中药王不留行主要成分对小鼠乳腺上皮细胞功能的影响

中药王不留行主要成分对小鼠乳腺上皮细胞功能的影响

中药王不留行主要成分对小鼠乳腺上皮细胞

功能的影响

秦君，高学军*

东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨（150030）

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摘 要：传统中药王不留行具有行血通经，催生下乳，消肿敛疮等功效，广泛应用于我国奶牛业饲料添加剂中。其主要成分为多种皂甙类、黄酮甙类、香豆素类、生物碱类等成分。 本文采用溶剂萃取法与酸碱法对王不留行三类主要成分（皂甙类、黄酮甙类及香豆素类）进行提取，并用化学方法及薄层层析方法予以鉴定。将三种成分分别以不同浓度添加入细胞培养液，采用MTT法检测这三类成分对体外培养的小白鼠乳腺上皮细胞增殖的作用，运用荧光定量RT-PCR方法对细胞中β-酪蛋白的表达进行检测，并对其机理进行了初步研究，用激光共聚焦显微技术对细胞周期蛋白cyclin D1和细胞信号通路中磷酸化stat5因子的表达进行检测，最后通过动物实验进一步验证了其有效成分的作用。

实验结果表明：（1）王不留行皂甙类成分对小鼠乳腺上皮细胞的增殖有明显的抑制作用（P＜0.05），此类成分对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达无明显作用（2）王不留行香豆素类成分对小鼠乳腺上皮细胞的增殖和β-酪蛋白的表达均无明显作用（3）王不留行黄酮甙类成分是王不留行有效成分之一，具有促进泌乳的作用，它通过诱导周期蛋白cyclin D1的表达而促进小鼠乳腺上皮细胞的增殖，并通过激活Jak-stat5信号通路诱导β-酪蛋白基因的表达。

关键词：王不留行；皂甙；黄酮甙；香豆素；乳腺上皮细胞；功能

中图分类号：Q956

1. 引言

我国奶牛业普遍存在产乳量低、奶牛发病率高等缺点。用抗生素及一些化学合成物作为饲料添加剂来防治奶牛疾病、提高奶牛生产性能具有毒副作用大、残留高，易产生抗、耐药性和致畸、致癌、致突变等弊端，严重危害了人体健康。中药以其源自天然，具有毒副作用小、无残留、不易产生耐药性的优点，已广泛应用于我国奶牛业。

王不留行系石竹科麦蓝菜Vaccaria segetalis（Neck）Garcke 的种子，为传统常用中药，有行血通经，催生下乳，消肿敛疮等功效，疗效显著。其植物资源丰富，除华南外，全国各地区都有分布，以河北产量为最大。王不留行的主要功能是催乳，《本草纲目》有“穿山甲、王不留，妇人服了乳长流”的说法。除具有催乳功能外，王不留行还可以治疗痛经、闭经、乳痈肿痛；也可治疗小便不利、淋沥涩痛以及带状疱疹等。王不留行含多种皂甙、黄酮甙、香豆素以及生物碱类化合物。 桑圣民等报道从王不留行的乙醇提取物中分离得到27个化合物[1-9]，张荣平等从王不留行中分离并鉴定了4个环肽化合物[10]，鲁静等从王不留行中分离鉴定了刺桐碱和异肥皂草苷[11]。

本试验对中药王不留行皂甙类成分、黄酮甙类成分以及香豆素类成分进行提取与鉴定，并以不同浓度添加进细胞培养液，运用MTT法、荧光定量RT-PCR方法、激光共聚焦显微技术等方法检测中药王不留行的三种成分对小鼠乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白表达的影响，并对其机理进行研究，最后通过动物试验验证有效成分的作用。

中药王不留行主要成分对小鼠乳腺上皮细胞功能的影响

2. 材料与方法

2.1 试验材料

GF-M2000型酶标仪（山东高密彩虹仪器公司）、ABI Prism®7300实时荧光定量PCR仪（美国ABI）、TC SP2 AOBS激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica公司 ）、X50-S8F2倒置显微镜（奥林巴斯公司）；CO-150 CO2培养箱（New Brunswick Scientific公司）。

昆明种远交系小白鼠：3个月左右大，分娩后3~6d。购自哈尔滨医科大学。

DMEM培养基（Gibco）、M199培养基（Sigma）、优级胎牛血清（中国医学科学院生物工程研究所）、Ⅰ型胶原酶（Invitrogen）、透明质酸酶（sigma）、MTT（Amresco）、DEPC（Amresco）、牛血清白蛋白（Sigma）、免疫荧光染色试剂盒－抗兔Cy2（碧云天）、胰岛素（Sigma）、催乳素（Sigma）等。

