酶工程复习整理

酶工程复习整理

酶工程的概念：酶工程又称酶技术，是酶的生产与应用的技术过程，其主要任务是通过

人工操作，获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能。

酶工程的发展阶段：1.从动物、植物或微生物细胞和组织中提取酶，加以利用的阶段

2,发酵法生产，揭开近代酶工业的序幕。

酶催化作用的机制：

邻近效应；底物与底物之间、酶的催化基团与底物之间结合于同一分子，从而使反应速率大大增加。

定向效应：酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取向产生的效应。

底物的形变(distortion)和诱导契合(induced fit)：酶中某些基团或离子可以使底物分子产生“电子张力”，底物分子发生形变，接近过渡态，降低了反应活化能。 酸碱催化(acid-base catalysis)：通过瞬时向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。

共价催化(covalent catalysis)：又称亲核催化(nucleophilic catalysis)或亲电 子催化(electrophonic catalysis)。亲核催化剂(亲电子催化剂)能放出电子(汲取电子)并作用于底物的缺电子中心(负电中心)，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能。 金属离子催化：（1）通过结合底物为反应定向；（2）通过可逆改变金属离子的氧化态调节氧化还原应；（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷。 活性部位微环境的影响

酶催化反应的特点

a.催化剂的特性：

? 用量少而催化效率高； ? 不改变化学反应的平衡点；

? 参与反应，但在反应前后本身无变化 b.酶催化的特性：

1.高效性（原因）

a.酶可极大程度上降低反应所需的活化能

b.酶催化是多种催化因素的协同作用（邻近效应、定向效应，扭曲变形和构象变化的催化效应，广义的酸碱催化、共价催化及酶活性中心微环境）

2.专一性

3.反应条件温和

4.酶的活性是受调节控制的

专一性的分类：

绝对专一性

结构专一性 族的专一性 酶的专一性 键的专一性

光学异构专一性 立体化学专一性

几何异构专一性

光学异构专一性：当底物具有旋光异构体时，酶只能催化L型和D型两个对映体中的一个。

几何异构专一性：酶能识别顺反异构体。

键专一性：酶只要求作用于一定的键，对键两端的基团无要求。

基团专一性(族专一性)：除了对键要求以外，还要求键一侧的基团为特定的基团。 绝对专一性：对唯一的底物催化唯一的反应。

酶活性中心的构成：

酶的活性中心(active center)：酶分子上与催化活性直接相关的少数氨基酸残基组成的催化区域。包括结合部位 Binding site：酶分子中与底物结合的部位或区域（结合部位决定酶的专一性）以及活性中心－催化部位 catalytic site：酶分子中促使底物发生化学变化的部位（催化部位决定酶所催化反应的性质。）

酶活性中心有7种氨基酸残基参加的频率最高，它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。

双底物酶催化反应的类型：

连续机制：反应过程中形成三元配合物，分为

a.序列有序机制：两种底物按一定的顺序与酶结合，只有当第一个酶与底物结合后，第二个底物才能结合上去。产物也是按照一定的顺序释放。依赖NAD＋或NADP＋的脱氢酶的反应就属于这种类型。

b.序列随机机制：两种底物不按一定的顺序结合，产物的释放也是随机的。某些激酶例如肌酸激酶等就服从随机反应机理。

乒乓机制：酶首先和一个底物结合，释放出一个产物以后，再与另一个底物结合，并释放出产物，不形成三元配合物。转氨酶、某些黄素酶在内的许多酶都具乒乓反应机制

酶抑制作用的类型：

A. 可逆抑制作用（reversible inhibition）：抑制剂与酶以非共价键结合，用透析、超滤或凝胶过滤等方法可以除去抑制剂，恢复酶活性。 B．不可逆抑制作用（irreversible inhibition）：抑制剂与酶以共价键结合，用上述物理方法不能除去抑制剂和恢复酶活性。

