对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测

第32卷第3期浙江师范大学学报(自然科学版)V o.l32,N o.3

2009年9月Journa l o f Zhe ji ang N or m a lU n i ve rsity(N at.Sc.i)Sep.2009

文章编号:1001-5051(2009)03-0317-05

对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测*

鲍毅新,孙波,张龙龙,赵庆洋

(浙江师范大学生态研究所,浙江金华321004)

摘要:以小型哺乳动物社鼠为例,通过调整酚与氯仿的比率、减少抽提次数及消化时间,对采用-70e超低温冰箱、-20e低温冰箱、70%乙醇液浸泡、95%乙醇液浸泡和含50mmo l/L乙二胺四乙酸二钠的70%乙醇液浸泡等不同方法保存的社鼠肌肉组织提取基因组DNA,并对其进行微卫星指纹图谱分析,研究了改进方法对不同方法保存的社鼠肌肉组织提取DNA的效果,并比较了不同保存方法对DNA提取效果的影响.结果表明:改进方法可行,完全可以满足微卫星等分子标记技术的需要.

关键词:社鼠;DNA提取;聚合酶链反应;动物组织;样品保存

中图分类号:Q95-3文献标识码:A

The i m prove m ent for m ethod of DNA extraction fro m

ani m al tissue and PCR detection

B AO Y i x in,SUN Bo,Z HANG Long l o ng,Z HAO Q i n gyang

(Instit u te o f E cology,Zhejiang Nor m al University,Ji nhua Zh eji ang321004,C hina)

Abst ract:It w as used the tissue o f N iviventer confucianus by different preserving m ethod to ex tract DNA, t h rough adjusti n g the rati o of pheno l and ch l o ro for m,reducing extracti o n and digesti o n ti m e.The tissue w ere preserved i n differentw ay inc l u d i n g-70e refrigeration,-20e refri g erati o n,70%alcoho l soak,95%a-l coho l soak and70%alcoho l soak w ith50mm ol/L EDTA.M icrosatellite fingerprintw as used to detect t h e ex-tracted geno m e DNA in o r der to study the DNA ex traction effect fro m t h e m usc le tissue w it h different preserved w ay using i m proved m ethod.It w as approved that the i m pr ove m ent technique w as feasi b le and e ffective.This m ethod cou l d be used w ith m icrosate llite and other m o lecular m arker.

K ey w ords:N iviventer confucianus;DNA ex tracti o n;PCR;an i m al tissue;sa m ple conservation

自20世纪50年代W atson和C rick提出DNA双螺旋模型以来,分子生物学技术得到了空前的发展.随着聚合酶链反应(PCR)技术的日趋成熟和完善,限制性片段长度多态法(RFLP)、随机扩增多态

*收文日期:2008-12-05;修订日期:2009-04-03

基金项目:浙江省自然科学基金资助项目(Y507080)

作者简介:鲍毅新(1958-),男,浙江建德人,教授,硕士.研究方向:动物生态学.

318浙江师范大学学报(自然科学版)2009年

DNA(RAPD)、微卫星(SSR)、扩增片段长度多态法(AFLP)等各种分子标记(m olecular m ar ker)技术如雨后春笋般地发展起来.这些分子标记技术在生态学、保护生物学以及遗传育种、基因图谱的构建、品种鉴定、生物遗传多样性等方面的研究中得到了广泛的应用[1-6].

以PCR技术为核心的分子标记,无论采用哪种分子标记技术,都必须提取纯化结构完整的DNA.就目前应用较为广泛的DNA提取方法而言,高盐法提取DNA虽然简便、快速,但所提取的DNA纯度及稳定性较差,影响后期的聚合酶链反应;经典的酚-氯仿抽提法则由于消化时间长及抽提步骤繁琐,影响实验的进程.因此,有必要在动物组织DNA提取方法上进行改进.

笔者以小型哺乳动物社鼠(N iviventer confuci a nus)为例,参考文献[7]的方法,对经典的酚-氯仿抽提方法进行了改进,通过调整酚与氯仿的比率、减少抽提次数及消化时间,对采用-70e超低温冰箱、-20e低温冰箱、70%乙醇液浸泡、95%乙醇液浸泡和含50mm ol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的70%乙醇液浸泡等不同方法保存的社鼠肌肉组织提取基因组DNA,将所提取的基因组DNA进行微卫星指纹图谱分析,探讨了改进方法对不同方法保存的社鼠肌肉组织进行DNA提取的效果及影响.

1材料和方法

1.1动物标本及处理

笼捕社鼠5只,带回实验室处死,迅速取腿部肌肉组织分成5份,2份装入样品袋,分别置于-20e 和-70e冰箱中保存;3份分别置于盛有约100mL95%乙醇溶液、70%乙醇溶液和含50mm o l/L EDTA 的70%乙醇溶液的小口塑料瓶中固定.样品保存2个月,用于模版DNA的提取.动物解剖在无菌操作台上进行,用于解剖不同个体的解剖器具严格分开和清洗,防止交叉污染.

