铁皮石斛的脱分化与再分化研究

生物技术综合实验

题 目： 铁皮石斛的脱分化与再分化研究

Title： Dedifferentiation and re-differentiation of Dendrobium

学 院

年级专业

学生姓名

学 号 指导教师

生命与环境科学学院 2011级生物技术 丁铭 110153322 赵军

完 成 日 期 2014 年 5 月

目录

摘要

关键词

正文

一、铁皮石斛的概述及其药用价值--------------------------------------4

二、自然生长和繁殖条件----------------------------------------------4

(一)、铁皮石斛的繁殖特性----------------------------------------4

(二)、自然生殖条件----------------------------------------------4

(三)、繁殖状况--------------------------------------------------5

三、实验操作-------------------------------------------------------5

(一)、培养基的配制---------------------------------------------5

（二）、铁皮石斛的脱分化与再分化---------------------------------6

(三)、观察实验结果---------------------------------------------8

四、结论-----------------------------------------------------------8 参考文献

【摘要】

铁皮石斛为石斛属珍稀濒危药用植物,药用部分是新鲜或干燥茎,具有益胃生津、滋阴清热的功效。铁皮石斛的种子极小、无胚乳,自然条件下需与某些真菌共生才能萌发,很难用实生苗栽培,本文主要介绍通过铁皮石斛外植体的脱分化与再分化的研究来实现铁皮石斛的组织培养，从而应用到现实中来扩大铁皮石斛的生产，以便铁皮石斛的药用价值能够得到更好的利用。

【关键词】铁皮石斛、组织培养、愈伤组织、脱分化、再分化

【正文】

一、 铁皮石斛的概述及其药用价值

铁皮石斛,为石斛属珍稀濒危药用植物,俗称铁皮枫斗,又称黑节草,属于兰科附生兰类,是一种珍稀的药用植物和和名贵的室内观赏植物。野生的铁皮石斛大多分布在东亚、东南亚及澳大利亚等国家和地区[1]。在我国主要分布于秦岭、淮河以南的云南、广西、贵州、浙江等地的山区。

铁皮石斛的种子极小、无胚乳,自然条件下需要与某些真菌共生才能萌发,很难用实生苗栽培;而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低,加上人为的过度采挖和破坏生境,其资源已濒临灭绝,被国家列为重点保护的药用植物之一。

鉴于铁皮石斛在我国栽培的地域局限性,规模化开发石斛活性物质急需要开辟新的途径。而铁皮石斛组培以其繁殖规模大、速度快为优势是生产有效物质的一种有前途的途径和手段,是解决其资源紧缺问题的有效途径。因此对铁皮石斛组织培养及其工艺条件的深入研究就具有了非常重要的意义,它不仅具有显著的经济效益和社会效益,同时也具有显著的生态效益。

二、自然生长和繁殖条件

(一)、铁皮石斛的繁殖特性

铁皮石斛的种子极为细小，胚胎发育不完全，无胚乳组织，在自然状态下发芽率极低，有性繁殖极为困难，生长于悬崖峭壁之阴处，自然产量极为稀少，由于价值不菲，长期以来一直处于过度采挖状况，其野生资源已濒临绝种，被国家列为一级保护植物，野生资源远远不能满足药材市场的需要，人工繁殖主要靠无性繁殖，从根部不断分蘖或从上部茎节处生根长出新的植株[2]，但是产量很低，仍然离市场的需求相差甚远。科研人员努力探索人工快繁的方法，取得了不少的进展。

(二)、自然生殖条件

铁皮石斛生于海拔 2100-2500m的林中树上或林缘岩石上，或在河沟沟溪山谷旁峭壁上，并常与石苇等苔藓植物附生在一起，在我国主要分布于广西"云南"贵州等地[3]，喜阴凉“湿润”通风多雾的小气候。石斛在 14摄氏度时开始生长，20-26摄氏度且空气湿度大于80%最适宜；在 30摄氏度且相对湿度小于50%的情况下，叶脉变黄，叶片下垂，茎现皱缩，如崖缝渗水过多则易烂根致亡。石斛喜光又怕强阳光直射，忌干燥与高温[5]。