A．可逆抑制作用 reversible inhibition 类型①竞争性抑制作用②反竞争性抑制作用③非竞争性抑制作用④混合型抑制作用

底物浓度增大，反竞争抑制作用减小，竞争抑制作用增强，非竞争抑制作用不受影响 非专一性的不可逆抑制作用 B．不可逆抑制作用

1.非专一性的不可逆抑制作用：抑制剂能和酶上的一类或几类基团反应。

2.专一性不可逆抑制作用：抑制剂只能与酶分子上的酶活性部位有关的基团发生化学反应，并共价地连接在酶分子的必须基团上，阻碍了底物与酶分子的结合或者破坏了酶的催化基团的抑制作用。分为两种类型：

Ks 型专一性不可逆抑制剂（亲和标记）：与底物结构相似，能与酶的底物结合部位结合，同时还带有一个活性基团，可以和附近的相应基团反应，形成共价键。有结合专一性，但没有反应专一性。

Kcat 型不可逆抑制剂（自杀底物）：既能与活性中心结合，又能被活性中心催化反应，反应后在抑制剂分子上产生活性基团，再与活性中心的必需基团反应，产生共价修饰。专一性高

酶的生产过程中需要控制的条件以及控制方法

需要控制的条件 pH 原因 控制方法 与细胞的生长繁殖以及发酵产酶有密切关系。 ①影响微生物体内各种酶的活性，从而导致微生物的代谢途径发生改变； ②影响微生物形态和细胞膜的透性，从而影响微生物对培养基中的营养成分的吸收和代谢产物的分泌。 ③影响培养基中某些营养物质的分解或中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。 ①初级调节控制（起始培养基）调整C/N，调整生理酸性物质与生理碱性物质之比。 ②补料调节：流加酸/碱，补加碳、氮源 ③溶解氧调节：控制代谢中间产物的氧化程度。 ④维持一定的pH值，添加缓冲液 温度 最适产酶温度低于最适生长温度，在较低温夹套，盘管 度下，提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。 有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同温度条件。 微生物代谢产生生物热，除了部分能量以ATP形式贮存在微生物体内生成菌体和产物，其余以热的形式散发。 细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要大量的氧 ① 调节通气量。 ② 调节氧的分压：富氧 增加空气压力。 ③ 调节气液接触时间：增加液位高度，增设档板。 ④ 调节气液接触面积：提高搅拌速溶氧

率，空气分布管及其及直径 ⑤ 培养液的特性：粘度、表面张力、菌体浓度、离子浓度 泡沫 ①阻碍CO2的排除，影响氧的溶解； ② 溢罐，导致浪费原料，引起染菌； ③ 装液量减少，降低发酵罐的利用率。 ①减少泡沫形成（原料，罐压，搅拌） ②机械消泡与化学消泡。 消泡剂：天然油脂；高碳醇；脂肪酸和酯；聚醚；硅酮。 酶分离纯化的评价指标：

产率=(目的酶的总活力/粗抽提液中目的酶总活力)*100%——反映提纯过程酶活力的损失情况

提纯倍数=目的酶的比活力/粗抽提液中目的酶比活力——提纯方法的效率

常用的分离纯化方法：

1）根据溶解度：盐析，有机溶剂沉淀法，选择性沉淀法，共沉淀法，PEG沉淀法、等电点沉淀法

2）根据分子大小差异：凝胶过滤，超过滤，离心，超离心

3) 电学、解离特性差异：吸附，离子交换，电泳（区带、等电聚焦），聚焦层析，疏水层析，高压层析(HPLC)

4) 稳定性差异：选择性热变性，选择性酸碱变性，选择性表面变性 5）特殊基团差异: 亲和层析 沉淀分离原理 分离方法 试剂选择 影响因素 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下硫酸铵最常用 (1)pH 盐析溶解度不同的特性，通过在酶液中添加 ? 接近于待纯化酶的等沉淀一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液电点。 法 中析出沉淀，从而使酶与杂质分离 (2)温度 ? 从酶的稳定性和溶解度看，盐析温度一般以控制在30℃左右为宜。 (3)蛋白质浓度 ? 蛋白浓度应在1mg／ml以上 等电利用两性电解质在等电点时溶解度最 点沉低，以及不同的两性电解质有不同的等淀法 电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离

