生物工程专题

低聚壳聚糖的功能及制备

生物工程 方安然 13849913

摘要：本文综述了低聚壳聚糖的性质和功能以及制备方法。 关键字：低聚壳聚糖，功能，制备方法

甲壳素(Chitin)，又名几丁质、甲壳质、壳多糖等，壳聚糖(Chitosan)是甲壳素脱乙酰化的产物，结构式如图1。甲壳素广泛存在于生物界，如海蟹、海洋贝壳类、软体动物软骨、昆虫外壳以及蘑菇类的细胞膜中，是仅次于纤维素的第二大多糖，素有“人体第六要素”的美誉[1]。由于具有良好的生物相容性和可降解性

[2]

，因而具有广泛的用途。但由于其分子量大、水溶性差、在人体内不易被吸收

而使其应用受到限制[3]。低聚壳聚糖(Chitooligosaccharide)是壳聚糖经降解生成的一类低聚物，是一种可生物降解的聚阳离子高分子材料。低聚壳聚糖也叫做壳寡糖、壳聚寡糖或几丁寡糖，学名叫β-1,4-寡糖-葡萄糖胺[4]，其相对分子量一般在1000-10000之间。低聚壳聚糖的水溶性显著提高，其不仅保留了高分子量壳聚糖原有的功能特性，而且还有许多独特的生理活性和功能性质，具有更有魅力的新用途。

1 低聚壳聚糖糖具有性质和功能 1.1 水溶性

当壳聚糖降解时，其相对分子质量降低，壳聚糖分子中的氢键作用随之减弱，使壳聚糖分子在溶液中具有更大的扩展趋势，从而引起壳聚糖分子构象发生一定的变化。而链长度和分子构象的变化使得壳聚糖在水溶液中的无序程度增加，从而使其水溶性大为改善。 1.2 吸湿保湿性

夏文水等人相对分子质量在1500和3000之间的低聚壳聚糖进行研究，结果表明这个分子量区间的壳聚糖保湿和吸湿能力均高于透明质酸、甘油和乳酸钠，且抑菌作用极为显著[5]。 1.3抗菌抑菌功能

有试验证明壳聚糖的抑菌作用是随着壳聚糖相对分子质量的降低而逐渐增强的，尤以相对分子质量为1500左右的低聚壳聚糖的抗菌效果最好[5]。低聚壳

聚糖能够吸附在细胞膜表面，改变细胞膜的选择透过性，阻止营养物质向细胞内的运输，最终致使细菌的细胞质流失，细胞质壁分离，从而起到抑菌杀菌作用[13]。低聚壳聚糖尤其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、小肠结炎耶尔森菌、鼠伤寒沙门菌和李斯特单核增生菌等有较强的抑制作用[7]。在微环境中具有较强抑菌作用和显著的保温吸湿能力等；特别是较高聚合度低聚壳聚糖具有阻碍病原菌生长和繁殖的功能，能促进蛋白质合成；活化植物细胞，从而促进植物快速生长等[8]。 1.4 凝血性质

低聚壳聚糖是含有氨基的碱性多糖，与生物组织的兼容性好，能够促进组织再生，并且能够吸引带负电荷的血小板和红细胞。低聚壳聚糖分子链上-NH：的亲水性使其能够增加纤维蛋白原的吸附数量，从而增加血小板粘附和血栓的形成

[9]

。这一性质使得低聚壳聚糖已经成为一种安全有效的理想止血剂[10]。

1.5抗肿瘤及免疫活性

低聚壳聚糖可以激活人体中的淋巴细胞，吸附在血管壁的表面，抑制癌细胞的繁殖、转移以及癌毒素在体内的释放，从而达到抗癌和抑癌作用。在日本低聚壳聚糖已经被广泛用作抗肿瘤保健食品的添加剂[11]。同时低聚壳聚糖能够诱导局部巨噬细胞增生，使其活性增强，提高机体的免疫力[12]。

另外低聚壳聚糖还可作为果蔬保鲜剂、保健食品添加剂、抗溃疡，降胆固醇剂，还可以用于食品工业废水和重金属废水的处理等，在环境保护、农业、化妆品等领域也有广阔的应用前景。低聚壳聚糖的许多优越的生物活性和功能性质不断地被发现，应用领域也逐步扩大。