1.2试剂

细胞裂解液(10mm ol/L T ris-H C l(p H8.0),100mm o l/L Na2EDTA(p H8.0),5g/L十二烷基硫酸钠(SDS)),核糖核酸酶A(RNase A,60U/mg),蛋白酶K溶液(20m g/mL),T ris-饱和酚,氯仿-异戊醇(体积比24B1),TE(10mm o l/L Tris-HC l(pH8.0),1mm o l/L N a2EDTA(p H8.0))和灭菌双蒸水(dd H2O).

1.3肌肉组织DNA提取

取固定剂固定肌肉样品,用灭菌ddH2O清洗样品表面3次,滤纸吸干表面水分.取肌肉组织150~ 200m g,切碎,转移至1.5m L离心管中(每份样品取2份),然后加入800L L DNA提取液(提取液预热,以抑制脱氧核糖核酸酶(DN ase)的活性,加速蛋白变性,促进DNA溶解)和6.5L L蛋白酶K溶液,置于旋涡振荡器上混匀后,55e水浴下消化约4h,不时轻摇混匀,直至溶液透明,4e6000r/m in离心8 m in;取上清液800L L置另一离心管中,加入1L L RNase A溶液,混匀,37e水浴40m i n,冷却至室温,加入700L L T ris-饱和酚、100L L氯仿-异戊醇(体积比24B1),混匀仪上混匀15m in,4e10800r/m i n 离心12m i n;取上清液650L L置另一离心管中,加入650L L氯仿-异戊醇(体积比24B1),混匀仪上混匀15m i n,4e10800r/m i n离心12m in;转移上清液450L L至新离心管中,加入900L L预冷的无水乙醇,-20e沉淀DNA1~2h,4e12000r/m in离心15m in;弃上清液,70%乙醇溶液400L L洗涤沉淀3次(倒掉液体后再短暂离心,将残液用移液器吸出),干燥DNA,溶于150L L TE中.

1.4DNA质量检测

将样品稀释50倍,以TE做空白对照,分别在260n m、280nm波长处用紫外可见分光光度计测定DNA稀释液的吸光度值,计算DNA的含量.通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA片断大小及DNA的降解情况.对提取的总DNA利用微卫星引物进行PCR扩增,检测DNA扩增情况.

1.5PCR扩增

1.5.1微卫星位点的选择

选取4对筛选自大、小鼠适用于社鼠的微卫星引物(待发表),由上海生工生物工程技术服务有限公司进行引物合成.引物相关信息如下:

ACP H引物序列:上游5c-CCAATGCTTGTGA CAATATCC-3c,下游5c-C ATTTCTGAAA CGTTGTTTCCTC-3c,片段长度110~140bp.

PKC引物序列:上游5c-AGAACCCTTCACTGCTCACC-3c,下游5c-AGAAAGTCCCAGAAAGTGG C-3c,片段长度140bp.

D11M it2引物序列:上游5c-TCCCAGAGGTCTCCAAGACA-3c,下游5c-CCACAGTGTGTGATGT CTTC-3c,片段长度110~140bp.

D9M it23引物序列:上游5c-AAGAAGTTTCCATGACATCATGAA-3c,下游5c-AGAAGAAAATTCTTGACAGCT CTG-3c,片段长度210~320bp.

1.5.2PCR扩增体系

PC R体系为:10@buffer(分为含M g2+1.0,1.5和2.0mm o l/L3种buffer)2.5L L、三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)溶液(2.5mm ol/L)1.5L L、上游和下游引物溶液(10L m o l/L)各0.4L L、样品DNA溶液1 L L、Taq酶溶液(5U/L L)0.2L L,加水至25L L.

扩增程序为:94e预变性5m i n;94e变性30s;退火温度分别为53.7e(ACP H),58e(PKC), 56e(D11M it2)和53.7e(D9M it23),72e延伸40s,35个循环,72e延伸10m i n.扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭(EB)染色,检测微卫星引物对所提取社鼠DNA扩增的结果.

2结果与分析

2.1DNA电泳结果

经紫外可见分光光度计检测,所提取不同保存方法的肌肉组织DNA的吸光度值260nm/280nm为

1.7~1.8,所提取的DNA纯度较好,电泳结束后在点样孔附近都有单一的高分子量条带(见图

1).

M:DL2000M arker,100~2000bp;1-2:-70e冰箱保存;3-4:-20e冰箱保存;5-6:70%乙醇液保存; 7-8:95%乙醇液保存;9-10:含50mm ol/L EDTA的70%乙醇液保存;11-12:新鲜组织;13:阴性对照图1不同保存方法提取DNA的电泳结果319

第3期鲍毅新,等:对动物组织DNA提取方法的改进及PCR检测

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示:-20e 低温冰箱、70%乙醇液保存的样品提取的DNA 稍有拖带现象出现,但不明显,DNA 条带的亮度相对于其他保存方法的样品较弱;含50mm o l/L EDTA 的70%乙醇液、95%乙醇液处理的样品没有拖带出现,电泳条带相对较亮,点样孔10内出现亮团,说明稍有蛋白质等大分子残留,可能提取过程中DNA 清洗不完全所致;-70e 超低温冰箱保存的样品,无论在条带的完整性上、还是条带的亮度上都与新鲜样品保持一致,可见-70e 超低温冰箱保存样品对样品DNA 的影响最小.

