排阻极限的GF介质或GF预装柱

√GF脱盐缓冲液

带色的标准参照物：0.2mg/ml蓝色葡聚糖2000或0.2mg/ml维生素B12 √空白标准参照物（void marker）

√总液体体积标准参照物

带脱盐的蛋白质样品

90℃水浴（可选）

布氏漏斗或烧结的玻璃漏斗

GF层析柱，带有外延柱（column extension；可选）、可调式街头和缓冲液容器（图6）

水平仪

蠕动泵（图6）

0.22μm滤器：缓冲液过滤可用任意的0.22μm滤器；样品过滤必须使用蛋白质相容性的滤器

检测仪（可选，图6）

记录仪（可选，图6）

上样器：上样环（如Superloop、Amersham Pharmacia Biotech公司）或注射器

组分收集器（可选，图6）

如果GF介质是干粉

1a、根据生产商提供的溶胀系数（swelling factor）和要充填的大概柱床体积，计算所需要的GF干介质的量，将计算好量的干胶加入GF脱盐缓冲液中，所用

缓冲液的量为所计算的最终凝胶体积的2倍（即大约柱床体积的2倍）。

2a、用玻璃棒小心地搅拌凝胶悬液，让凝胶于室温溶胀过夜或在90℃水浴中溶胀3h，根据需要进行搅拌，保持凝胶处于悬浮状态。不要使用磁力搅拌器，它会将脆弱的凝胶颗粒打碎。

图6 凝胶过滤设备。A、简单的脱盐装置，用巴斯德吸管制成的开放床柱子。B、柱子和附件。C、全自动系统。图片由Amersham Pharmacia Biotech公司提供。

3a、让凝胶床沉降，然后轻轻地倒出浑浊的溶液，除去凝胶细粒和破碎的胶珠，重复这个步骤（如果必要可进行4或5次），直到沉降下来的凝胶与上清形成一条界限分明的带，然后用GF缓冲液稀释凝胶成50%的凝胶浆。接着进行第4步。

如果GF介质是预先溶胀过的

1b、在布氏漏斗或烧结的玻璃漏斗中，用过量的GF缓冲液洗涤凝胶，以除去贮存缓冲液。

2b、如果凝胶中含有凝胶细粒，按第3a步的操作将其除去。

3b、用GF缓冲液稀释凝胶成50%的凝胶浆，接着进行第4步。

4、检查柱子，要确保洁净，而且保护网（support net）未损坏，如果必要，更换新的保护网。

5、将层析柱安装在一个稳固的试验架上，用水平仪调整，确保柱子的垂直。如果50%以上的层析柱需要装填料，则在层析柱上加装外延柱，外延柱和柱子合在一起足够装下所有的凝胶浆（即沉降后凝胶体积的2倍）。

6、排出出口管和底部接头内的空气，方法是将GF缓冲液注入出口管内（使用注射器或蠕动泵），直到保护网上方的缓冲液达到0.5cm高，关闭柱子的出口。

7、将GF缓冲液注入可调式接头的入口管内，直到保护网湿润，同时保持出口向上，以确保空气易于从保护网内排出，将可调式接头置于一装有GF缓冲液的烧杯中，直到使用时取出。

8、将第3a步或第3b步准备好的凝胶浆轻轻回旋，将一根玻璃棒倾斜放在柱子或外延柱的内壁上，沿玻璃棒将全部凝胶浆倒入柱内，用GF缓冲液填满剩余的空间，同样小心地沿玻璃棒倒入缓冲液，尽量不要破坏凝胶层。将外延柱用盖子盖好（或在层析柱上安装上部接头）。

9、在缓冲液容器中装满GF缓冲液，放在高于泵的位置。用大内径的管子连接泵和缓冲液容器。

10、用GF缓冲液清洗泵，将泵的出口连接到层析柱或外延柱的入口上。打开层析柱的出口，开启泵，流速为生产商推荐的适合于所用凝胶、层析柱组合的流速。一起泵入缓冲液，直到凝胶床的高度恒定位置（一般需要1-4h）。

