髓过氧化物酶
更新时间:2023-10-01 16:23:01 阅读量: 综合文库 文档下载
髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)又称过氧化物酶,是一种重要的含铁溶酶体,存在于髓系细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中,是髓细胞的特异性标志,随着对MPO研究的深入,人们发现MPO基因多态性导致个体对一些疾病易感性的差异,与人类多种疾病的发生、发展密切相关,因此越来越受到国内外学者的重视。 髓过氧化物酶MPO研究
1.MPO的结构髓过氧化物酶(MPO)是由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶,是血红素过氧化物酶超家族成员之一。MPO是I相代谢酶。每个酶分子有两个铁素基团,顺磁共振波谱表明血红素中的铁是在甲酰基血红素部分。MPO的合成是粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并贮存于嗜天青颗粒内,外界刺激可导致中性粒细胞聚集,释放髓过氧化物酶(MPO)。在成熟的粒细胞中,MPO是含量最丰富的糖蛋白,约占外周血多形核中性粒细胞(PMNs)内总蛋白质含量的5%,血液中95%的MPO来源于PMNs。MPO的相对分子质量为150×103,是由2个亚单位聚合而成的二聚体,每个亚单位又由一条重链(α链,相对分子质量约60×103)和一条轻链(β链,相对分子质量约15×103)所构成。2个亚单位在α链处由1个二硫键相连。重链具有亚铁卟啉基团,说明MPO是铁依赖性的。MPO以3种亚形存在于髓系细胞中,分别为MPOⅠ、Ⅱ、Ⅲ。3种亚型主要是重链有差异,轻链的差异较小,导致它们在相对分子质量及疏水性等方面不同,3种亚型在功能上的差异还不明确,有待进一步研究。 2.MPO基因及其多态性人髓过氧化物酶基因位于染色体17q23?q24,含有12个外显子和11个内含子,长约14 638 bp,调控其基因表达的是生长因子。MPO的mRNA在早幼粒细胞的表达水平最高,其次是原始粒细胞、幼稚和原始单核细胞;当细胞分化到成熟时期,MPO基因表达水平迅速下降。现已知MPO基因首先表达的是一条相对分子质量为89×103的前体蛋白(precursor protein),经过翻译后加工,切割成α和β两种亚基,再聚合为成熟的MPO分子,加上糖链,最后形成有功能的MPO。MPO在基因表达过程中存在的缺陷,造成MPO基因DNA序列发生改变,影响其活力。MPO基因的多态性影响其基因的转录和表达,对机体的疾病易感性有一定的影响。Chevrier 等发现了外显子11处和启动子区域的V53F、A332V、I642L和IVS11? 2A→C4个新的基因多态性位点,它们的作用与功能需要进一步研究。Piedrafita 等研究发现与疾病有关的位点有5个:463G/A,R569W,Y173C,M251T和外显子9的碱基缺失。目前研究最多的是MPO基因启动子区第463位核苷酸G/A的突变,该位点位于SP1转录因子识别结合的顺式作用元件中,内含4个Alu重复序列。G/A的突变导致位于Alu反应元件的SP1转录因子结合位点消失,从而使MPO转录水平显著下降。也有报道发现外显子10的密码子569存在C被T替代,使CGG→TGG,导致遗传性MPO缺陷性疾
病。还有研究报道在MPO基因129位点存在G被A取代,使MPO基因的表达水平显著降低。另外,据有关文献报道,MPO基因463A等位基因与一些癌症的风险降低相关。
3.MPO的生物学作用MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志,其水平及活性变化代表着嗜中性多形核白细胞(PMN)的功能和活性状态。纯化的人MPO活性为25~35 IU/mg,水溶性好,底物H2O2浓度>0.8 mmol时酶受抑制,酶反应最佳pH为4.5~5.5,当pH≥10,或≤2时酶失活。MPO的主要功能是在吞噬细胞内杀灭微生物,利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐,并形成具有氧化能力的自由基。构成MPO–H2O2–卤素系统。许多研究发现,MPO不仅能杀灭吞噬于细胞内的微生物,而且可释放到细胞外,破坏多种靶物质,如肿瘤细胞、血小板、NK细胞、原虫、毒素等,对机体产生和调节炎症反应等多方面发挥作用。然而,在特定条件下,MPO催化反应生成过量的氧化剂(HOCl、3–氯化酪氨酸、酪氨酰基、硝基酪氨酸等),超过局部抗氧化剂的防御反应时,就会导致氧化应激和氧化性组织损伤。MPO还参与调节炎症反应的许多过程,MPO缺陷的中性粒细胞因过量的注入炎症部位而发生氧化反应,大量的超氧化物和氧化物形成,造成炎症部位组织细胞损伤。此外还有学者发现MPO能与DNA牢固结合形成复合物,有效保护DNA防止其在氧化过程中受损,从而保证髓系细胞的正常分化成熟及功能。 编辑本段髓过氧化物酶(MPO)与相关疾病 1.MPO与心血管疾病
1.1MPO与冠状动脉疾病。冠心病是心血管系统中最常见的疾病,而动脉粥样硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基础。AS发病过程中通常出现氧化低密度脂蛋白,进而巨噬细胞吞噬脂质变成泡沫细胞,泡沫细胞的形成在AS的发生机制中起关键作用。研究发现MPO有促进AS病变形成的作用,MPO通过产生自由基和多种反应性物质,促进斑块形成和不稳定性增加,加速AS进展,进而引起多种并发症如急性冠脉综合征(ACS)。研究发现,MPO缺陷的个体罹患心血管疾病的危险性明显下降。MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关,还可以预测早期患心肌梗死的危险性。 1.2MPO与急性冠脉综合征(ACS).MPO促进ACS病变形成,并影响粥样斑块的稳定性,通过增大氧化应激而引起ACS。目前的研究表明,MPO是预测ACS患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子,特别是在肌钙蛋白T(TnT)水平较低的患者,MPO能够识别那些将来发生心血管事件危险性较高的患者。 2.MPO与肿瘤
2.1MPO与肺癌在肺部受微生物侵袭、职业暴露以及吸烟时,MPO会随中性粒细胞的聚集释放到炎症部位。MPO可代谢激活多种与肺癌有关的环境致癌物,能将前致癌物如多环芳烃类的苯并芘(BaP)转化成具有高度反应性和致癌性的活性产物二醇环氧化苯并芘(BPDE),BPDE能与DNA形成加合物并导致姐妹染色体互换,从而导致肺癌。
2.2MPO与白血病白血病是累及造血干细胞的造血系统恶性肿瘤,其病因尚不完全清楚。 3.MPO与地方性砷中毒
3.1近年来,随着分子生物学领域的不断发展,发现MPO在砷中毒所致皮肤病变的发生发展中起着重要作用。MPO目前被研究者认为可能是砷中毒新发现的一种易感标志物,将在慢性砷中毒的早期诊断和危险评估中具有重要的意义,但国内就这方面的研究还没有涉及到,国外对其深入的影响机制的研究也不是很多,因此还很难在现有的研究基础上建立起砷中毒易感性与MPO及其多态性的明确关系,还需要进一步的研究证实。 4.MPO与其他疾病
4.1MPO在现阶段的研究也确定了它在疾病早期诊断与危险评估中具有重要的意义。MPO通过不同的途径可导致某些疾病,同时其基因多态性也会降低机体对某些疾病的易感受性,从而对机体产生保护作用,但其作用机制仍不清楚,随着分子生物学领域的不断发展,MPO的作用机制研究将不断深入,可能会发现其他一些与疾病易感性有关的多态性位点,从而使人们更清楚的认识其相关疾病的发生、发展,以便对这些人群采取有效的预防和治疗措施
髓过氧化物酶 myeloperoxidase
过氧化物酶含血红素辅基,主要存在于过氧化酶体,利用H2O2以氧化酚类及胺类化合物。...动物的肝、肾中只有微弱的活性,在牛乳中已分离出过氧化物酶,在白细胞中含有髓性过氧化物酶,这就是脓具有过氧化物酶活性的原因。红细胞也含过氧化物酶,极少量 ...
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探讨颈动脉粥样斑块超声造影显像特征及血浆髓过氧化物酶水平与脑梗死的关系
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光化学法诱导小鼠局灶性脑梗死肿瘤坏死因子α表达及髓过氧化物酶活性的变化
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人髓过氧化物酶(MPO)ELISA 检测试剂盒