2 低聚壳聚糖的制备

低聚壳聚糖的制备主要从生物体内提取，基本过程是：生物体提取甲壳素、

甲壳素脱乙酰得壳聚糖、壳聚糖水解制备出低聚壳聚糖。最近有项发明可以利用

丝状真菌将木糖转化为壳聚糖，提高了壳聚糖的产率。

2.1 甲壳素制备

甲壳素主要来源于虾、蟹、昆虫等外壳，其外壳主要由甲壳素、蛋白质和CaC03组成，含有少量的色素、脂类及金属盐类。通常用稀酸(一般4％-6％HCI)除去CaC03，和金属盐类，再用浓碱(一般10％NaOH，100℃)去除蛋白质和色素，即得甲壳素制品，产物乙酰度为90％-95％。通常虾类提取率高于蟹类。Shimahara等[13]研究一种蛋白酶(来自Pseudomonas maltophilia)可替代浓碱，不水解糖苷键，可在温和条件下去除蛋白质。Aline等[14]研究了从海洋虾类(Parapenaeopsis stylifera)提取甲壳素的优化条件。过量的0.25mo/L HCI (固液比w/v=1/40)常温下处理15min去除CaC03，1mol/L NaOH在70℃条件下处理24h去除蛋白质，产物甲壳素乙酰度达95％。

2.2 壳聚糖制备

甲壳素脱乙酰后可制得壳聚糖。仅一甲壳素用浓碱(40％-50％NaOH，120-1500C)脱乙酰处理可产生壳聚糖，产物乙酰度为5％-30％[15]。反复碱处理可制备高脱乙酰度壳聚糖。

Kurita等通过比较研究认为，β-甲壳素比α-甲壳素易脱乙酰，且不易变色。β-甲壳素脱乙酰条件为40％NaOH、80℃。Mc Gahern等[16]研究认为，一些真菌细胞壁中含有壳聚糖，可分离制得，虽制备成本较高，但反应条件较温和。酶法制备壳聚糖是利用专一性酶对甲壳素进行脱乙酰基反应，这种方法的关键是如何获得甲壳素脱乙酰酶。许多微生物可通过自身合成的甲壳素酶、壳聚糖酶、甲壳素脱乙酰基酶等将甲壳素降解为壳聚糖，将这几种酶配合使用可以生成不同分子量的壳聚糖。

2.3利用半纤维素水解液中木糖制备壳聚糖方法

步骤如下：⑴取木质纤维素原料粉碎后对其半纤维素进行酸水解处理；⑵对半纤维素水解液进行脱毒脱色处理；⑶以脱毒后的半纤维素水解液为碳源培养丝状真菌；⑷利用碱液脱去丝状真菌的结合蛋白；⑸利用弱酸从丝状真菌中提取壳聚糖。本发明方法利用Ca(OH)2和活性碳对半纤维素水解液进行脱毒脱色处理，处理后的半纤维素水解液中毒性成分（如甲酸、乙酸、糠醛等）明显降低，为菌

丝体提供了良好的生长环境，实现了木质纤维素中半纤维素的利用和转化，提高了壳聚糖的产率，方法简单、操作方便[17]。

2.4 低聚壳聚糖的制备

目前，制备低聚壳聚糖的方法主要有化学降解法、物理降解法、酶水解法、

联合降解法和真菌提取法五大类。 2.4.1 化学降解法 2.4.1.1 酸降解法

目前，酸降解法主要有盐酸水解法、磷酸水解法、乙酸水解法、氢氟酸水解法、亚硝酸水解法、浓硫酸水解法和过醋酸水解法等。Sashiwa等[18]用过醋酸或以浓硫酸为催化剂，用 H2O2 把醋酸酐氧化成过醋酸，加入到壳聚糖的乙酸溶液中进行降解反应，利用这种方法制备的水溶性低聚壳聚糖产品具有可以长期保存的优点，特别适合于食品及化妆品用低聚壳聚糖的生产。酸水解法的优点是价格低廉、操作简单，缺点是反应时间长且难以控制，得到的低聚壳聚糖的分子量分布较宽，并且对环境污染严重。 2.4.1.2 氧化降解法