(三)、繁殖状况

铁皮石斛的有性繁殖极为困难，主要原因包括:

（1）其种子极为细小，胚胎发育不完全，无胚乳组织，在自然状态下发芽率极低，

（2）苛刻的生长环境，也限制了其有性繁殖,何平荣等［4］研究表明，铁皮石斛平均自然结实率为0.31%。铁皮石斛主要靠根部无性分蘖繁殖而不断生出新的植株并成丛生长，有时也从上部茎节处生根长出新植株[3]。

三、实验操作

(一)、培养基的配制

（a）实验用品

1）、 仪器和用品：500ml试剂瓶4个。100ml试剂瓶4个、高压灭菌锅、电子天平、烧杯（大、中、小各2个）、玻璃棒、移液管、搪瓷缸、培养瓶、电炉、PH计或精密PH试纸、容量瓶（大、中、小各1个）

2）、试剂（见MS培养基配制一览表）

MS培养基

大量元素 含量/(mg/L) 微量元素 含量/(mg/L) 有机营养 含量/(mg/L) NH2NO3 1650 KI 0.83 甘氨酸 2.0

KNO3 1900

CaCl2·2H2O 440

MgSO4·7H2O 370

KH2PO4 170 H3BO3 6.2 烟酸 0.5 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸硫胺素（Vb1） 0.5 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸吡哆醇（Vb6） 0.1 NaMoO4·2H2O 0.25 肌醇 100

CoCl2·6H2O 0.025 蔗糖 30000 CuSO4·5H2O 0.025 pH 5.8

FeSO4·7H2O 27.8

Na2·EDTA 37.3

（b）、实验步骤

（1）母液的配制

为了避免每次培养基时都要对所需的各种成分进行称量，人们便把培养基中必需的一些物质按原量的10倍、100倍或1000倍称量后放在一起，成为一

种浓缩液。这种浓缩就叫“母液”。

1)、大量元素：一般配成使用浓度的10-20倍，浓度太大的母液在冰箱保存时会结晶。除钙盐外，其他大量元素按一定倍数分别用蒸馏水溶解后混合在一起，最后加蒸馏水定容。钙盐要单独配制，不能和磷酸、硫酸混合，以免生成磷酸钙或硫化钙，发生沉淀；

2）、微量元素：微量元素因用量小，为称量方便及精确起见常配成100倍或1000倍的母液，即每种化合物的量加大100倍或1000倍，逐个溶解并混合在一起；

3）、铁盐:微量元素中的铁盐是单独配制的，由硫酸亚铁5.56g和乙二铵四乙酸二钠7.46g溶于1L培养基加铁盐5ml；

4)、有机物质：主要指氨基酸和维生素物质，分别称量并用容量瓶配制成所需浓度（0.1-10mg/ml），用时按培养基配方中要求的量分别加入。这些化合物都易溶于水，直接用水配制；

5）、生长调节物质：一般配成0.1-1.0mg/ml.生长素类IAA、NAA、2，4-D等，配制时先按要求浓度称好药品，置于小烧杯中，用1-2ml0.1mol/LNaOH溶解，再加蒸馏水稀释至所需浓度。如果用少量95%乙醇来溶解亦可，有时效果不如氢氧化钠好。

（2）、配制培养基

1）、吸取各种母液，按照培养基配方吸取一定量的各种母液混合在一起。大量及微量元素的母液吸取量为：

母液吸取量=配培养基的数量/母液扩大倍数

有机物及生长调节物质的母液吸取量为：

母液吸取量=每升培养基要求的含量/每毫升母液中的含量

（本次实验的培养基配方：

脱分化培养基：MS+NAA0.8（mg/L）+6-BA0.3(mg/L)+蔗糖3%(g/100mL)+琼脂0.8%(g/100mL)；

再分化培养基：MS+NAA0.5（mg/L）+6-BA1.2(mg/L)+蔗糖3%(g/100mL)+琼脂0.8%(g/100mL)；)