总体上,5种保存方法保存的社鼠肌肉组织通过改进方法提取DNA,条带都较完整,亮度也适中,虽部分样品提取的DNA 稍有涂带和点样孔残留,应为实验操作所致,对于实验整体影响不大,改进方法提取的DNA 理想.其中,含50mm ol/L EDTA 的70%乙醇液、95%乙醇液为固定剂保存的肌肉组织,提取的DNA 条带的亮度、完整性明显高于-20e 低温冰箱、70%乙醇液保存的样品,可以看出,这2种方法能更好地抑制DNase 对DNA 的降解,达到较好的保存效果,为野外采样保存样品的首选.

2.2 PCR 扩增及检测

4对微卫星引物对提取的DNA 进行扩增,所有被扩增出的DNA 都出现理想的条带(见图2),表明改进方法适合于不同保存方法保存的动物肌肉组织DNA 的提取,完全可以满足进一步研究的需求

.

M:DL2000M arker ,100~2000bp ;1-6:引物P KC;7-12:引物D11M i t2;13-18:引物ACPH;19-24:引物D9M it 23.

每一引物自左至右依次为:-20e 冰箱,95%乙醇液,70%乙醇液,含50mm ol/L EDTA 的70%乙醇液,-70e 冰箱保存和新鲜组织

图2 4对微卫星引物对提取DNA 扩增的电泳图谱

3 讨 论

建立在PCR 基础上的分子标记技术,在核酸和蛋白质水平上阐明生命系统与环境系统的相互作用规律[8],能以微观的视角解释其他方法技术现在无法解决的问题.但由于PCR 扩增对模板DNA 的质量

要求较高,DNA 质量是影响分子实验结果的关键因素之一,因此,能否获得高分子量的DNA 对实验的成败至关重要[9,10].经典的酚-氯仿抽提是实验室最常用的提取DNA 的方法,但由于酚类物质具有高度

腐蚀性,易引起严重的烧伤,故在涉及酚的所有实验操作中实验者往往须采取一定的防护措施;并且实验使用的酚为商品酚,易被氧化产生酚的氧化物如醌、二酸等,可破坏核酸的二酯键,并引起DNA 链的交联.本研究针对经典酚-氯仿抽提中存在的诸多问题进行了部分修改.酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,酚抽提时会有部分DNA 被带走;氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.将酚与氯仿以适当比例混合,利用酚与氯仿之间互溶的特点,可减少DNA 的损失,最后用氯仿-异戊醇(体积比24B 1)第2次变性蛋白质,并将残存的酚带走.实验过程操作步骤少,缩短了提取过程,减少了反复抽提对DNA 的破坏及损失,保证了所提DNA 的完整性和纯度.320浙江师范大学学报(自然科学版) 2009年

很多实验涉及到野外采集动物组织样品,由于野外标本采集和运输过程中基本上没有冷冻保存的条件,为更好地保存好动物组织标本,为实验室研究提供优质DNA 模板材料,就需要一种简便的保存方法.乙醇作为常用的固定剂,能迅速地渗透进入组织细胞,凝固蛋白质,使多种水解酶失活而不损伤DNA,从而达到保存DNA 的目的.研究表明,DNA 在乙醇中可保存较长的时间,说明乙醇对DNA 没有或仅有较弱的降解作用[11,12];并且,以乙醇为固定剂保存的样品提取的DNA 质量好

[13,14].因此,乙醇被广泛应用于样品的保存.EDTA 能够螯合M g 2+、C a 2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解

作用(DN ase 作用需要一定的金属离子做辅基),在70%乙醇液中加入适量的EDTA,可以迅速抑制DNA 酶的活性,进一步减少DNA 的降解[2].从本实验结果来看,不同含量的乙醇溶液为固定剂时,含50mmo l/L EDTA 的70%乙醇液与95%乙醇液效果相当,而70%乙醇液效果较差,但由于含50mm o l/L EDTA 的70%乙醇液需要配制,携带及使用不如95%乙醇液方便,并且以95%乙醇液为固定剂保存的动物组织可得到高质量的DNA,PCR 检测效果也很好,因此,以95%乙醇液固定动物组织是野外取样的最佳保存方法.

实验室内样品的保存,常规的方法是将样品放置在-20e 低温冰箱中.由本实验结果可以看出,-20e 低温冰箱对于样品的保存能力较差,仅可用于短时间内样品的存放,长时间样品的存放最好在-70e 超低温冰箱内.

改进方法提取上述5种保存方法保存的肌肉组织DNA,经琼脂糖凝胶电泳,在点样孔附近都有单一的高分子量条带,提取效果总体较好;4对微卫星引物对提取的DNA 进行扩增,所有被扩增的DNA 都出现理想的条带.总体来说,改进方法所提取的不同保存方法保存的社鼠肌肉组织总DNA 完全可以满足微卫星等相关分子标记实验的需要,是一种切实可行的方法.

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(责任编辑 薛 荣)321

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