氧化降解法是近年来国内外研究最多的壳聚糖降解方法。目前报道的氧化降解法主要有过氧化氢降解法、过硫酸钾降解法、亚硝酸盐降解法、过硼酸钠降解法、次氯酸钠降解法、臭氧降解法、二氧化氯和氯气降解法等。

H2O2 氧化降解因具有反应速度快、产率高、反应物无毒等优点而倍受关注，在酸、碱和中性条件下都可以使壳聚糖主链上的 β-（1→4）－糖苷键发生氧化而断裂，得到分子量小于 1.5 万的水溶性壳聚糖，在碱性和中性介质中，降解是非均相反应，反应既慢且不均匀；在酸性介质中，反应是均相反应，有利于壳聚糖的降解。过氧化氢降解的优点是操作简便，且反应能在较短的时间内完成，存在的主要问题是壳聚糖的糖苷键被氧化断裂的同时，常伴随有氨基的脱除和羧基的形成，因而还原端残基的结构发生了变化[19]，从而增加了控制降解副反应及降解产物分离纯化的难度。

氧化降解法通常是由氧化剂分解生成自由基，然后与壳聚糖作用，导致降解。因此氧化降解的速度较快，反应所需时间短，但由于自由基的作用，常发生副反

应，生成深色产物，这是氧化降解存在的主要问题。 2.4.2 物理降解法

除了可以用化学降解法制备低聚壳聚糖以外，还可以用一些物理方法，如热降解、辐射降解、光降解、超声波降解和微波降解法等。重点介绍后两种方法。 2.4.2.1 超声波降解

超声波对壳聚糖的降解作用是十分明显的。选用适当频率和功率的超声波照射壳聚糖，能有效地将大分子链打断。Tao 等[20]用 20KHZ 的超声波降解壳聚糖，研究了其降解机理和工艺参数的影响。研究结果表明，在壳聚糖分子中，四种糖苷键 GlcN-GlcN，GlcNAc-GlcN，GlcN-GlcNAc 和 GlcNAc-GlcNAc 的分布是未知的，因此断裂的准确位置不能确定，实验数据也符合糖苷键是任意断裂的模式，此外，还发现高分子量的壳聚糖相对于低分子量的壳聚糖，用超声降解更为有效。脱乙酰度为 67.5%，69.7%，79.8%的壳聚糖的降解速率相似，然而脱乙酰度为 90.9%的壳聚糖的降解速率系数要高2-3个数量级，这是因为高脱乙酰度的壳聚糖分子更为舒展，对剪切力更为敏感。 2.4.2.2 微波降解

微波降解法降解壳聚糖可使甲壳素脱乙酰化反应与壳聚糖降解反应同时进行，减少了甲壳素脱乙酰化过程的碱用量，缩短了反应周期，可有效降低成本[21] ，而且可通过改进工艺技术实现对环境无污染绿色生产[22]。Ronge 等[23]研究了在微波环境下，无机盐对于壳聚糖降解的影响。结果表明，只要改变反应时间或辐照功率，可以得到大范围的不同分子量产物。在微波辐照下，添加一些无机盐可以有效地提高壳聚糖降解速率，而且，没有影响到低聚壳聚糖的吡喃环。用微波辐射壳聚糖，其降解产物的分子量，比用传统加热方法制备的降解产物的分子量低。

2.4.3 酶降解法

酶法降解壳聚糖，就是用特定的酶对壳聚糖进行降解，它可以选择性地切断壳聚糖分子中的 β-（1→4）糖苷键，从而制得特定分子量的低聚壳聚糖，克服了化学降解产物分子量分布宽、均一性差的缺点，是一种较为理想的降解方法。目前，已发现有几十种酶能用于壳聚糖的降解。酶降解法可分为专一性酶降解法和非专一性酶降解法。

2.4.3.1 专一性酶降解法

专一性酶主要是指甲壳素酶和壳聚糖酶。甲壳素酶广泛分布于细菌、真菌、放线菌等多种微生物及植物组织和动物的消化系统中[24]。甲壳素酶降解甲壳 素的途径为：先由降解酶系统水解甲壳素的糖苷键，如外切酶从甲壳素分子链的非还原端开始，以甲壳二糖为单位，依次酶解；内切酶则随机水解糖苷键；由外切酶水解成的甲壳二糖，被 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶水解成单糖，有些 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶也有较弱的外切酶活性，也是从甲壳素的非还原端开始直接水解成单糖。壳聚糖酶主要存在于真菌细胞中，根据作用模型可分为外切型和内切型两种，内切型壳聚糖酶以释放二聚体、三聚体或低聚糖为主，外切型则从壳聚糖的非还原末端产生单糖残基-氨基葡萄糖[25]。 2.4.3.2 非专一性酶降解法