2.2 试验方法

2.2.1 中药王不留行主要成分的提取与鉴定

试验方法参见文献[12]。

2.2.2 三种成分对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响

2.2.2.1 小鼠乳腺上皮细胞的体外培养

（1）取分娩后3~6天小白鼠断脊柱处死，75%乙醇消毒全身后置蜡板上，用大头针固定四肢，沿正中线剪开皮肤，切下左右乳腺组织，剪成组织小块。（2）放入消化液，37℃消化1.5h，将消化液过滤，离心，得到细胞。（3）用20% FCS的生长液悬浮，再将悬浮液离心以清洗细胞，洗3遍后，以1×105/ml的细胞密度置入培养瓶培养。

2.2.2.2 乳腺上皮细胞的鉴定

①形态学鉴定：将贴壁后细胞于200×倒置显微镜下观察。

②角蛋白-18鉴定：将贴壁后的乳腺上皮细胞进行角蛋白-18的免疫荧光染色，激光共聚焦显微镜观察。

2.2.2.3 MTT法检测细胞增殖活力

对体外培养的细胞接种于96孔培养板，每孔100ul细胞生长液，并分别加入三种成分至终浓度分别为20、50、100、200mg/L。用MTT法检测细胞增殖活力。

2.2.2.4 黄酮甙类成分对cyclin D1表达的影响

试验组在细胞生长液中添加100mg/L黄酮甙类成分，体外培养小鼠乳腺上皮细胞12h；对照组正常培养12h。离心收集细胞，进行cyclin D1的免疫荧光染色，于激光共聚焦显微镜观察。

2.2.3 三种成分对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响

2.2.3.1 提取细胞总RNA并反转录生成cDNA

分别将三种成分以50mg/L的浓度加入体外培养的小鼠乳腺上皮细胞，体外培养12h，用Trizol试剂抽提细胞中的总RNA。取2µg RNA进行反转录。

2.2.3.2 荧光定量PCR检测β-酪蛋白的表达

β-酪蛋白基因上游引物：TCACTCCAGCATCCAGTCACA，下游引物：GGCCCAAGAGA TGGCACCA，扩增片段大小为126bp。内参照GAPDH基因上游引物：ACTCCCACTCTTCCA

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CCTTC，下游引物：TCTTGCTCAGTGTCCTTGC，扩增片段大小为185bp。

2.2.3.3 黄酮甙类成分对磷酸化stat5因子表达的影响

试验组在细胞生长液中添加50mg/L黄酮甙类成分，体外培养小鼠乳腺上皮细胞12h；对照组正常培养12h，离心收集细胞，进行磷酸化stat5因子的免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察。

2.2.4 动物试验

将王不留行黄酮甙类成分溶于生理盐水中，终浓度为1mg/ml，过滤除菌，4℃ 保存。取分娩后母鼠10只，自分娩当天起将每窝仔鼠调整为8只。于泌乳7d后每日同一时间将母鼠与仔鼠分离6h，用天平称全窝仔鼠重量，然后将仔鼠送回母鼠身边哺乳，吸吮2h后再次称仔鼠窝重，两次窝重之差即为8h泌乳量，每天测量一次，连续测量3d，将3d测得的8h泌乳量相加即得泌乳总量。第四天起按照10ml/kg体重皮下注射制备的注射液，连续注射3d，采用相同方法测得3d泌乳总量。

3. 结果与分析

3.1 三种成分对小鼠乳腺上皮细胞增殖的影响

3.1.1 小鼠乳腺上皮细胞的鉴定

贴壁后细胞呈现多角型，为典型的上皮细胞特性，见图1-a）。由图1-b）可见，试验所培养的乳腺上皮细胞均有较强的角蛋白-18表达，符合乳腺上皮细胞特性，

a）贴壁后的小鼠乳腺上皮细胞（200×） b）小鼠乳腺上皮细胞角蛋白的表达（200×）

图1 小鼠乳腺上皮细胞的鉴定

Fig1 Identification of mammary endothelial cell

3.1.2 MTT法检测细胞增殖活力

表1 王不留行三种成分的MTT法结果 Tab1 The result of MTT for three components

浓

（mg/L) 度 皂甙类成分 吸光值（平均值±标准差） 黄酮甙类成分 香豆素类成分

0 0.4622±0.0144a 0.4785±0.0157a 0.4477±0.0204a

20 0.4483±0.0074a 0.5002±0.0167b 0.4365±0.0037a

50 0.4222±0.0158b 0.5010±0.0060b 0.445±0.0165a

100 0.3562±0.0091c 0.5152±0.0054b 0.442±0.0099a

200 0.3260±0.0073d 0.5433±0.0057c 0.434±0.0062a

注：同一列数字右侧不同小写字母间表示差异显著（P＜0.05）

NOTE：Different letters means that the difference is significant compared with contrast at the 0 .05 level