11、关闭泵和层析柱出口，取下外延柱，调整柱床高度（只有要出去过多的凝胶时才需要），用刮勺小心地搅动凝胶面的上部，吸去过多的凝胶浆。调整入口接头，使其与柱床表面平齐，避免在保护网下形成气泡。

12、重新连接泵和层析柱，打开层析柱的出口，重新进行第10步的液流条件，维持1h，以使柱床高度稳定。重新调整接头，使其与新柱床表面平齐。

13、用肉眼对光，检查填充的柱床是否有裂纹、气泡和颗粒聚集物，按照第20-23步，用带色的标准参照物（2mg/ml的蓝色葡聚糖2000或0.2mg/ml的维生素B12）进行层析，确定所得到的区带平行、锐利。

14、计算层析所需的GF缓冲液的用量，多加50%，用0.22μm的滤器过滤。如果必要，可调整pH，将过滤后的缓冲液加到缓冲液容器内。

15、按照生产商的说明书，安装GF系统，将检测仪和记录仪（如果使用）连接好，但先不连接层析柱。将泵和缓冲液容器连接好，在安装柱子前，用GF 缓冲液洗泵。

16、通过上样阀门将泵的出口和层析柱连接起来，用GF缓冲液运行系统，流速为要用于蛋白质分离的流速，用组分收集器收集组分，并记录泵的实际流速（如通过称量或用量筒测量所收集的组分来计算实际流速）。

17、按照第20-23步的方法，用空白标准参照物进行层析，根据得到的洗脱体积来确定系统的外水体积（V o，图7）

图7 由外水体积（V o）和总液体体积（V t）所决定的凝胶过滤的分离体积V i层析示意图。总柱床体积（V c）等于总液体体积加介质体积。柱效的计算公式为N=5.54（V r/W h）。在此式

中，N是以理论塔板数表示的柱效，V r是峰的洗脱体积，W h是半高峰宽。在10%峰高处，峰的对称性的计算公式为b/a，b是峰尾部的宽度，a是峰头部的宽度。

为柱床体积的30%-33%，刚性凝胶一般来说，非刚性凝胶（如琼脂糖）的V

o

（如硅胶）的V

为柱床体积的36%-40%。

o

18、按照第20-23步的操作，用总液体体积参照物进行层析，根据所得到的洗脱体积确定系统的总液体体积（V t）。

一般来说，对于非刚性凝胶，V

为几何柱床体积（πr2L，r为层析柱的内径）

t

为几何柱床体积的70%-80%。

的85%-95%，对于刚性凝胶，V

t

19、计算层析柱的分离体积（V i），等于V t-V o。

20、将待脱盐的样品溶于GF缓冲液中，用0.22μm的滤器过滤。

21、打开层析柱的出口，启动泵，让2倍体积的GF缓冲液流过系统。打开检测仪和记录仪，让基线稳定。

22、将适量要脱盐的样品加到上样器上，不要超过第19步所确定的分离体积。将上样阀门打开到上样位置，在记录纸上坐好起始标记（如果没使用记录仪，则启动秒表）。

23a、确定洗脱体积：让GF缓冲液以适当的流速通过层析系统，在收集组分的同时，用记录仪记录检测仪的反应，得到一幅层析图，计算洗脱体积，洗脱体积等于蛋白质（或其他溶质）从起始点到达峰尖的时间乘以泵的流速（如第16步所确定的）。

23b、让GF缓冲液通过层析柱，用量等于外水体积减去上样体积的一半，收集废液。在层析柱下放一个可容纳1.5倍加样体积的容器，然后向层析柱中加入与上样体积等量的GF缓冲液，收集脱盐的蛋白质（样品层析图见图8）。

图8 用凝胶过滤进行蛋白质脱盐的层析示意图。使用装填Sephadex G-25的4cm×85cm层析柱。样品室400ml血红蛋白（蛋白峰；实线）和NaCl（盐峰；虚线）。注意，样品体积接近于填充介质的空隙体积（即490ml），样品体积未作任何修正，从图上计算得到V o=560-200=360ml，为几何柱体积（V c）的31%。改图经层析杂志允许后复制。