本试剂仅供研究使用
试验原理:
MPO试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知MPO浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将MPO物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物A、B,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中MPO的活性浓度呈比例关系。
试剂盒内容及其配制 试剂盒成份(2-8℃保存) 96/48份酶标板 塑料膜板盖 标准品:400ng/ml 空白对照 标准品稀释缓冲液 生物素标记的MPO抗体 亲和链酶素-HRP 洗涤缓冲液 底物A 底物B 终止液 自备材料 1. 蒸馏水。
2. 加样器:5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。 3. 振荡器及磁力搅拌器等。 安全性
1. 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。 2. 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。 3. 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
操作注意事项
1. 试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。 2. 实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
3. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4. 使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器。 5. 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。 6. 洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7. 底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8. 加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。 9. 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
96孔配置 1块板(96T) 1块 1瓶(0.6ml) 1瓶(1.0ml) 1瓶(5ml) 1瓶(6ml) 1瓶(10ml) 1瓶(20ml) 1瓶(6.0ml) 1瓶(6.0ml) 1瓶(6.0ml) 48孔配置 半块板(48T) 半块 1瓶(0.3ml) 1瓶(0.5ml) 1瓶(2.5ml) 1瓶(3.0ml) 1瓶(5.0ml) 1瓶(10ml) 1瓶(3.0ml) 1瓶(3.0ml) 1瓶(3.0ml) 配制 即用型 即用型 按说明书进行稀稀 即用型 即用型 即用型 即用型 按说明书进行稀释 即用型 即用型 即用型 样品收集、处理及保存方法
1、 血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2、 血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。 3、 细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4、 保存------如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70 ℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
试剂的准备
1. 标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行: 400ng/ml 200ng/ml 100ng/ml 50ng/ml 25ng/ml 12.5ng/ml 0ng/ml
2. 洗涤缓冲液(50×)的稀释:蒸馏水50倍稀释。 操作步骤
1. 使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。
2. 根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。
3. 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育1小时。
4. 甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
5. 每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。
6. 甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育10分钟。避免光照。 8. 取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。 9. 在450nm波长处测定各孔的OD值。 性能
1. 灵敏度:最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2. 特异性:不与人其它细胞因子反应。 3. 重复性:板内、板间变异系数均小于10%。
4.局限性:6号标准品以上的结果为非线性的,根据此标准曲线无法得到精确的结果。
(6号标准品) (5号标准品) (4号标准品) (3号标准品) (2号标准品) (1号标准品) (空白对照) 原倍浓度不用稀释直接加入50ul。 100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液 100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液 100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液 100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液 100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液 原始浓度不用稀释直接加入50ul。
结果 判 断 与 分 析
1、仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的MPO标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线,样品的MPO含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
3、检测值范围:0-400ng/ml
4、敏感度:
1.0ng/ml
1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。 2. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。 4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。 5. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性。 洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。 注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。 4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高,请先稀释后再测定,计算时请最后乘以稀释倍数。 6. 在配制标准品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。 7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
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