中药王不留行主要成分对小鼠乳腺上皮细胞功能的影响

由表1可知：（1）皂甙类成分中（除20 mg/L），处理组与对照组差异显著（P＜0.05），表明王不留行皂甙类成分有抑制小鼠乳腺上皮细胞增殖的作用。（2）黄酮甙类成分中，处理组与对照组差异显著，表明王不留行黄酮甙类成分具有促进小鼠乳腺上皮细胞增殖的作用。（3）香豆素类成分中，处理组与对照组间差异不显著（P＞0.05），表明王不留行香豆素类成分对小鼠乳腺上皮细胞的增殖没有作用。

3.1.3 黄酮甙类成分对cyclin D1表达的影响

试验结果见图2。

a） 对照组 b） 黄酮甙组 c） 阴性对照

图2 小鼠乳腺上皮细胞cyclin D1的表达

Fig2 Expression of cyclin D1 in cultured mouse mammary epithelial cells

试验组与对照组分别取10个视野，cyclin D1表达的荧光强度用Image Pro 5.0 Plus软件进行分析，用每个视野的平均光密度值表示cyclin D1的表达强度，除以每个视野的细胞个数，即为平均每个细胞的表达量。分析结果见表2。由表可见，实验组与对照组差异显著，表明王不留行黄酮甙类成分能促进cyclin D1的表达。

表2 黄酮甙类成分对cyclin D1表达的影响

Tab.2 Effect of flavonoid glycoside on expression of cyclin D1

组别

对照组 实验组 平均每个细胞cyclin D1表达量 16.8350±2.4921 22.4770±1.7165

注：*表示两组数据间差异显著（P＜0.05）

NOTE：*means that difference is significant compared with contrast at the 0 .05 level.

3.2 三种成分对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响

3.2.1 荧光定量PCR检测β-酪蛋白的表达

本试验采用相对定量的方法，2-△Ct为目的基因的相对表达量，试验结果见表3。由表可见，黄酮甙组与空白组差异显著，表明王不留行黄酮甙类成分能促进β-酪蛋白的表达。

表3 王不留行三种成分对β-酪蛋白的表达的影响

Tab3 The effect of three components on the expression of β-casein

组别

空白组 皂甙组

黄酮甙组

香豆素组 β-酪蛋白的表达量 1.3714±0.0156 1.8327±0.0175* 1.3681±0.0227

注：*表示两组数据间差异显著（P＜0.05）

NOTE：*means that difference is significant compared with contrast at the 0 .05 level.

中药王不留行主要成分对小鼠乳腺上皮细胞功能的影响

3.2.2 黄酮甙类成分对磷酸化stat5因子表达的影响

试验结果见图3。

a）对照组 b） 黄酮甙组 c）阴性对照

图3 小鼠乳腺上皮细胞磷酸化stat5的表达

Fig3 Expression of phosphatic stat5 in cultured mouse mammary epithelial cells

分析方法参见3.1.3。结果见表4。由表可见，试验组与对照组差异显著，表明王不留行黄酮甙类成分能促进磷酸化stat5因子的表达

表4 黄酮甙类成分对磷酸化stat5因子表达的影响

Tab4 Effect of flavonoid glycoside on expression of cyclin D1

对照组 实验组 平均每个细胞磷酸化stat5的表达量 25.5693±2.2152*

注：*表示两组数据间差异显著（P＜0.05）

NOTE：*means that difference is significant compared with contrast at the 0 .05 level.

3.3 动物试验

结果表明，用药后母鼠3d总泌乳量明显高于用药前3d总泌乳量（P＜0.05），说明王不留行黄酮甙类成分能增加小鼠乳汁分泌量，结果见表5。

表5 黄酮甙类成分对小鼠泌乳量的影响

Tab.5 The effect of flavonoid glycoside on the lactating of mouse

组别

用药前

用药后 母鼠数量（只）剂量（ml/kg） 总泌乳量（g） 10 10 5.4674±0.1362 10 10 5.8433±0.1892*

注：*表示两组数据间差异显著（P＜0.05）

NOTE: *means that difference is significant compared with contrast at the 0.05 level.

