浅谈化学发光免疫分析的研究进展

浅谈化学发光免疫分析的研究进展

建立在放射免疫分析技术理论基础上的化学发光免疫分析，是一种非放射标记免疫分析法，这种免疫分析方法主要以标记发光剂为示踪物信号建立起来。近十年来在世界范围内发展迅速，它具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。

1 化学发光免疫分析技术的研究历史背景

免疫分析的发展伴随着抗体制备技术的改进而不断提高。美国科学家Yalow等人首先将标记技术引入免疫分析，他们首先用放射免疫分析法(RIA)进行测定胰岛素。由于这种试验方法限制了试剂的寿命，难以获得长期稳定的检测标准，同时由于存在同位素的使用，不仅会损害操作人员身体健康，也会带来污物处理困难的问题。为了找到更为合理的免疫分析法成为以后20年来研究的热点。直到70年代末，国外有学者将免疫反应与化学发光测定技术相结合，这种集高灵敏度和高特异性的技术称之为化学发光免疫分析法，化学发光免疫技术优势比较明显，主要有以下几点：第一，灵敏度高，检测限范围更精准;第二，自动化程度高，并且没有放射性辐射危害;第三，发光标记物稳定，有效期长，同时应用范围宽，对于分子大小不同的抗原、半抗原及抗体都可检测。因此，化学发光免疫分析在临床、卫生、食品、环保和军事等领域正被越来越多地用于激素、蛋白质、肿瘤、毒物、病毒等成分检测。

2 免疫分析基本原理

由免疫反应系统和化学发光分析系统两个关键部分组成了化学发光免疫分析的基本原理，化学发光分析系统主要氧化以及催化的作用于化学发光物质，产生一个激发态的中间体，在处于稳定状态时，发射出光子，然后通过测量仪器测量光量子。通过标记物与发光强度的关系，进而测出被测物质含量。而免疫反应系统是将发光物质在抗原或抗体上直接标记。 3 化学免疫分析分类

化学发光免疫分析法主要以标记法的不同来进行分类，目前习惯上将免疫分析法主要分为两类，第一主要是标记免疫分析法，其次是酶免疫分析法，前者是以化学发光标记，后者是以酶标记，以化学发光底物作为信号试剂来进行发光，其原理是不相同的。除此之外，包括荧光免疫分析法以及电化学发光免疫分析法也是目前存在的化学免疫法分析方法。

3.1 化学发光标记免疫分析

将化学发光剂如吖啶酯类化合物，直接标记在抗原上或抗体上，其基本原理是启动发光剂发光，快速闪烁。这种标记物其化学反应简单、快速、无须催化剂;夹心法用于大分子抗原，竞争法主要用于检测小分子抗原，另外本底低，非特异性结合相对较少光量不会因为分子大小而受影响，因此能增加灵敏度，一般常用的化学发光物质主要是通过启动发光试剂NaOH-H2O2作用而发光，其发光非常迅速，小分子物质多采用竞争法，夹心法主要用于大分子物质。

3.2 化学发光酶免疫分析

通过酶标记生物活性物质，再作用于发光底物，在信号剂的作用下发光，然后用发光测定仪进行测定。化学发光酶免疫分析酶反应的底物是发光剂，按照标记免疫分析，应属酶免疫分析，其操作步骤与酶免分析完全相同。目前常用的标记酶为碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，它们有各自的发光底物。化学发光酶免疫分析法种类大致有三种，首先是HRP标记CLEIA，一般常用3-氨基邻苯二甲酰肼作为底物，也即是鲁米诺或者用其衍生物4-氨基邻苯二甲酰肼也是可以的，这两种都是重要的发光试剂。需要注意的是该底物需要在碱性缓冲溶液中进行氧化反应，生成激发态中间体，当然这需要在过氧化物酶及活性氧存在的条件下进行，中间体回到基态时就可以发光，此时的波长一般在425nm。曾经先前有人用该标记底物标记抗原或抗体，但后来发现其发光强度多受灵敏度的影响。目前用过氧化物酶进行标记，其发光强度主要依赖酶免疫反应中的酶的浓度大小;其次增强发光酶免疫分析也是化学发光酶免疫分析的一种，它主要是在将增强的发光剂加入到发光系统中，加强发光的信号强度，并且能够保持长时间的稳定性，在一定程度上提高了该分析方法的准确性和灵敏度，便于多次测定。目前在一些现代化的设备上，还可以由计算机进行精确控制操作，比如，往系统中加入发光试剂以及混合、温育、洗涤等，甚至后期的数据处理，进而绘制标准曲线，最终完成患者血清样品的分析并打印出结果;最后一种就是用ALP标记的CLEIA，这种分析方法一般多用环-1，22-二氧乙烷衍生物作为发光底物，它的发光原理主要是其用化

学发光酶免疫分析底物而设计的分子结构稳固，其中的芳香基作为发光基团和酶作用，在发光试剂的作用下发光，该底物在碱性磷酸酶的作用下，磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基，就会产生一个稳定的中间体，然后中间体发生裂解会产生金刚烷酮和激发态的物质，这种常见底物是AMPPD，其作为磷酸酯酶的直接化学发光底物，多用来检测碱性磷酸酯酶和一些配基的结合物。 4 应用

4.1 激素、蛋白质和肿瘤检测

该系统使反应物形成均相混悬液，顺磁微粒作为固定相，增大反应面积，加速免疫反应，快速分离，自动洗涤，减少酶和催化剂的使用，pH调整即可，避免了许多影响因素，广泛应用于甲状腺功能、药物检测、肿瘤标志物及心血管等项目。 4.2 病毒、毒物检测

杨秀岑等用ABEI标记兔抗大肠杆菌lgG，试样温育、离心、沉淀峰值用luminol-H2O2-NaOH 发光体系测定;章竹君等测定了粪样中的轮状病毒以HRP酶标记;为研究TNT对人体的毒害作用提供方法，张丽民等以HRP标记免疫测定了血清中4-氨基-2，6-二硝基甲苯，效果非常显著。

4.3 其他方面的应用

被越来越多地用于免疫测定中的HRP酶标记生成核酸探针，主要采用两种形式，一种是靶DNA杂交，将HRP直接标记在探针上，同时增强的鲁米诺试剂检测加入分离后的杂交体。另外一种是将DNA探针标

记在生物素及地高辛上，然后与靶DNA杂交，再用HRP标记的亲和素和抗地高辛与分离后的杂交体结合，最后加入鲁米诺试剂氧化发光。 5 展望

化学发光免疫分析已成为生物技术领域的一种重要的检测方法，其相比较于传统的放射免疫分析方法，其安全、稳定、测量快速等优点被广泛应用。当然，目前化学发光免疫分析技术也存在不少的问题，例如，化学发光标记物质量和稳定性差，包括标记技术都是比较落后的。因此，要想获得更为广泛的发展和使用空间，首先要加快国产发光免疫分析试剂盒的研发，另外要提高分析和测定的稳定性，只有这样，将来化学发光免疫分析技术用于临床医学检验，才能带来更大的获益。

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