24、用超过1倍柱体积的含抗菌剂的GF缓冲液洗涤层析柱，关闭层析柱的出口，保存层析柱。

基本方案二蛋白质分级分离

材料（带√的条目见附录1）

对目的蛋白具有适当选择性的GF介质或GF预装柱（见策略设计）

√GF分级分离缓冲液

带色的标准参照物：0.2mg/ml的蓝色葡聚糖2000或者0.2mg/ml的维生素B12

低分子质量标准参照物（如5mg/ml丙酮或者2mmol/L NaCl）

待分离的蛋白质样品

GF层析柱（典型长度为30-100cm）

1、如脱盐方法（见基本方案1，第1a-3a步或第1b-3b步）所述，准备GF 介质，但在表明GF缓冲液的地方均使用GF分离缓冲液。

2、装柱（见基本方案1第4-12步），肉眼检查装柱的质量（见基本方案1第13步），安装和测试系统（第14-16步）。

3、用带色的标准参照物（2mg/ml的蓝色葡聚糖2000或0.2mg/ml的维生素B12）进行层析，确定所得到的区带平行、锐利。

4、用低分子质量标准参照物（如5mg/ml丙酮或2mol/L NaCl；见基本方案1第20-23步）进行层析，得到一幅层析图，确定柱效。

在该步中，上样体积对峰宽的影响很大，并会造成柱效低的假象。对于使用平均颗粒直径为100μm、30μm和10μm的GF介质所装填的层析柱，样品体积分别不应超过柱床体积的0.9%、0.5%和0.4%。

5、根据公式N=5.54（V r/W h）2计算每根层析柱的理论塔板数，N为柱子的理论塔板数，V r为峰的洗脱（保留）体积，W h为半高峰宽。有关这些变量的图形描述见图7，有关柱效的讨论见第8.1单元。

6、根据公式As=b/a计算峰的不对称因子（asymmetry factor），a为在10%峰高处峰前半部分的宽度，b为在10%峰高处后半部分的宽度。

7、将实验获得的柱子塔板数和不对称因子与生产商提供的这些参数的可接受限（acceptance limit）进行比较。

8、将要分级分离的蛋白质样品溶解、上样、层析分离（见基本方案1第20-23步），用HPLC（见第8.5单元）或电泳（见第10.1-10.3单元）检测所收集组分的纯度。

五、蛋白质电泳

基本方案变性（SDS）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：Laemmli法

在变性条件下（即在0.1%SDS存在的条件下）进行单向凝胶电泳，当蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳基质向阳极泳动时，基于分子的大小来分离蛋白。灌制凝胶时，先灌注分离胶（有时又称电泳胶），再在其上部灌制积层胶（浓缩胶），然后固定在电泳槽上。将蛋白质样品在SDS中煮沸，使其溶解，在溶解过程中，加入2-巯基乙醇（2-ME）或二硫苏糖醇（DTT），以还原二硫键。本方案适用于最大尺寸为0.75mm×14cm×14cm的垂直板凝胶，对于较厚的凝胶，必须调整积层胶和分离胶的体积以及工作电流。

注意：现在可购得预制凝胶，规格有大型胶和微型胶，使用不同的缓冲系统，有均一胶也有梯度胶。供应商有Amersham Biosciences公司、Bio-Rad公司、

Genomic Solutions公司、Invitrogen公司、ISC BioExpress公司、Jule Bio Technologies 公司和Sigma公司，另外还有其他公司。