4. 结论

4.1 研究结果表明，王不留行皂甙类成分对小鼠乳腺上皮细胞的增殖有明显的抑制作用，并随浓度的增加而抑制作用增强，此类成分对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达无明显作用。

4.2研究结果表明，王不留行黄酮甙类成分是王不留行有效成分之一，具有促进泌乳的作用，它通过诱导周期蛋白cyclin D1的表达而促进小鼠乳腺上皮细胞的增殖，并通过激活Jak-stat5信号通路诱导β-酪蛋白基因的表达。

4.3 研究结果表明，王不留行香豆素类成分对小鼠乳腺上皮细胞的增殖和β-酪蛋白的表达均无明显作用。

中药王不留行主要成分对小鼠乳腺上皮细胞功能的影响

参考文献

[1] 桑圣民，夏增华，毛士龙，劳爱娜等.中药王不留行中黄酮甙类成分研究.中国中药杂志，2000，25（4）：221-222.

[2] 桑圣民，劳爱娜，王洪诚等.中药王不留行化学成分的研究.天然产物研究与开发，1998， 10（4）：1-3.

[3] 桑圣民，劳爱娜，王洪诚等.中药王不留行化学成分研究（Ⅱ）.中草药，2000，31（3）： 169-170.

[4] 桑圣民，毛士龙，劳爱娜等.中药王不留行化学成分研究（Ⅲ）.天然药物化学，2000，12（3）：12-15.

[5] Sang Shengmin，LaoAina，Wang Hongcheng et al. A Phenylpropanoid Glycoside from Vaccaria segetalis. Phytochemistry，1998，48（3）：569-571.

[6] Sang Shengmin，LaoAina，Wang Hongcheng et al. Triterpenoid Saponins from Vaccaria segetalis. Natural Product Sciences，1998，4（4）：268-270.

[7] Sang Shengmin LaoAina，Wang Hongcheng et al. Triterpenoid Saponins from Vaccaria segetalis. Journal of Asian Natural Products Research，1999，1（3）：199-201.

[8] Sang Shengmin，Eou Minliang，Lao Aina et al. A New Triterpenoid Saponin from Vaccaria Aegetalis. Chin Chem Lett，2000，11（1）：49-52.

[9] Sang Shengmin，LaoAina，Wang Hongcheng et al. Three New Triterpenoid Saponin from the seeds of Vaccaria segetalis. J Asi Nat Prod Res，2000，2（1）：26-28.

[10] 张荣平，邹澄，谭宁华等.王不留行环肽研究.云南植物研究，1998，20（1）：105-112.

[11] 鲁静，林一星，马双成.中药王不留行中刺桐碱和异肥皂草苷分离鉴定和测定.药物分析杂志，1998，18

（3）：163-165.

[12] 秦君，高学军，彭科峰. 中药王不留行三种成分的提取与鉴定. 中国科技论文在线，200609-443（http://www.77cn.com.cn/）.

Effect of Three Components from Semen Vaccariae on the

Function of Mouse Mammary Epithelial Cell in Vitro

Qin Jun, Gao Xuejun*

Key Laboratory of Dairy Science Ministry of Education, Northeast Agricultural University,

Harbin（150030）

Abstract

The Chinese traditional medicine Semen Vaccariae applied widely in milk cows breeding of our country as additive. It has the function of unblocking blood vessel, inducing lactating, detumescence an dwindling scar and so on. Its main components are saponin, flavonoid glycoside and coumarin.

This test studied both the extracting methods of three main components from Semen Vaccariae—saponin, flavonoid glycoside and coumarin and the identification using chemic methods and chromatogram methods. Add these components to cell cultural medium with several concentration. Then detect their effects on multiplication of mouse mammary epithelial cells using the mothod MTT and the expression of beta-casein of mouse mammary epithelial cells using Real-time PCR. Furthermore, this test put up pilot study of their mechanism. We detected the expression of cyclin D1 and phosphatic stat5 using laser scanning confocal microscope. Finally, the function of the effective component was validated through animal experiment. The result indicated that the components of saponin could restrain the multiplication of mouse mammary epithelial cells（P＜0.05）, which had no influence on the expression of beta-casein（P＞0.05）. The components of coumarin had no influence on both the multiplication of mouse mammary epithelial cells and the expression of beta-casein（P＞0.05）. The components of flavonoid glycoside are one of the effective components, which could increase the lactating of mouse. They could promote the multiplication of mouse mammary epithelial cells by activating the expression of cyclin D1 and regulate the expression of beta-casein by activating Jak-stat5.

Keywords: Semen Vaccariae, saponin, flavonoid glycoside, coumarin, mammary epithelial cells, function

本文来源：https://www.bwwdw.com/article/avai.html