有机利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解丙酮的分离效(1)温度 溶剂度不同，通过添加一定量的某种有机溶果一般最好,操作过程通常应控制在0℃以沉淀剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与乙醇和甲醇等下。而且有机溶剂必须预先冷法 杂质分离 也常用。 却到-15—--20℃。 (2)pH 尽可能靠近待纯化酶的等电点pH条件下进行。 (3)离子强度 添加适当浓度的中性盐，如5—10％的硫酸铵，往往有助于提高分离效果。 层析方法 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 层析聚焦 分离依据 吸附剂对不同物质的吸附力不同 各组分在两相中的分配系数不同 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的结合力不同 利用流动相中各种组分的相对分子质量不同 利用生物分子与配基之间的专一而又可逆的亲和力不同 两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起 层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质的不同，使各组分在两相中的分布不同而达到分离。

电泳：根据各种蛋白质解离、电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度不同而进行纯化的一类方法。

固定化的方法有哪些

1．载体结合法：将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。

根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。 A． 物理吸附：作用力：氢键、范德华力 、疏水键等。吸附剂包括无机吸附

剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）和有机吸附剂（纤维素、胶原等）比较受重视。

B． 离子结合：通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化

方法。吸附剂：离子交换纤维素，离子交换葡聚糖，离子交换树脂等。 C． 共价结合：通过共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不

溶于水的载体上。包括重氮化法，烷化法。

2.共价交联法：双功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶. 常用的是戊二醛

3.包埋法：格子型固定化酶，微型胶囊法

固定化酶的哪些性质会发生变化：

1 对底物的特异性。对低分子底物作用变化不大，而对高分子底物的催化作用明显减弱。是由于载体的空间位阻引起的。

2 酶反应最适PH值的改变 与载体性质有关

3 动力学常数的改变。米氏常数和最大反应速度会改变 4 酶反应温度的改变

5 增加酶的稳定性。对热、PH值、有机溶媒、蛋白质变性剂、蛋白质分解酶的稳定性增加。连续化反应稳定性好。——固定化酶的最大好处

评价固定化酶的指标

? ? ? ?

相对活力＝固定化酶活力/相同蛋白量的游离酶活力＊100%

酶结合效率＝（加入的总酶活力－未结合的酶活力）/加入的总酶活力＊100% 酶活力回收率＝固定化酶总活力/加入的总酶活力＊100%

当固定化方法对酶活力没有明显影响时，酶结合效率与酶活力回收率近似。

酶修饰的基本方法

1．酶分子侧链基团的化学修饰

几种重要的修饰反应：酰化及其相关反应，烷基化反应，氧化和还原反应，芳香环取代反应 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰：巯基，氨基，羧基， 分子内交联修饰

2．有机大分子对酶的化学修饰：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性。糖及糖的衍生物，聚乙二醇、大分子多聚物，具有生物活性的大分子物质（如肝素），溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等

3．蛋白质类及其他

化学修饰的基本原理：

1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性

? 酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，从而增强酶的

热稳定性。

2．保护酶活性部位与抗抑制剂

? 大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电斥力能有效地阻挡抑制剂

对酶的进攻，同时“遮盖”保护酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑制剂能力增强。

3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶

? 大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上

敏感键免遭破坏。

? 酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭受蛋白水解酶攻击破坏的

可能性。

4. 消除酶的抗原性

? 有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了酶分子上抗原决定簇的结

构，使酶抗原性降低乃至消除。

? 能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。

什么是酶分子的定向进化：

酶分子的定向进化技术就是人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。

有机介质中酶催化反应的优点

⒈ 有利于疏水性底物的反应。（主要提高脂溶性底物的溶解度，有利于高浓度底物连续生物转化。）

⒉ 可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应。

⒊ 能催化在水中不能进行的反应（有许多难溶于水的非极性底物能够溶于有机溶剂中）

有机介质中酶催化反应的条件

保证必需水含量:

? 水是保证酶催化反应的必需条件，活性构象是水分子直接或间接由氢键等非共价键

相互作用来维持。

? 必需水：是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需的那部分最少量的水分子，有时也

叫结合水，或者束缚水。只要那部分必需水不丢失, 其他的大部分水可以由有机溶剂代替。

选择合适的酶及酶形式:酶种类的选择：应具有对抗有机介质变性的潜在能力，在有机介质中能保持其催化活性构象。 酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关外，还取决于酶-底物、产物-溶剂间的关系问题。这完全需要用实验来决定。

酶形式的选择⑴ 酶粉：将酶做成冻干粉，然后在有机介质中充分搅拌，超声波处理，使得颗粒变小，悬浮于介质中。

⑵ 化学修饰酶：化学修饰可以改变酶的一些理化性质，有利于酶在有机溶剂中的稳定性，原先不稳定的酶经过修饰变得稳定，主要是因为改变了酶的一些理化性质。 选择合适的溶剂及反应体系:

? 水溶性有机溶剂：甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘油、丙酮、乙腈等。

? 水不溶性的有：石油醚、己烷、庚烷、苯、甲苯、四氯化碳、氯仿、乙醚、戊醚等。

核酶:

核酶的分类 1、剪接型核酶

? 剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron). ? 剪接型核酶分类 I类内含子 II类内含子 2、剪切型核酶

1)、自身催化剪切型RNA

? 剪切机制

这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。 特点：在 Mg 2+ 或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5‘-OH 和2’，

3‘-环磷酸二酯末端。

2)、异体催化剪切型RNA

? 核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA

前体的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’-磷酸末端。 ? RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。

? 体外： M1RNA具催化作用, 蛋白质作为辅助因子 ? 体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的 脱氧核酶

脱氧核酶催化特征

10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 双链稳定性越高，酶活性越高

结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性

极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性） 抗体酶

? 通过生物体免疫系统诱导产生的，具有底物过渡态结合部位的抗体，有很高的催化

活性。

? 抗体酶首先是抗体，具有高度选择性，同时又具有酶提高化学反应速度的性质。 抗体酶的催化特征

1、与天然酶相比抗体酶的特点

? 能催化一些天然酶不能催化的反应 ? 有更强的专一性和稳定性 ? 催化作用机制不同

2、抗体酶和非催化性抗体作用的比较

? 更高的反应特异性 ? 反应的可逆性 ? 反应的量效性 ? 反应过程 抗体酶如何生产？ 1、拷贝法：用已知的酶作为抗原对动物进行第一次免疫,获得抗酶抗体;再用抗酶抗体作为抗原进行第二次免疫获得抗抗体,抗抗体实际上就是具有原来酶活性的抗体酶。

? 优点:可以大量生产单克隆抗体酶

? 缺点:有相当大的盲目性和偶然性，并不能产生新酶。 2. 诱导法或者细胞融合法：

先用特定的半抗原(过渡态底物决定)与载体蛋白相连(如牛血清白蛋白等)。此偶联的物质作为抗原

免疫动物，产生抗体

产生抗体的脾脏细胞与骨髓融合，然后在体外培养，杂交体克隆化，然后繁殖成单一细胞或菌落单一细胞或菌落产生抗体。

模拟酶

? 用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在体内的化学反应过程 ? 吸收酶中起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天

然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，模拟酶对底物的结合和催化过程。 ? 又称人工酶或酶模型

生物催化剂

酶：传统酶、抗体酶――具有催化功能的蛋白质 模拟酶：具有催化功能的非蛋白质非RNA非DNA 核酶：具有催化功能的RNA或DNA

酶的应用

1 酶在医药方面的应用

? 用酶进行疾病的诊断 ? 用酶进行疾病的治疗 ? 用酶制造各种药物 2 酶在食品方面的应用

3 酶在轻工、化工方面的应用

? 用酶进行原料处理

? 用酶生产各种轻工、化工产品? 用酶增强产品的使用效果。 4 酶在环境保护中的应用

? 环境监测

? 废水处理 过氧化物酶 ? 可降解材料开发 5 酶在生物技术方面的应用

? 除去细胞壁 ? 大分子切割 ? 大分子连接

多酚氧化酶

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/b8ct.html