材料（带√的条目见附录1）

分离胶和积层胶溶液（表1）

水饱和的异丁醇

√1×Tris·Cl/SDS，pH8.8（用4×Tris·Cl/SDS，pH8.8稀释）

要分析的蛋白质样品

√2×SDS样品缓冲液

√6×SDS样品缓冲液

分子质量标准品混合物（如Bio-Rad公司、New England Biolabs公司、Pierce 公司、Sigma公司和其他公司）

√1×SDS电泳缓冲液

电泳装置，带夹子、玻璃板、灌胶支架和缓冲液槽（如Bio-Rad公司、Amersham Pharmacia Biotech公司）

0.75mm隔条

25ml带侧支的三角瓶（凝胶溶液脱气用）

有冷阱的真空泵（凝胶溶液脱气用）

带有1、3、5、10、15或20个梳齿的0.75mm塑料梳子

25μl或100μl注射器，带钝头针头

恒流电源

1、按厂商的说明书，用两块干净的玻璃板和2个0.75mm的隔条，组装电泳装置的玻璃平板夹层，并将其固定在灌胶支架上。

2、配制分离胶溶液（表1），对于分子质量为60-200kD的SDS变性蛋白质，使用5%的分离胶、16-70kD的SDS变性蛋白质用10%的分离胶、12-45kD的SDS 变性蛋白质用15%的分离胶。用一根巴斯德吸管，将分离胶溶液沿着一个隔条的边缘加到玻璃板夹层中，直到玻璃板之间溶液的高度约为11cm。样品体积少于10μl时（不需灌制积层胶），管分离胶一直到梳子处，以形成加样孔（第6步和第7步）。

3、用另一根巴斯德吸管，先从一侧的隔条边缘，再从另一侧隔条边缘缓缓地往凝胶的顶部加入一层水饱和的异丁醇（厚约1cm），让凝胶在室温聚合30-60min。

聚合后，在顶层异丁醇与凝胶界面间可见一清晰的折光线。胶的聚合失败往往是过硫酸铵和（或）TEMED有问题。加入水时过硫酸铵应该有“劈啪”的声响，如果没有，应该购买新鲜的过硫酸铵。购买小瓶的TEMED，以便在需要的时候可试用新开封的TEMED。

4、倾去异丁醇，用1×Tris·Cl/SDS（pH8.8）彻底冲洗。

5、配制积层胶溶液（表1）。用巴斯德吸管，将积层胶溶液缓缓地沿着一侧隔条边缘加入到玻璃平板夹层中，直到夹层中的溶液高度离玻璃板顶部约1cm 高为止。小心不要产生气泡。

6、插入0.75mm厚的塑料梳子，再补加积层胶溶液填满梳子间的空隙，仍然注意避免产生气泡。让积层胶在室温聚合30-45min。

7、在密封的螺盖微量离心管中，用2×SDS样品缓冲液按1:1（V/V）的比例稀释蛋白质样品，于100℃煮沸3-5min。如果样品使蛋白质沉淀物，加入50-100μl

1×SDS样品缓冲液溶液；如果样品是蛋白质稀溶液，可考虑用6×SDS样品缓冲液（终浓度为1×），以增加蛋白质的上样量。根据供应商的说明书，用1×SDS 样品缓冲液溶解蛋白质分子质量标准品混合物。

用考马斯亮蓝染色时，对分成分复杂的蛋白质混合物，0.8cm宽的加样孔的加样体积不超过20μl（25-50μg总蛋白质）为宜，对于只有一种或几种蛋白质的样品，只需1-10μg的总蛋白质。采用银染时，样品用量可减少10-100倍。为了得到均一的条带，配制蛋白质样品时，浓度和等体积要相同。

在加入SDS样品缓冲液前后，要将样品一直置于冰上。含SDS样品缓冲液的样品，如未经100℃加热灭活蛋白酶之前，切勿将其放于室温。

8、小心拔出塑料梳子，避免撕裂凝胶加样孔，用巴斯德吸管以1×SDS电泳缓冲液冲洗加样孔，并充满加样孔。

9、根据厂商说明书，将灌好的凝胶夹层固定至上层缓冲液槽上，在下层缓冲液槽中加入1×SDS电泳缓冲液，然后将凝胶板夹层放入下层缓冲液槽中，往上层缓冲液槽中加入部分1×SDS电泳缓冲液至覆盖凝胶加样孔为止。

表1 聚丙烯酰胺分离胶和积层胶配方a

分离胶：在一个25ml带侧支的三角瓶中，混匀30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液（见附录1）、4×Tris·Cl/SDS（pH8.8）（见附录1）和水，真空脱气约5min，加入10%过硫酸铵

