原位杂交实验问题收集

胚胎原位杂交技术

1通过分析mRNA在不同发育时期组织中的表达变化，有助于了解胚胎发育的基因调控机制。原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法，在发育生物学研究中起重要作用。胚胎原位杂交包括全胚胎原位杂交和胚胎组织切片原位杂交。

全胚胎原位杂交技术(whole mount in situ hybridization)可以从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序，是一种广泛应用于胚胎发育调控基因表达研究的技术。该技术实验步骤少，简单易行，大量减少了分析所需时间。

全胚胎原位杂交成功的关键因素是进行适当的蛋白酶

K处理。使用不同探针时，应摸索

不同的蛋白酶K浓度、处理时间和温度。

全胚胎原位杂交实验中。经常会出现背景信号太强或信噪比太低的情况。产生这些情况的原因，通常是由于探针或抗体滞留于胚胎体腔和体室以及杂交后漂洗的条件不够严格等。杂交预处理前，将胚胎在解剖镜下用细针在脑室、颈背部、颌面部和心室等处刺孔，以使反应后的探针或抗体不在这些部位滞留。并在漂洗时充分洗除。同时。杂交后使用RNA酶充分消化未杂交的标记RNA探针，提高杂交后漂洗的严格度，抗体反应后充分漂洗均能降低背景信号，提高信噪比。

对较大的胚胎标本来讲，探针很难穿透整个组织．因此需切成切片后进行杂交即胚胎组织切片原位杂交，以克服全胚胎原位杂交方法中探针不能渗入到胚胎深部的问题。

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。

我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原

位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。

问题集锦

1小木虫提问：我做的是RNA原位杂交的，用的24hpf的鱼，做了2次，最后显色的时候发现胚胎都碎了，求助各位高人这是由哪些原因引起的，有点纠结啊，谢谢大家指点啊。 蛋白酶消化时间短一点，浓度放低点试试 ----我用的蛋白酶浓度是10ug/ml，处理了3分钟 不知道有没有问题

2我做斑马鱼的原位杂交。pcr能够拉出基因，但是设探针以后却怎么也不能杂交显出信号。 我自己分析有三方面的原因， 一是探针合成不好，但是我重新合成的探针还是不能杂交出信号。而且我以前合成的探针能够杂交出信号。

二是表达丰度不够，不能够被原位杂交探测到，却因为pcr的灵敏度高而检测到。 三是实验技术和试剂不行，但是我用myod探针平行实验能够杂交出信号。

回答1看到你说的第二个原因，可以确定你杂交的是他们的mRNA吧。。。有可能是表达丰度的原因，你可以先做个qPCR，看下基因和对照基因的表达量。。如果确定是表达量低的话，可以加大探针量试试。。或者你去找找有没有做过你这个基因的PAPER，问问作者有没有类似问题

回答2在合成探针后，你跑个PCR，确定一下合成的mRNA是不是你要的，同时根据亮度估算下浓度，这样可以估算自己要加多少量的探针。 你好，你现在的斑马鱼原位杂交做的怎么样了，我也做了好长一段时间，可是老是没有结果，现在都想放弃了！想向你请教，能加Q联系吗：9069402 谢谢！

3原位杂交的样品采集后需要用什么试剂出来一下，放到-80度中保存呢。 原位杂交要注意什么呢？

⑴保护试剂浸泡一下，采样时取成薄方片，便于切片

⑵ 1.样品固定：通常用FAA,或4%多聚甲醛，4度过夜（勿超16h）

2.系列乙醇脱水、透明、置换、渗透、石蜡包埋。-20度保存（可达1年）注意所有操作、试剂避免RNase污染。（不过我们的固定哟暗示用4%PFA的时候最好是不要4度过夜一般是4-5小时，4%多聚甲醛固定时间过长一般会残留醛基在组织中，对下一步实验造成很大的影响并且多聚甲醛固定时间过长组织变脆不利于包埋和切片）

