仪器分析实验三讲义

实验三 高效液相色谱法测定甘草酸二铵原料中的有关物质

一 样品简介

甘草酸二铵

分子式：C42H62O16.2(NH3) 分子量： 857.00

CAS号：79165-06-3

结构式：

〖英文名〗Diammonium glycyrrhizinate 〖药物作用〗

本品是中药甘草有效成分的提取物，具有一定的抗炎、保护肝细胞膜及改善肝功能的作用。药理实验证明，小鼠口服能减轻因四氯化碳、硫代乙酰胺和D-氨基半乳酸引起的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）及天冬氨酸氨基转移酶（AST）升高。还能明显减轻D-氨基半乳酸对肝脏的损伤和改善免疫因子对肝脏的慢性损伤。

〖作用与用途〗

用于伴有丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高的急、慢性病毒性肝炎。

二 实验目的

掌握高效液相色谱法测定原料药物中有关物质检查的方法。

作为一个药物,对其纯度的检查是保证安全有效的重要指标之一,而纯度检查的内容,根据各个药物的性质和特点有些不同,但基本上均要涉及各自的“有关物质”检查研究.有关物质的检查,在国际上已早为“人用药品注册技术规范协调会(ICH)”所关注,国内在新药的有关文件中也提出了供参阅的一些具体要求,并逐渐引起研制新药者的重视.

由于一个新药从合成原料药到制备有关的制剂,再经贮藏、运输、使用,要经历一段较为复杂和漫长的过程,在此期间,每一过程都有可能产生有关的物质,如生产中可能带入起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等；在贮藏和运输过程中,可能产生降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质.为保证药物的安全有效,同时也要考虑到生产实际情况,因此,国内外对药物的研究,可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质,但对毒性较大,能危害人体健康的、无效的或能影响药物稳定性的有关物质则必须严格控制。

因有关物质的量微小,故检测方法至关重要,必须选择专属性强、灵敏度高、重复性好的方法.目前,首选的是色谱法,可根据药物的具体品种及其有关物质的性质采用TLC,HPLC及GC等,有的还应采用其他有关的色谱或波谱法.对于一、二类新药更应重视,必要时可采用HPLC/UV二极管阵列、HPLC/MS或GC/MS等联机技术,对有关物质进行定性定量分析。

有关物质检查方法的建立要考察下列因素：

（1）研究方法的专属性：如采用的是HPLC,则在方法研究中可按中国药典附录的要求,进行系统适用性试验,考察方法的专属性,具体方法有:①如有关物质为已知的某中间体、副产物或降解产物,则可在原料药中加入该杂质适量进行试验,以证明能达到分离；②如有关物质为未知,可用含有杂质的粗品进行试验,以证明能达到分离；③将精制品经强光、高温、高湿、氧化剂或酸碱等分别处理,使样品光解、分解、氧化或水解后进行试验,以证明能分离出杂质.经上述方法试验能分离出杂质,即证明采用的方法具有一定的专属性。 （2）方法的灵敏度

在研究的方法具有专属性后,应考虑方法的灵敏度.如采用HPLC分析时,一般使最低检出量相当于基线噪音的3倍峰高时注入的样品量。 （3）阐明定性和定量的依据

有关物质定性、定量的最佳方法是采用已知对照品的方法,使所提供的定性和定量有充分依据。

（4）阐明有关物质的来源及其性质

为保证药物应有的纯度,特别是一类新药,对有关物质检查应严格要求,对其主要杂质要确证化学结构,对主要杂质和其他杂质要分别定出限量. （5）色谱图记录时间和进样量要求

在HPLC分析中,有关物质的保留时间可能在主成分峰之后出现,故记录时间应比主成分峰的保留时间延长2～3倍,并应考虑样品配制浓度或进样量致使主成分峰为一矩形峰,以确保样品中的有关物质能全部检出。

三 色谱条件

仪器：岛津LC-20AT， LC-2010CHT 系列高效液相色谱仪； 色谱柱：Diamosil C18 (5u, 150×4.6mm)；

流动相：甲醇-水-冰醋酸（76:22:2, 用磷酸调pH至3.5)； 流速：1ml/min； 检测波长：252nm。

四 有关物质测定

1． 样品溶液的制备

取甘草酸二铵样品混合均匀后,取12.5mg, 精密称定后置25 ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得。

2．对照溶液的制备

精密吸取上述样品溶液1ml,至50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得。

3． 测定法

照上述色谱条件，取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间 的2倍。供试品溶液的色谱图中，按归一化法计算，主峰峰面积比值应大于75%，主峰邻近的甘 草皂苷G2及乌拉尔甘草皂苷B峰峰面积之和比值应大于20%，其它各杂质峰峰面积的和不得大于对照溶液的主峰峰面积值。

五 复习思考题

1．在有关物质检查过程中，应重点注意哪些因素？

2．查阅近期以甘草酸为原料新开发上市的药物的临床应用和质量控制研究方面的进展。

六 实验报告

1．记录样品HPLC色谱图中杂质峰以及对照溶液主峰的保留时间和峰面积值，计算样品中有关物质的含量。

2．比较各组有关物质检查的实验结果。

主要参考文献：

1.中华人民共和国药典（2005年版）一部

2．罗奕，HPLC法测定甘利欣注射液中有关物质的含量，中医药导报，2008，14（6）：105-107。

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