2）、称取一定量的蔗糖，溶解后与上述溶液混合；

3）、称取一定量的琼脂，加蒸馏水，加热使其溶化成透明状后，和上述溶液合并；

4）、用蒸馏水定容到一定的体积，继续加热，不断搅拌，直至琼脂溶解；

5）、用PH计或精密PH试纸测PH，用1mol/l或0.1mol/l NaOH 或HCL将培养基的PH调到5.8-6.0；

6）、将配好的培养基用漏斗或粉状器分装到干净的培养瓶内琼脂约在40摄氏度时才凝固；

7）、用封口膜封口，并对不同的培养基及时做好标记。

(3)、灭菌

通常培养基应在气相121摄氏度的条件下在高压灭菌锅内灭菌20min。

（二）、铁皮石斛的脱分化与再分化

（1）、脱分化与再分化的概述

在植物叶肉细胞的脱分化，再分化过程中伴随着叶绿体与质体相互转化的过程，已高度分化的叶肉细胞脱分化为分生状态细胞时，其中的原质体主要由叶绿体出芽生殖产生，偶尔可以看到某些叶绿体分裂或分裂与出芽同时出现的情况。此外，叶绿体在出芽产生原质体的同时自身逐渐被巨大的淀粉粒所充满，从而转变为淀粉体，植物分生组织转变成芽的过程中，原质体向叶绿体的转变是保证植物正常生理功能，维持质体延续性的基础[5]。

(2)、实验操作

1）、操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净，再用75%酒精消毒，尽量做到不带菌；

2）、将装有无菌苗的培养瓶用75%酒精消毒后放在超净台上备用。将已培养好的无菌铁皮石斛幼苗取出移至已经灭菌的培养皿上进行切割操作，这里因为是已培养好的铁皮石斛的无菌苗，所以不需要进行消毒灭菌操作。

3）、将铁皮石斛从培养瓶中取出来，分别取茎切成大约1cm和2.5cm大小的若干段然后移至到先前配好的脱分化与再分化的培养基。注意脱分化是将1cm的茎片段平放入培养基中；再分化需要将2.5cm大小的茎插入到培养基中，分别成三角形排列。

4）、将已经移至好的脱分化与再分化的培养基拿出超净工作台，放到培

养室中培养，然后收拾超净工作台。

(三)、观察实验结果

因为培养时间较短，所以脱分化培养基并未长出明显的愈伤组织，再分化培养基也未长出明显的不定芽（如图所示）。如果在合适的培养环境中，培养时间充足，则会在脱分化与再分化的培养基中长出明显的愈伤组织和不定芽。

三、结论

目前，铁皮石斛在组织培养方面已经取得很大的进展，并已应用于生产，这对濒临灭绝的野生铁皮石斛资源有缓解作用。当前铁皮石斛价格昂贵，供不应求，如何缩短其生长周期，且提高药用成分含量是解决铁皮石斛大规模生产的关键问题。

据报道:全国铁皮石斛种植面积已突破，浙江、云南和广西等多地建立了铁皮石斛种植基地。因此，我们应加强铁皮石斛优良品种的选育和加强种质资源的保存，防止种苗退化，以实现铁皮石斛利用与保护的可持续发展。所以我们采用铁皮石斛的体外离体培养，以便有利于实现铁皮石斛的扩大生产，从而使铁皮石斛的药用价值得到很好的利用。

【参考文献】

[1] 吴韵琴, 斯金平. 铁皮石斛产业现状及可持续发展的探讨[J].中国中药杂志,2010,35(15):2033.

[2] 单芹丽, 杨春梅, 赵培飞, 汪国鲜. 铁皮石斛的植物学特性及组培苗生产技术[J]. 现代农业科技,2010,38(10):28.

[3] 中华人民共和国药典委员会. 中国药典(2005版第一部)[M]. 北京: 化学工业出版社,2005.

[4] 魏凤娟. 铁皮石斛组织培养与栽培技术研究进展[J]. 广东农业科学,2010(4):81-25.

[5]邸淑菊.铁皮石斛产业化的调查研究[J].安徽农学通报,2007,13(11):137-138.

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/b4pi.html