4下面三幅图分别是文献上的结果和我自己的实验结果，想要的体节上那种点状表达一直没有做出来！各位高人，求教如下问题：

提问题之前，我先告诉高人，我的探针是从Exiqon公司买来的LNA probe，也就是特异性强的锁定核酸探针，抗体是罗氏的，显色试剂用过罗氏的，也用过博士德的，蛋白酶K也是罗氏的！

①与文献相似，我也做出来了眼睛前方鼻嗅上皮区的染色，可是文献中体节上所出现的点状

显色，我一次也没有做出来过？请问原因何在？？

②无数次实验中，只有两次我做出来很快显蓝的情况，后来每次再做要不是一点也不显色，要不就是呈现棕黄色（见最后一幅图）！请问原因何在？文献结果：

个人结果

奇怪的棕色显色

回答⑴感觉楼主的背景色很深啊？我没有做过，推测能否延长杂交后的漂洗时间，降低信噪比（背景色），突出你的结果

⑵你已经成功过，说明你所说的探针和试剂是没问题的，没有染出来很有可能是胚胎固定出现了差错，建议重新配置固定液(就是经常用的4%PFA in PBS， 我们都是有人配一大堆一起用，所以具体的我也不清楚，加热溶解，味道挺大，分装使用，不能反复冻融使用，4度

摇床固定不要时间太久，12hpf左右就可以了

)，重新固定胚胎（一个月内）一般我固定不会超过24h

⑶反义探针对照，控制系统(探针对应的序列和文献中是否相同？如不同，有时会有不同的结果)

⑷我做过小鼠胚胎的WISH，根据楼主提供的图片，提出以下几点讨论：由于体节部位较深，探针要透过表皮及肌肉等组织到达体节较到达体表组织更困难，因此我觉得应该从这方面考虑问题原因。1.样本的取样时间，斑马鱼年龄越小组织越薄，越容易显影；但是也要综合考虑目的基因的表达时间段。2.蛋白酶K 的效力及消化时间，建议新鲜配制，摸索多个消化时间。相信楼主已摸索多次了，多注意细节。3.杂交液是否是买的成品？鱼精蛋白？自己配制的效果不好。4.棕色显色可能提示消化时间不够。继续关注！------但是经过这么多次的摸索感觉不太像消化不到位的原因！

上面三幅图，都是同一个miRNA的表达情况，第一幅是文献上的结果，第二幅是我自己做出来的结果，第三幅也是（最原始的，未经去除背景处理，处理过后和第二幅的情况一样，与文献结果相似，都在斑马鱼嗅觉上有较明显的表达，但体表的神经丘却几乎没有什么表达！同样都是72h的胚胎！）

还有就是PK不可能每次新鲜配制吧，总共才25mg,如何准确称重都是个严重的问题啊，所以我配的stock solution,按0.1mg/mL放到4度，用的时候取点稀释到工作浓度（10ug/mL）! 杂交液是自己配的：按照文献和探针公司提供的protocol来配的：5×SSC，50%甲酰胺，0.1% Tween-20，50 mg/ mL heparin,500 mg/mL yeast tRNA, citric acid (460 ml of 1M citric acid solution for 50 ml of HM ) to adjust the PH to 6.0（加了相应量的citric acid solution 后从来没有测过Ph值，因为担心Ph计有酶），加DEPC水至50mL 总之先谢谢

最近文献上看到要用新鲜的4%PFA，这个关系是不是很大，感觉似乎影响较大！是不？？ 结果出来向你汇报！

今天来看突然想起，我要的那种点状表达就是在体表的表达，而不是内部的表达，所以不敢过度消化-----做WISH非常费时费力，几天下来往往没有结果，有同感。强烈建议楼主买现成的杂交液，至于哪个厂家我忘了，肯定是有的。