壳聚糖酶虽然对降解壳聚糖具有特异选择性，但目前仍不能大量生产壳聚糖酶，商业中壳聚糖酶的价格昂贵，故有必要探讨一些已大批量生产的工业化用酶对壳聚糖的水解特性。迄今为止，已发现 37 种各类水解酶，如：蛋白酶、脂肪酶、糖苷酶等都对壳聚糖有降解效果。从各类酶的作用效果及酶的来源分析，如此广泛的酶似乎不存在共同的催化基团，其具体的降解机理尚未能得到合理的解释。但它们的降解反应存在几个共同特点:水解最适 pH 值为 3.0 - 5.0;水解初期以内切酶作用为主，溶液粘度迅速下降;N 一乙酰化度对其酶活性有影响，随着脱乙酰化程度的提高，酶的水解活性增强，以水溶性低聚壳聚糖为底物时，酶活性为最高;反应不遵守米氏方程[26]，无论是提高酶的质量分数还是底物的质量分数都可以提高反应速度;反应速度快，是生产寡糖的一条较好途径。 2.4.4 联合降解法

单一降解法各具优势，但又存在各自的问题.所谓联合降解就是以上各种降解方法的组合使用，它的出现使低聚壳聚糖的制备进入了一个新的阶段。Wang 等[27]在壳聚糖溶液中加入双氧水，然后用低压水银灯发出的 254nm 紫外光照射溶液 30min，发现紫外光对双氧水降解壳聚糖具有协同作用。Wu 等[28]发现超声波对臭氧降解壳聚糖具有协同作用。可见，随着低聚壳聚糖制备研究的深入，将会出现更多的、更实用的联合降解工艺。 2.4.5 真菌提取法

除了可以用上述各种方法降解壳聚糖制备低聚壳聚糖以外，也可以从真菌体中直接提取低聚壳聚糖。Wang 等[29]以马铃薯片、棉籽皮、豆渣、玉米渣为底物进行固态发酵，然后将含低聚壳聚糖的蓝色犁头霉菌丝段从上述底物中分离，结果表明1-1.5×4-7cm 马铃薯片和棉籽皮上的菌丝段较之其他底物容易分离。而且 , 提取的低聚壳聚糖的产量最高，达到 2.34g/kg 底物。

从真菌提取具有易操作、易控制制备高质量壳聚糖的优点，而且用不同的菌株在不同的环境和营养条件下可以制备不同分子量的低聚壳聚糖，在提取过程中减少了由于使用酸碱所带来的环境污染，是直接制备低聚壳聚糖的一种新的绿色工艺。

2.5 低聚壳聚糖的分离纯化

不同分子量的低聚壳聚糖生理活性差异很大，降解产物一般为混合物，甚至产物聚合度跨度很大，这就需要分离纯化产物，以便得到所需分子量的聚合物。通常分离纯化方法包括调节体系的pH值、过滤(或离心)、真空(或冷冻)干燥、脱色和重结晶等。

离子交换色谱法是应用较广的分离纯化低聚壳聚糖的方法。曾嘉、郑连英[30]采用此方法得到了聚合度为2-9的壳寡糖。高压液相色谱(HPLC)法也是分离和纯化甲壳低聚糖的有效方法，但价格昂贵，分离纯化速度慢。

以上两种方法均要引入其他试剂，对产物的质量造成影响。近年来分离膜成为分离纯化低聚壳聚糖的新型技术方法。韩永萍、林强[31]采用纤维素酶催化降解结合膜法制备低聚壳聚糖，可以获得分子量在5000左右的优质壳聚糖产品。杜昱光、张铭俊等[32]设计了降解反应与膜分离技术相耦合方法，耦合技术的引进实现了反应与分离一体化和过程的连续操作，提高了酶的利用率，有利于工业化生产。

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