积层胶（3.9%丙烯酰胺）：在一个25ml带侧支的三角瓶中，混匀0.65ml30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺、1.25ml4×Tris·Cl/SDS（pH8.8）（见附录1）和3.05ml水，真空脱气5-10min，加入25μl10%过硫酸铵和5μl TEMED，轻轻旋转混匀，立即使用。

a：本方法配制15ml的分离胶和5ml的积层胶，足够灌制一块0.75mm×14cm×14cm大小的凝胶。本配方基于Leammli（1970）的SDS（变性）不连续缓冲体系。

b：实验方案中的所有试剂盒溶液都必须用Milli-Q纯水或同等质量的水配制。

c：体积单位是ml。分离胶中丙烯酰胺的百分浓度取决于待分离蛋白质的分子大小。

d：最好现配现用。

10、用一个25μl或100μl带钝头针头的注射器，小心地加样，使样品在孔的底部成一薄层，在对照孔中加入分子质量标准品。如有空置的加样孔，加入等体积的1×SDS样品缓冲液。

11、再往上层槽中加入1×SDS电泳缓冲液，完全覆盖上层槽的铂电极。此操作必须缓慢小心，以免冲起样品孔中的样品。

12、连接电源，对于一块0.75mm厚的凝胶，先在10mA恒流下电泳，直到溴酚蓝指示剂进入分离胶，将电流增至15mA，继续电泳，直到溴酚蓝到达分离胶底部为止。

对于一块标准的16cm凝胶板，每0.75mm厚的凝胶在4mA恒流下电泳约需15h（即过夜）；每0.75mm厚的凝胶在15mA下电泳只需4-5h。两块凝胶或一块

1.5mm厚的凝胶电泳，将电流加倍。对于一块1.5mm厚的凝胶，在30mA恒流下电泳，必须用循环水浴将温度控制在10-20℃，以防止出现“微笑效应”（迁移条带弯曲）。

13、关闭电源，弃去电泳缓冲液，取出固定凝胶夹层的上层缓冲液槽。

14、确定凝胶方向，以便识别样品孔的顺序，从上层槽中取出凝胶板，放置在一张吸水纸或纸巾上。

15、沿着隔条的整个长度的方向，小心地从凝胶夹层的边缘将其中一个隔条抽出一半，并以露出的隔条为杠杆撬开玻璃板，露出凝胶。小心地从下面的玻璃板下取出凝胶，在凝胶的一角上切去一小三角，以便在染色和凝胶干燥后仍能认出加样顺序。

凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染色（见第10.4单元），或将蛋白质电洗脱，也可电转移至膜上（见第10.5单元）后再染色（见第10.6单元）或进行序列分析、或转移到膜上进行免疫印迹（见第10.7单元）。如果蛋白质已用同位素标记，则可用放射自显影检测。

基本方案非变性连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

在非变性凝胶中，蛋白质的迁移率取决于其大小、形状和固有电荷。非变性凝胶电泳分离蛋白质的装置与变性凝胶所用装置相同（见第10.1单元），而且适合于多种尺寸范围（如从7.3cm×8.3cm的微型胶到14cm×16cm全长的凝胶）和基质类型（如均一胶和梯度胶）。

连续电泳系统（配制丙烯酰胺溶液所用的缓冲液与电泳缓冲液相同）分离蛋白质由缓冲液的pH所控制。本方案阐述了4种类型的缓冲液，可在pH3.7到pH10.6的范围内使用。pH主要取决于目的蛋白和任何杂蛋白的等电点、蛋白质的迁移率和溶解度，确定应用何种pH主要靠经验。预先知道蛋白质的等电点（见第10.3单元）可确定在分离条件下蛋白质所带的净电荷（如果凝胶的pH小于蛋白质的等电点，蛋白质带正净电荷；如果凝胶的pH大于蛋白质的等电点。蛋白质带负电荷）。

电泳时，应当包含天然蛋白质标准品，这一点很重要。一些厂商提供等电聚焦用的蛋白质标准品，也适用于非变性电泳。也可选择Sigma公司的蛋白质标准品试剂盒，在中性pH、非变性条件下计算分子质量时很有用。