⑸我是做斑马鱼研究的。从胚胎时期看应该在48小时了(楼主回答是72小时的)，通透性很不好了，就是说蛋白酶K的消化时间一定要够，才能保证胚胎的通透性足够，探针进得去，没结合的探针出得来。后面几幅出现棕色染色或者表面很深染色的原因就是通透不够，探针会挂在表面，洗不掉最终造成的飞特异染色。前面几幅图的原因也是这个。希望能有用。--------这是72 h的幼鱼！之前摸索过PK的消化时间，72h的幼鱼我摸索了25min,30min,35min,40min,时间过长了组织结构就不好了！如果是这样，我再摸索下消化时间！最近文献上看到要用新鲜的4%PFA，这个关系是不是很大，感觉似乎影响较大！是不？？----

⑹不知道你之后做的结果如何。

对于你的问题，其实原位杂交的结果由于一些基因本身的原因，比如表达量比较低，探针的特异性或者存在一些不可知的调控，甚至有不同的选择性剪切本，做出来的结果不同实验室或者不同时间做出来的都会有一些出入。

① 你的结果和别人的出入，你可以再仔细看看取样的时间，以及所选探针的片段，看和别人所做的有没有区别；还有就是显色时间，如果过长，体节上比较弱的表达可能会显色出来。你也可以降低杂交温度试一试。也有可能你的探针比较特异，而别人的比较差。

② 显色棕黄的问题，我也碰到过，不过之后用酒精一脱水，就会变深蓝，不会影响最终结果。

-------文献上用的5·和3·双标的Exiqon探针，我没有钱，所以用的是5·单标的探针！这顶多会比别人染色差一点，也不至于一点染色也没有！

关于棕色染色的问题，我以前做的时候，两三个小时就开始染出了蓝色，可是后来再也做不出这样的结果了！后来我也照文献终止染色后用甲醇梯度脱水后，发现去掉了不少背景，而且也变成了蓝色！总感觉这实验不是这样做的！------不要常温显色过夜，如果这样，肯定是全黑。你可以尝试4度过夜看看。如果实在不行，你就问文献的作者要他们的探针。-----拿甲醇去除背景后是下面的情况:

⑺你的显色应该是过度了 颜色太深 了；建议开始显色时每15分钟或者10分钟观察一次。我做过斑马鱼的整体原位杂交，从48h到7天的都做过，我个人觉得这个实验很重要的一部就是蛋白酶消化，但是你的基因是在体表表达，消化时间应该掌握很短，还有只要探针没问题，其他的步骤只要按照protocol来基本上是没问题的！------探针应该没有问题，之前就用这些探针做出来过，只是现在再也做不出来了，太奇怪了！做出来那次是染色的时候可能也就２个小时就显蓝了，而现在怎么都不显色，常温过夜后，到处都是，背景很深，用甲醇洗过后才可以看部分特异的染色！而我现在根本找不到那两次能做出来的原因，更不用说做不出来的原因了！

考虑过了，首先应该不是探针的问题，其次消化的问题应该也不会太大，因为是在体表表达的东西，穿透应该很简单吧！现在唯一能想到的就是杂交的温度问题，可是我的温度与之前做出来那次温度没有差别啊！还有会不会是PFA的问题，文献都说要用新鲜的ＰＦＡ固定组织，这个关系是不是很大？-------

⑻我们实验室的protocol是显色完全后用75%的乙醇脱色，请教楼主，跟甲醇脱色有什么区别吗？那种的效果好啊？用甲醇脱色一般是多久？也需要过半小时或者一小时的去换液

吗？--------应该没有什么区别--------我就是按照protocol做的，一般都会出，主要我都是做24h之前的，比较好做吧。。但是我不会照相啊。。不会调显微镜，每次照相都很郁闷。。。照出来的照片很难看。。。-------照相比较简单，但调显微镜的确很重要！用DIC照出来的效果会漂亮很多-------小鱼不产卵。。。做的原位杂交表达的特别怪异。。。一般用来做杂交的胚胎都是需要最近1个月之内的是吧？

⑼个人觉得你的鱼消化有点不够，那个全身棕色的情况我见过，建议你延长一下预杂交的时间，然后增加探针浓度做一下看看。 ⑽

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