材料（带√的条目见附录1）

√4×乙酸凝胶缓冲液，pH3.7-5.6

√4×磷酸盐凝胶缓冲液，pH5.8-8.0

√4×Tris凝胶缓冲液，pH7.1-8.9

√4×甘氨酸凝胶缓冲液，pH8.6-10.6

待分析的蛋白质样品

蔗糖

迁移指示剂：细胞色素c（pI9-10）或溴酚蓝

天然蛋白质标准品

电泳缓冲液：适当的4×凝胶缓冲液，用水稀释为1×

1、安装凝胶电泳装置的玻璃板夹层，固定在制胶架上（有关凝胶电泳更详细的内容见第10.1单元）

2、配制丙烯酰胺溶液（表2-表5），使用前加入过硫酸铵和TEMED。脱气可

加速凝胶聚合，但一般不需要脱气。

3、灌注凝胶到距离凝胶夹层顶部2cm处，插入梳子，避免产生气泡，让凝胶聚合1-2h。

4、用含有迁移指示剂（阳离子系统，每条泳道5-10μg细胞色素c；阴离子系统，10μg/ml溴酚蓝）的5%（m/V）蔗糖[溶于水或稀凝胶缓冲液（1-5mmol/L）中]溶解蛋白质样品。同法配制天然蛋白质标准品。

对高度富集的样品（如蛋白质标准品）进行考马斯亮蓝染色时，所用浓度为1-2mg/ml；对于较复杂的混合物，使用5-10mg/ml。银染时，样品的浓度要减少10-100倍。以最小体积上样（0.75mm和1.5mm厚凝胶的上样量分别为10μl和20μl）。

5、小心地取出梳子，用电泳缓冲液冲洗加样孔，然后用电泳缓冲液充满加样孔。

6、可选：将凝胶预电泳，以去除所有带电荷的材料（如过硫酸铵）。在300V 电压下电泳，直到电流不再下降（约30min）。拆开凝胶装置，弃去缓冲液。

7、仔细地上样使样品在孔底部形成一薄层，样品或蛋白质标准的上样量为每泳道10μl（0.75mm凝胶）或20μl（1.5mm凝胶）。在剩余的所有空孔中均加入等量的电泳缓冲液，防止泳道中样品的扩散。

8、安装凝胶电泳装置，在上、下缓冲液槽中加入电泳缓冲液，连通凝胶装置与电源。如果在分离条件下蛋白质带负电，应该使用标准的SDS-PAGE电极极性（蛋白质向阳极或正极迁移）。如果蛋白质带正电荷，则将电源上的电极对调，以便蛋白质向阴极迁移。

9、1.5mm厚的凝胶，电流设定为30mA；0.75mm厚的凝胶，则为15mA，进行电泳，直到迁移指示剂到达凝胶的底部（标准胶需要4-6h，微型胶需要1-2h）时，关闭电源，拆开凝胶装置，从玻璃夹层中取出凝胶，根据第10.4单元的方法对凝胶染色。

表2 乙酸非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的配方a：pH3.7-5.6b

凝胶制备：在一个75ml带侧支的三角瓶中，混匀30%丙烯酰胺/0.8%甲叉双丙烯酰胺（见附录1）、300mmol/L亚硫酸钠、4×乙酸凝胶缓冲液（见附录1）和H2O。若要加速凝胶聚合，真空脱气约5min。加入10%过硫酸铵和TEMED。轻轻旋转混匀，立即使用。

a、本配方配制40ml凝胶溶液，足够制备一块1.5mm×14cm×16cm大小的凝胶，或两块

0.75mm×14cm×16cm的凝胶。

b、使用未稀释的乙酸代替4×乙酸凝胶缓冲液，可使pH范围延伸至约2.0（乙酸的pH），尽管在pH2.0时几乎没有缓冲能力。

c、本方案中的所有试剂和溶液均需要Milli-Q纯水或同等质量的水配制。

d、体积单位是ml。凝胶溶液中丙烯酰胺的百分比浓度取决于待分离蛋白质的分子大小。

e、必须现配现用。在酸性pH条件下所有凝胶的有效聚合，需要使用亚硫酸钠。

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/bcwl.html